棉花BFT基因的全基因組分析

張亭亭，劉慧，桑娜，馬斌，黃先忠

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/特色植物基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003)

開花是高等植物體內(nèi)復(fù)雜的生理現(xiàn)象，合適的開花轉(zhuǎn)變(floral transition)時(shí)機(jī)是影響植物產(chǎn)量的重要因素之一，植物從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變往往受到LEAFY(LFY)、FLOWERINGLOCUSC(FLC)、SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1(SOC1)等多種遺傳因子的調(diào)控[1]。廣泛存在于在植物體內(nèi)的磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(Phosphatidyl ethanolamine-binding proteins,PEBP)基因家族在植物開花轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，該家族基因目前已在單子葉植物玉米(Zeamays)[2]、大麥(Hordeumvulgare)[3]及雙子葉植物金魚草(Antirrhinummajus)[4]、番茄(Solanumlycopersicum)[5]、橡膠樹(Heveabrasiliensis)[6]及獼猴桃(Actinidiachinensis)[7]等多個(gè)物種中發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。研究表明，植物PEBP基因家族成員分為3大亞組，分別為FLOWERINGLOCUST(FT)-like，TERMINALFLOWER1(TFL1)-like和MOTHEROFFTANDTFL1(MFT)-like，其中FT/TFL1亞組基因在開花調(diào)控過程中起著主導(dǎo)作用。

在模式植物擬南芥中，PEBP家族成員與bZIP家族中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子FD之間相互作用形成復(fù)合體共同調(diào)控下游開花時(shí)間相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)營養(yǎng)分生組織向生殖分生組織的轉(zhuǎn)變。其中，開花促進(jìn)因子FT于葉片韌皮部伴胞細(xì)胞中合成，隨后運(yùn)輸至頂端分生組織(Shoot apical meristems,SAM)，在此與FD相互作用形成異源二聚體，進(jìn)而上調(diào)下游開花調(diào)節(jié)因子SOC1和花分生組織特性基因APETALA1(AP1)的表達(dá)，從而促進(jìn)開花[8]。然而，與擬南芥FT氨基酸序列同源性超過98%的TFL1，卻發(fā)揮著截然相反的生理功能，其通過同F(xiàn)T競爭結(jié)合FD蛋白，延長植株的營養(yǎng)生長階段，進(jìn)而延遲開花[9]；同時(shí)，與金魚草CENTRORADIALIS蛋白具有同源性的ATC，也通過與FD相互作用抑制下游AP1基因的表達(dá)[10]。水稻中發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)開花轉(zhuǎn)變的成花素激活復(fù)合體(Florigen-activation complex,FAC)模型，由水稻FT同源蛋白Hd3a、細(xì)胞質(zhì)中的14-3-3蛋白和FD同源蛋白OsFD1在細(xì)胞核中結(jié)合形成六聚體，誘導(dǎo)水稻AP1同源基因OsMADS15的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致開花。與擬南芥TFL1相似的是，水稻TFL1同源蛋白R(shí)ICE CENTRORADIALIS (RCN)同樣通過與Hd3a競爭結(jié)合14-3-3蛋白來拮抗成花素活性，調(diào)節(jié)花序發(fā)育。由兩個(gè)RCNs，一個(gè)14-3-3二聚體和一個(gè)OsFD1二聚體組成的六聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物命名為成花抑制復(fù)合物(Florigen-repression complex,FRC)。通過調(diào)節(jié)FAC和FRC之間的平衡可優(yōu)化花序發(fā)育，為提高作物產(chǎn)量做出一定貢獻(xiàn)[11]。

此外，F(xiàn)T/TFL1亞家族的另一成員BROTHEROFFTANDTFL1(BFT)也是開花抑制因子，其在花序分生組織發(fā)育過程中具有TFL1基因類似活性，與TFL1存在功能冗余現(xiàn)象[12]。在擬南芥中，AtBFT過表達(dá)植株表型與AtTFL1過表達(dá)株系表型非常相似，且能誘導(dǎo)下游LFY和AP1基因下調(diào)表達(dá)，最終導(dǎo)致擬南芥延遲開花，并表現(xiàn)出嚴(yán)重的花缺陷(晚花且緊湊的花序被鋸齒狀葉片包圍)；在tfl1突變體早花背景下，AtBFT過表達(dá)未能挽救其早花表型，但可延遲tfl1突變體背景下初級(jí)花序的形成和腋花的發(fā)育[13]。而獼猴桃BFT同源基因AcBFT通過異位表達(dá)擬南芥，發(fā)現(xiàn)其也具有推遲擬南芥開花，影響花序結(jié)構(gòu)的作用[7]。同時(shí)，Chung和Yoo等發(fā)現(xiàn)擬南芥BFT基因具有不同于PEBP家族其它基因的脅迫表達(dá)模式，其在ABA、干旱和滲透等脅迫處理下均上調(diào)表達(dá)[13]；且在鹽脅迫下，擬南芥BFT通過與FT競爭結(jié)合FD轉(zhuǎn)錄因子，下調(diào)AP1基因的表達(dá)，進(jìn)而延遲高鹽脅迫下的開花模式[14]。

棉花是我國重要的傳統(tǒng)作物，其不但富含大量的自然纖維，且具有高質(zhì)量的油料。隨著二倍體亞洲棉(Gossypiumarboretum)、雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)和四倍體陸地棉(Gossypiumhirsutum)、海島棉(Gossypiumbarbadense)基因組測序工作的相繼完成，科學(xué)家們加快了棉花功能基因組學(xué)的研究。近期研究發(fā)現(xiàn)，棉花FT/TFL1/MFT基因在開花調(diào)控中具有擬南芥同源基因相似的功能，且其編碼蛋白與FD之間存在相互作用[15-19]；北德克薩斯大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)棉花BFT基因也具有AtBFT基因相似的晚花功能，其中，GhBFT-L2比GhBFT-L1晚花程度更強(qiáng)，且在Attfl1-14突變體早花背景下，GhBFT-L2基因可挽救其早花表型，并其編碼蛋白在酵母細(xì)胞中與GhFD蛋白同源的GrFD互作[17]。但是，對(duì)于陸地棉GhBFT是否與本體GhFD蛋白之間存在直接相互作用，是否具有擬南芥AtBFT基因參與鹽等逆境脅迫響應(yīng)的能力，關(guān)于這些問題目前均還不太清楚。本研究基于最近更新的棉花基因組數(shù)據(jù)庫，對(duì)棉花BFT基因進(jìn)行了全基因組鑒定，采用qRT-PCR技術(shù)檢測了GhBFT1和GhBFT2基因在陸地棉各組織中的表達(dá)情況及是否響應(yīng)ABA、NaCl、高低溫及干旱脅迫，利用酵母雙雜交(Yeast Two-Hybrid,Y2H)和雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(Bimolecular Fluorescent Complimentary,BiFC)技術(shù)篩選與GhBFT1和GhBFT2互作的GhFD蛋白，以期通過分子手段探索陸地棉GhBFT與GhFD之間的關(guān)系，為進(jìn)一步研究GhBFT基因功能及后期深入解析BFT調(diào)控開花時(shí)間機(jī)制提供有利依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

本研究以新陸早33號(hào)和本氏煙草(Nicotianabenthamiana)為材料。選取籽粒飽滿的棉花種子播種于內(nèi)置蛭石的花盆中，待溫室(溫度為25 ℃，濕度為60%，光照16 h)培養(yǎng)至三葉期時(shí)，挑選長勢一致的棉花進(jìn)行組織表達(dá)取樣或脅迫處理。ABA脅迫采用終濃度為100 μmol·L-1的ABA溶液噴灑棉花所有葉表面；干旱、鹽脅迫則分別采用15% PEG 6000和150 mmol·L-1NaCl溶液澆灌棉花，并保證澆灌透水；高溫、低溫脅迫則是通過40 ℃和4 ℃植物培養(yǎng)箱模擬處理，培養(yǎng)條件同溫室。實(shí)驗(yàn)中每一組處理均為3個(gè)重復(fù)，待處理0、3、12和24 h時(shí)分別取樣。組織表達(dá)所用樣品根、莖、葉和SAM均在棉花三葉期時(shí)采集，花樣品則在棉花開花當(dāng)天整朵采集，并放于-80 ℃保存。

1.1.2 載體和菌株

中間載體pMD19-T載體、酵母雙雜交載體pGADT7 (AD)和pGBKT7 (BD)均購自大連寶生物工程有限公司(Takara)；雙分子熒光互補(bǔ)載體nYFP和cYFP載體由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所傅向東教授饋贈(zèng)；大腸桿菌DH5α，農(nóng)桿菌GV3101菌株，酵母AH109菌種和pGBKT7-GhFD (AD-GhFD)菌液均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方法

1.2.1 棉花BFT亞家族基因成員的全基因組分析

基于最新染色體水平組裝的四倍體陸地棉(TM-1)和海島棉(Hai7124)及二倍體亞洲棉和雷蒙德氏棉的全基因組數(shù)據(jù)庫[20-22]，以模式植物擬南芥AtBFT (AT5G62040)氨基酸序列為Query，利用TBtools軟件的Blast工具進(jìn)行比對(duì)分析。保留相似性大于70%的氨基酸序列，并去除重復(fù)后，在Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.sanger.ac.uk/)中檢查其是否含有PEBP家族特有的保守結(jié)構(gòu)域(PF01161)。

1.2.2 BFT蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

以擬南芥AtBFT氨基酸序列為Query，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和PLAZA數(shù)據(jù)庫(https://bioinformatics.psb.ugent.be/plaza/)查找BFT氨基酸序列，將獲得的琴葉擬南芥(Arabidopsislyrata)、薺菜(Capsellarubella)、蕪菁(Brassicarapa)、甘藍(lán)(Brassicaoleracea)、醉蝶花(Tarenayahassleriana)、大豆(Glycinemax)、獼猴桃和擬南芥中的BFT同源氨基酸序列同鑒定得到的棉花BFT氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，并采用MEGA 7.0軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)置Bootstrap值為1 000。

1.2.3BFT基因結(jié)構(gòu)和特征分析

利用ClustalX軟件對(duì)獲得的22個(gè)BFT氨基酸序列進(jìn)行完全比對(duì)分析，分析結(jié)果采用MegAlian軟件可視化；MEME在線網(wǎng)站(https://www.meme-suite.org/)分析不同物種BFT氨基酸序列的保守基序位置和數(shù)目。PLAZA數(shù)據(jù)庫下載對(duì)應(yīng)各物種的GFF3文件，利用DOG 2.0 (https://www.dog.biocuckoo.org/)繪制各物種BFT基因結(jié)構(gòu)模型。

1.2.4GhBFT1和GhBFT2基因表達(dá)特征分析

Premier 3在線網(wǎng)站(http://frodo.wi.mit.edu/)設(shè)計(jì)GhBFT1(GH_D08G1170)和GhBFT2(GH_D11G0099)基因的qRT-PCR引物(表1)。采用Takara公司的植物多糖多酚RNA提取試劑盒進(jìn)行棉花樣品總RNA提取，超微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000c,Thermo)測定各樣品RNA濃度并定量反轉(zhuǎn)錄RNA量為300 ng，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega)合成cDNA第一鏈。利用美國ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Life Technologies,CA,USA)進(jìn)行GhBFT基因表達(dá)量檢測，根據(jù)ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix (Without ROX)試劑盒(Vazyme)，設(shè)置反應(yīng)體系為10.0 μL，其中cDNA為2.0 μL，上下游引物均為0.2 μL，5.0 μL 的2 × ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix以及2.6 μL的ddH2O。對(duì)得到的組織表達(dá)和脅迫表達(dá)3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別采用2-△Ct和2-△△Ct法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，并利用SPSS 23軟件分析顯著性差異。

1.2.5 基因克隆及載體構(gòu)建

利用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)GhBFT1和GhBFT2基因克隆引物，并結(jié)合相應(yīng)載體圖譜添加酶切位點(diǎn)，最后送去北京六合華大基因科技有限公司合成引物(表1)。以棉花葉組織cDNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因GhBFT1和GhBFT2，其反應(yīng)體系為20 μL，其中高保真Ex Taq 0.2 μL，其Buffer 2 μL；dNTP 2 μL、F/R Primer均為0.5 μL，cDNA模板為2 μL、ddH2O為12.8 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。Takara公司凝膠回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物，并將其回收產(chǎn)物連接pMD19-T載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并通過抗性篩選及測序，保留驗(yàn)證正確的克隆質(zhì)粒，并分別連接pGBKT7酵母載體、熒光互補(bǔ)載體nYFP和cYFP表達(dá)終載體。通過酶切和PCR驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒保留用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 Y2H驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)室前期已克隆了陸地棉中GhFD1、GhFD2、GhFD3和GhFD4基因，并構(gòu)建了相應(yīng)的獵物載體AD-GhFD[23]。本文構(gòu)建了誘餌載體pGBKT7-GhBFT1 (BD-GhBFT1)和pGBKT7-GhBFT2 (BD-GhBFT2)，方法同1.2.5。利用DMSO改變細(xì)胞膜通透性制備AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞，并采用聚乙二醇/醋酸鋰(PEG/LiAc)誘導(dǎo)法，將BD-GhBFT、AD-GhFD轉(zhuǎn)化酵母AH109進(jìn)行毒性、自激活和蛋白互作檢測，同時(shí)以AD和BD空載設(shè)為對(duì)照，將其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物均勻涂布于二缺平板(SD/-Leu/-Trp)和四缺平板(SD/-Ade-His-Leu-Trp)。根據(jù)菌落的生長情況判定蛋白之間的互作情況。

1.2.7 BiFC分析

構(gòu)建好的熒光互補(bǔ)表達(dá)載體nYFP-GhBFT和cYFP-GhFD分別轉(zhuǎn)化GV3101農(nóng)桿菌株，并將驗(yàn)證正確的含有目的重組質(zhì)粒的菌液于28 ℃，200 r·min-1條件下擴(kuò)大培養(yǎng)2 d后，于5 000 r·min-1室溫條件下收集菌體；用現(xiàn)配的侵染液(10 mmol·L-1MES,150 μmol·L-1乙酰丁香酮，10 mmol·L-1MgCl2)懸浮菌體，并放于28 ℃搖床培養(yǎng)至菌液OD600為0.6～0.8左右；注射菌液則是將含有nYFP-GhBFT和cYFP-GhFD的侵染液1∶1等體積混合，選擇25 ℃條件下生長兩周左右的生長健康的的煙草進(jìn)行葉片注射，同時(shí)做好標(biāo)記；注射2 d后裁剪注射周圍1 cm2左右的煙草置于激光共聚焦顯微鏡(LSM510 Meta,Germany)下觀察熒光強(qiáng)度。

表1 本研究所用引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花BFT亞家族基因成員鑒定及進(jìn)化分析

基于棉花最新全基因組數(shù)據(jù)庫，共鑒定了12個(gè)BFT基因(表2)，其中二倍體亞洲棉和雷蒙德氏棉中均發(fā)現(xiàn)2個(gè)BFT基因，分別為GaBFT(GaBFT1;GaBFT2)和GrBFT(GrBFT1;GrBFT2)；異源四倍體陸地棉和海島棉中均有4個(gè)BFT基因，分別為GhBFT(GhBFT1-A;GhBFT1-D;GhBFT2-A;GhBFT2-D)和GbBFT(GbBFT1-A;GbBFT1-D;GbBFT2-A;GbBFT2-D)，其中2個(gè)GhBFT和GbBFT來自A供體亞洲棉，另2個(gè)來自D供體雷蒙德氏棉。

表2 棉花BFT基因信息

棉花BFT氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)：來源于四倍體棉花的BFT-A (GhBFT1-A,GbBFT1-A;GhBFT2-A,GbBFT2-A)分別與亞洲棉的BFT (GaBFT1;GaBFT2)親緣性更相近；陸地棉和海島棉D(zhuǎn)供體BFT (GhBFT1-D,GbBFT1-D;GhBFT2-D,GbBFT2-D)分別與來源于雷蒙德氏棉的BFT(GaBFT1;GaBFT2)氨基酸序列親緣關(guān)系更近(圖1)，這進(jìn)一步證實(shí)了異源四倍體陸地棉和海島棉是由二倍體亞洲棉和雷蒙德氏棉雜交而來這一說法[22]，且間接說明棉花在進(jìn)化過程中確實(shí)發(fā)生了多倍化事件。物種間BFT同源蛋白進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，同屬于十字花科的擬南芥、琴葉擬南芥、薺菜、蕪菁和甘藍(lán)BFT蛋白位于同一進(jìn)化分支，而與棉屬的BFT蛋白親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；棉屬BFT蛋白與獼猴桃劃分為同一大類(圖1)，這表明兩者在進(jìn)化關(guān)系上要比十字花科與棉屬的關(guān)系更近。

圖1 棉花與其它植物BFT蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.2 棉花BFT基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

在物種進(jìn)化過程中，基因結(jié)構(gòu)常常伴隨著內(nèi)含子的獲得或丟失等一系列的變化[24]。進(jìn)一步分析不同物種BFT基因結(jié)構(gòu)和編碼蛋白保守基序，發(fā)現(xiàn)來源于不同物種的BFT蛋白均具有相同的保守基序，且具有一致的基序排列順序(圖2 A)：3-5-1-4-2。BFT基因結(jié)構(gòu)顯示，不同物種中BFT基因的外顯子和內(nèi)含子大小間存在一定的差異，但卻具有相似的基因結(jié)構(gòu)，均含有4個(gè)外顯子，且1號(hào)和4號(hào)外顯子相對(duì)較大。其中，棉花中12個(gè)BFT基因結(jié)構(gòu)特征基本一致，擁有大小相似的外顯子和內(nèi)含子(圖2 B)，說明在進(jìn)化過程中不同物種BFT基因開放閱讀框大小發(fā)生了變化，但其具有編碼意義的外顯子數(shù)目和特征卻保持著高度的一致。然而，獼猴桃AcBFT2和AcBFT2基因內(nèi)含子大小明顯大于其它BFT同源基因，這可能與獼猴桃在進(jìn)化過程中發(fā)生兩次全基因組復(fù)制事件有關(guān)，導(dǎo)致AcBFT發(fā)生了突變，獲得了不同于其它物種BFT同源基因調(diào)控休眠芽生長的功能相關(guān)[7]。

圖2 棉花與其它物種BFT基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

多重序列比對(duì)結(jié)果顯示，不同物種BFT氨基酸序列間相似性很高，均含有PEBP基因家族典型的保守結(jié)構(gòu)域D-P-D-x-P和G-x-H-R；其次，我們發(fā)現(xiàn)了4處棉花BFT蛋白特異保守位點(diǎn)，分別為Val4(V)、Pro5(P)、Thr28(T)和Ala46(A)；而棉花BFT1和BFT2間存在多處突變位點(diǎn)(圖3)。綜上，通過分析BFT基因結(jié)構(gòu)、蛋白保守基序及序列特征，我們發(fā)現(xiàn)植物BFT基因具有一定的保守性，預(yù)示其可能具有相似的功能。

2.3 陸地棉GhBFT基因的組織表達(dá)特征及不同脅迫下的表達(dá)模式分析(圖4)

不同物種間BFT基因結(jié)構(gòu)和編碼蛋白保守基序均高度相似，是否說明這些物種BFT基因間存在遺傳相似性，棉花BFT是否也具有擬南芥BFT響應(yīng)鹽、干旱等脅迫的特性？

每個(gè)處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 23軟件進(jìn)行單因素方差分析，并采用Duncan法進(jìn)行樣本間差異顯著性分析，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

為深入了解陸地棉GhBFT1和GhBFT2基因組織表達(dá)特征及是否響應(yīng)逆境脅迫，采用qRT-PCR進(jìn)行了表達(dá)檢測，結(jié)果顯示，GhBFT1和GhBFT2基因均在陸地棉葉組織中表達(dá)量最高，花中次之，這與擬南芥BFT基因在蓮座葉、莖生葉及花中高表達(dá)的特征相似[17]；其次，GhBFT1基因在各組織中的表達(dá)量均顯著高于GhBFT2基因(圖4A)。脅迫誘導(dǎo)顯示，GhBFT1和GhBFT2基因均不同程度地響應(yīng)鹽、干旱、高低溫和ABA脅迫。150 mmol·L-1NaCl脅迫下，GhBFT1和GhBFT2基因均隨著脅迫時(shí)間的增加呈先增高后降低的表達(dá)趨勢，其中GhBFT1在脅迫12 h時(shí)表達(dá)量最高，且與GhBFT2基因相比存在極顯著差異(圖4B)；干旱脅迫下，GhBFT1和GhBFT2基因表達(dá)量大體呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，均在脅迫24 h時(shí)表達(dá)量最高(圖4C)；高溫脅迫下，GhBFT1基因表達(dá)量隨著脅迫時(shí)間的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，而GhBFT2隨著脅迫時(shí)間呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(圖4D)；低溫脅迫下，GhBFT1和GhBFT2基因表達(dá)趨勢與鹽脅迫下的相同，且同樣在脅迫12 h時(shí)表達(dá)量最高(圖4E)；ABA脅迫下，GhBFT1和GhBFT2基因的表達(dá)趨勢與干旱脅迫大致相同，且在脅迫12 h和24 h時(shí)，GhBFT1與GhBFT2基因間表達(dá)量存在顯著性差異(圖4F)。

2.4 GhBFT蛋白與陸地棉4個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子FD的Y2H分析

已有研究報(bào)道，在模式植物擬南芥SAM中，AtBFT通過與開花促進(jìn)因子AtFT競爭結(jié)合bZIP轉(zhuǎn)錄因子FD，形成復(fù)合物共同調(diào)控下游開花基因的表達(dá)[14]。我們團(tuán)隊(duì)先前鑒定了4個(gè)GhFD基因[23]，因而我們想探索GhBFT蛋白與不同GhFD蛋白之間是否能相互作用，采用Y2H技術(shù)進(jìn)行了蛋白互作探究。結(jié)果顯示，獵物載體AD-GhFD和誘餌載體BD-GhBFT共轉(zhuǎn)后的酵母既能在二缺(SD/-Trp/-Leu)培養(yǎng)基中生長，也能生長于四缺(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)培養(yǎng)基，說明在酵母中GhBFT1和GhBFT2蛋白與陸地棉中GhFD1，GhFD2，GhFD3和GhFD4蛋白在酵母細(xì)胞中直接互作(圖5)。

100代表將GhBFT與GhFD共轉(zhuǎn)后的酵母母液，10-1、10-2及10-3分別代表將酵母母液進(jìn)行梯度稀釋1倍、2倍和3倍。

2.5 GhBFT蛋白與陸地棉4個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子FD的BiFC分析

采用BiFC技術(shù)，再次驗(yàn)證GhBFT1和GhBFT2蛋白與4個(gè)GhFD蛋白之間是否存在直接相互作用。將含有GhBFT和GhFD目的片段菌液分別共轉(zhuǎn)煙草葉，發(fā)現(xiàn)其注射葉背面細(xì)胞內(nèi)均有熒光信號(hào)(圖6)。由此推斷，GhBFT1和GhBFT2分別與GhFD1、GhFD2、GhFD3和GhFD4蛋白在煙草細(xì)胞中也發(fā)生直接相互作用。

YFP為黃色熒光蛋白，Bright表示明視野，Merge表示明視野與熒光下視野的整合圖；A—GhBFT1與GhFD蛋白互作分析；B—GhBFT2與GhFD蛋白互作分析。

3 討論

隨著地球自然地理環(huán)境的變遷，植物界經(jīng)歷了從低級(jí)向高級(jí)、簡單到復(fù)雜、水生向陸生的復(fù)雜發(fā)展歷程，共出現(xiàn)了藻類、苔蘚、蕨類、裸子植物及被子植物五大植物時(shí)代。在進(jìn)化期間，以被子植物為主的一些物種為適應(yīng)多變的環(huán)境壓力，植物體內(nèi)往往會(huì)發(fā)生全基因組復(fù)制(WGD)或小規(guī)模復(fù)制(SSD)產(chǎn)生的的基因復(fù)制事件，科學(xué)家們認(rèn)為這一行為產(chǎn)生的復(fù)制基因通常會(huì)進(jìn)化出不同的功能[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，我國重要的經(jīng)濟(jì)作物棉花在進(jìn)化過程中發(fā)生了多倍體化事件，其中異源四倍體陸地棉和海島棉是由二倍體亞洲棉和雷蒙德氏棉種間雜交而來[20-22]。本研究基于最近重新測序及組裝的棉花全基因組數(shù)據(jù)，從中共鑒定了12個(gè)BFT基因，其中二倍體亞洲棉和雷蒙德氏棉中各有2個(gè)BFT基因；異源四倍體陸地棉和海島棉中均有4個(gè)BFT基因，是二倍體數(shù)目的2倍，間接說明棉花在進(jìn)化過程中確實(shí)發(fā)生了多倍化事件。其次，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析進(jìn)一步驗(yàn)證了這一說法，來源于四倍體棉花的BFT-A氨基酸序列分別與二倍體亞洲棉BFT氨基酸序列進(jìn)化關(guān)系最近，四倍體BFT-D氨基酸序列分別與雷蒙德氏棉BFT氨基酸序列親緣性更近。通過對(duì)棉花BFT氨基酸序列的初步分析，為二倍體亞洲棉和雷蒙德氏棉是四倍體陸地棉和海島棉親本這一說法提供了理論支撐。

將棉花BFT氨基酸序列與擬南芥等其它物種BFT氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，不同物種間BFT氨基酸序列相似性很高，均含有PEBP基因家族典型的保守結(jié)構(gòu)域：D-P-D-x-P和G-x-H-R；且具有相同的基因結(jié)構(gòu)特征(1、4號(hào)外顯子較大)和保守基序類型。其次，我們發(fā)現(xiàn)棉花BFT氨基酸序列具有Val4 (V)、Pro5 (P)、Thr28 (T)和Ala46 (A)等特異保守位點(diǎn)；同時(shí)，棉花BFT1和BFT2氨基酸序列間存在多處突變位點(diǎn)(圖3)。由此猜測，不同物種在進(jìn)化過程中其BFT同源蛋白可能會(huì)發(fā)生長度或個(gè)別氨基酸突變的現(xiàn)象，但其基因結(jié)構(gòu)、特異保守結(jié)構(gòu)域和保守基序保持不變，說明BFT蛋白在進(jìn)化過程中具有一定的保守性。

不同物種的BFT氨基酸序列間存在高度的相似性，且具有一定的保守性，是否意味著不同物種BFT基因間具有一定的遺傳相似性。目前，擬南芥、獼猴桃及棉花BFT同源基因功能研究發(fā)現(xiàn)，其同源基因間具有相似的功能，均通過增加蓮座葉數(shù)目和推遲抽薹時(shí)間來延遲開花[7,14,17]。而擬南芥BFT在ABA、干旱和滲透脅迫處理下均上調(diào)表達(dá)；FT在鹽、滲透和熱脅迫條件下都有微弱的下調(diào)表達(dá)；TSF的表達(dá)受寒冷和干旱條件的顯著誘導(dǎo)；而ATC和TFL1基因在這些脅迫下卻無明顯的表達(dá)變化[13]?？傮w而言，F(xiàn)T/TFL1家族沒有一個(gè)基因表現(xiàn)出與BFT相似的脅迫表達(dá)模式。BFT不同于FT/TFL1家族其它基因的脅迫表達(dá)模式，表明其可能參與逆境脅迫，并具有不同的功能。而Ryu et al.(2014)等的報(bào)道更加證實(shí)了這一說法，擬南芥BFT基因提供了一種確保在不利脅迫條件下繁殖成功的適應(yīng)性策略。其在鹽脅迫下作為開花抑制因子存在，通過與FT競爭結(jié)合FD轉(zhuǎn)錄因子，下調(diào)AP1基因的表達(dá)進(jìn)而延遲高鹽脅迫下的開花模式，進(jìn)一步說明BFT基因可能與脅迫下的開花調(diào)控有關(guān)[14]。

棉花GhBFTs基因過表達(dá)擬南芥確實(shí)具有延遲植株開花的能力[17]，但其是否也具有響應(yīng)干旱等脅迫的能力，是否也能與FD蛋白結(jié)合調(diào)控開花？我們抱著這樣的疑問，采用qRT-PCR定量分析GhBFT1和GhBFT2基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)其與擬南芥BFT基因組織表達(dá)特征相似：在葉片和花中高表達(dá)；且GhBFT1和GhBFT2基因響應(yīng)鹽脅迫，同時(shí)也不同程度的響應(yīng)干旱、ABA及高低溫脅迫；Y2H和BiFC實(shí)驗(yàn)也證明了GhBFT1和GhBFT2蛋白與GhFD1、GhFD2、GhFD3和GhFD4蛋白均可直接相互作用。顯然，陸地棉GhBFT1和GhBFT2基因的組織表達(dá)及脅迫表達(dá)特征與擬南芥BFT基因非常相似，很有可能陸地棉GhBFT1和GhBFT2基因也具有鹽脅迫及其它干旱等脅迫下調(diào)控開花轉(zhuǎn)變的功能。本研究結(jié)果為后期進(jìn)一步探討GhBFT-like是否參與脅迫下調(diào)控開花模式提供一定的理論基礎(chǔ)，為研究該基因功能提高參考價(jià)值。然而，棉花BFT基因具有類似于擬南芥AtBFT基因的功能，是否同樣具有鹽脅迫下或其它脅迫下參與開花調(diào)控的功能，還需進(jìn)一步研究。