宮頸癌細(xì)胞中RNA干擾SNX10基因?qū)?xì)胞增殖和凋亡影響的研究

張春賀，付少偉，王芳，王露月，者湘漪,，李洪濤，李冬妹，潘澤民*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子832002；2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)教研室，新疆 石河子 832002)

宮頸癌在女性最常見的癌癥中排名第二，它也是不發(fā)達(dá)地區(qū)女性因癌癥死亡的主要原因之一[1]。新疆是宮頸癌的高發(fā)地區(qū)[2]。流行病學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)不同類型的HPV顯示了不同的致癌潛力和生物活性，也有一定的地區(qū)性。地區(qū)差異性與宿主的人類白細(xì)胞抗原(HLA)的多態(tài)性相關(guān)[3]。宮頸癌是高度惡性癌癥，易于轉(zhuǎn)移和侵襲，并且預(yù)后很差。早期通常沒有明顯的癥狀和體征，容易忽視和漏診。即使宮頸癌的診斷技術(shù)和治療策略已經(jīng)得以提升，但宮頸癌的死亡率依然很高，腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致宮頸癌患者死亡的主要原因[4]。因此，全面了解宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對宮頸癌的預(yù)防和治療具有重大的意義[5]。持續(xù)感染高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)是導(dǎo)致浸潤性宮頸癌的主要原因[6]。HPV預(yù)防性疫苗雖已在發(fā)達(dá)地區(qū)普及，但尚未有證據(jù)表明其終身有效，并且不能逆轉(zhuǎn)宮頸病變等級。

SNX10是分揀連接蛋白家族(sorting nexins,SNXs)中結(jié)構(gòu)最簡單的成員之一。它包括一個(gè)磷酸結(jié)構(gòu)域(PX)，并具有高度保守性。它參與分選和運(yùn)輸內(nèi)體系統(tǒng)，還涉及到正常組織發(fā)育和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡的發(fā)展[7]。通過PX結(jié)構(gòu)域，SNX10蛋白靶向內(nèi)體膜并在多種內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中發(fā)揮作用[8]。研究表明，SNX10基因在肝臟、腦組織、骨髓組織、脾臟、腎臟和肺高水平表達(dá)，低水平表達(dá)于胰腺、心臟和骨骼肌。目前，對于SNX10基因甚至對SNXs基因家族的功能研究甚少，這促使我們進(jìn)一步研究探索該基因。

SNX10基因在宮頸癌中的作用還不清楚。Expression Atlas數(shù)據(jù)庫分析顯示SNX10基因在正常宮頸組織中低表達(dá)，前期通過基因芯片實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SNX10基因在宮頸癌組織中相比于正常宮頸組織中異常高表達(dá)。通過研究SNX10基因在宮頸癌組織和細(xì)胞發(fā)生和發(fā)展中的作用，對發(fā)現(xiàn)宮頸癌生物標(biāo)志物，宮頸癌的預(yù)防和治療具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

收集2017年12月—2018年9月通過手術(shù)切除或活檢獲得的77例新疆地區(qū)婦女的宮頸組織標(biāo)本，標(biāo)本包括30例正常宮頸組織標(biāo)本(來源為子宮全切除術(shù)后樣本)及33例宮頸癌標(biāo)本(來源于原發(fā)性宮頸癌切除標(biāo)本)，14例宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)組織(來源為子宮全切除后或者原發(fā)性宮頸癌切除標(biāo)本)，收集患者病史資料及HC-2檢測的HPV感染結(jié)果。所有樣本均經(jīng)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理部門確認(rèn)并獲得患者及其家屬的同意，標(biāo)本的采集得到“石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)”，患者已簽署知情同意書。

1.2 組織芯片實(shí)驗(yàn)

選取宮頸癌與正常宮頸組織HE染色病理切片及相應(yīng)的石蠟標(biāo)本，由病理部門確認(rèn)正常宮頸上皮組織及癌組織位點(diǎn)并標(biāo)記，以此方便打孔。組織芯片蠟塊在石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理系協(xié)助完成，而后進(jìn)行切片。使用免疫組織化學(xué)(IHC)對組織芯片進(jìn)行染色，用PBS作為陰性對照組的一抗進(jìn)行孵育。將一抗(SNX10抗體，博奧森)稀釋至1∶100。

1.3 細(xì)胞及試劑

實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞及試劑具體如下(表1)。

表1 細(xì)胞及試劑

1.4 ShRNA干擾片段來源

由上海吉瑪基因公司設(shè)計(jì)，具體信息如下 (表2)。

表2 ShRNA干擾片段

1.5 宮頸癌細(xì)胞的培養(yǎng)及siRNA干擾

宮頸癌SiHa和HeLa細(xì)胞在5%CO2，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM+10%FBS+1%雙抗(青-鏈霉素)，待細(xì)胞密度85%左右時(shí)用含0.25%EDTA的胰酶消化離心。待轉(zhuǎn)染細(xì)胞(SiHa和HeLa細(xì)胞)鋪6孔板，密度控制在2.5×105個(gè)細(xì)胞/孔，培養(yǎng)箱培養(yǎng)至密度達(dá)到60%～80%時(shí)，用FuGENE HD轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞共分四組：空白組(常規(guī)培養(yǎng)的SiHa和HeLa細(xì)胞)；陰性對照(NC組，轉(zhuǎn)染空載體的SiHa和HeLa細(xì)胞)；轉(zhuǎn)染Sh-SNX10-303實(shí)驗(yàn)組和Sh-SNX10-647的實(shí)驗(yàn)組，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 Western blot 實(shí)驗(yàn)

在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h裂解提蛋白(RIPA+1%PMSF),通過SDS-PAGE膠電泳分離樣品，80 V跑30 min，而后110 V繼續(xù)跑1 h；轉(zhuǎn)膜條件為濕轉(zhuǎn)80 V 1 h。常溫在5%奶粉中封閉2 h。4 ℃冰箱孵育一抗(SNX10抗體稀釋比為1∶500，1∶1 000稀釋GAPDH抗體，GAPDH為內(nèi)參)過夜。次日，洗去一抗，常溫孵育二抗(SNX10為多克隆兔抗，GAPDH為單克隆鼠抗)2小時(shí)，TBST洗膜后曝光檢測蛋白質(zhì)表達(dá)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測SNX10基因表達(dá)

收集對照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，按照RNAiso Plus(Takara)試劑說明書，冰上提取細(xì)胞總RNA樣品，無酶水溶解RNA沉淀，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后用特異引物擴(kuò)增內(nèi)參(GAPDH)和目的(SNX10)基因，并進(jìn)行對比，以GAPDH基因mRNA表達(dá)水平為標(biāo)準(zhǔn)。mRNA的表達(dá)變化根據(jù)計(jì)算2-ΔΔCT方法(CT,循環(huán)閾值)，其中ΔCT=CTSNX10-CTGAPDH，ΔΔCT=ΔCT實(shí)驗(yàn)-ΔCT對照。分別記錄內(nèi)參基因GAPDH及SNX10基因mRNA的表達(dá)水平，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，GAPDH作為參照，比較實(shí)驗(yàn)組和處理組細(xì)胞SNX10基因mRNA的表達(dá)，引物序列見表3。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表3 目的基因引物設(shè)計(jì)

1.8 CCK-8實(shí)驗(yàn)

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SiHa和HeLa細(xì)胞，將其消化離心后制成細(xì)胞懸液，96孔板中每孔加入200 μL培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按照1500個(gè)細(xì)胞每個(gè)孔加入對應(yīng)孔中，加樣孔周圍加PBS保持濕度。待細(xì)胞貼壁后每隔12小時(shí)每孔先吸去原培養(yǎng)基，然后用DMEM稀釋CCK-8試劑(90 μL DMEM+10 μL CCK-8試劑，混勻)后，每孔100 μL混合液加到96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，用酶標(biāo)儀測定吸光度(450 nm)。

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SNX10基因干擾質(zhì)粒組和NC組的SiHa和HeLa細(xì)胞。胰酶消化后，吹散細(xì)胞至細(xì)胞懸液,PBS清洗細(xì)胞后離心。采用Annexin-V抗體(FITC) 標(biāo)記和PI染料雙染法，操作步驟嚴(yán)格按照凋亡試劑盒(聯(lián)科生物科技有限公司)說明書進(jìn)行。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 20.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，組間比較均采用t檢驗(yàn)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)分析組織芯片結(jié)果，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SNX10在宮頸癌組織中高表達(dá)

33例宮頸癌組織及30例正常宮頸組織制成組織芯片并進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，染色結(jié)果由石河子大學(xué)病理學(xué)專家判定(圖1)。匯總結(jié)果顯示，30例正常宮頸組織樣本中有4例SNX10蛋白表達(dá)為陰性，24例SNX10蛋白弱陽性，2例SNX10蛋白中陽性，無強(qiáng)陽性；而在33例宮頸癌組織樣本中，SNX10蛋白表達(dá)強(qiáng)陽性的有2例，中陽性15例，弱陽性16例，無陰性病例，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)兩獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示SNX10蛋白在宮頸癌組織中高表達(dá)，差異顯著(表4)。

圖1 SNX10蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)情況

表4 SNX10免疫組化染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.2 SNX10蛋白表達(dá)與HPV感染的相關(guān)性

表5 SNX10與HPV感染的相關(guān)性

HC-2檢測所收集標(biāo)本中HPV感染情況，分析SNX10組織芯片結(jié)果與HPV感染的相關(guān)性，結(jié)果顯示SNX10的表達(dá)與HPV感染無明顯相關(guān)性(P>0.05)。SNX10在宮頸癌組織中高表達(dá)可能是受到宮頸癌病變過程中其他因素的調(diào)控(表5)。

2.3 SNX10基因在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況

根據(jù)組織芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)SNX10在宮頸癌組織中較正常宮頸組織表達(dá)水平增高；通過實(shí)驗(yàn)分析SNX10基因在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SNX10基因在宮頸癌細(xì)胞(SiHa、HeLa和C33A細(xì)胞)與HaCaT細(xì)胞(一種永生化的角質(zhì)形成細(xì)胞)相比mRNA表達(dá)水平增高。Western blot結(jié)果顯示在宮頸癌細(xì)胞中，SNX10蛋白比在HaCaT細(xì)胞中表達(dá)水平高。由此可知，SNX10基因在宮頸癌發(fā)生和發(fā)展過程中mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平上都增加(圖2)。

*:P<0.05，**：P<0.01;***:P<0.001;****:P<0.0001。

2.4 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)分析RNA干擾SNX10基因表達(dá)后細(xì)胞增殖情況

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們已經(jīng)初步判定宮頸癌發(fā)生時(shí)，SNX10基因表達(dá)水平升高，但未明確其在宮頸癌發(fā)生和發(fā)展中的作用，通過設(shè)計(jì)RNA干擾實(shí)驗(yàn)，干擾了宮頸癌細(xì)胞中SNX10基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，RNA干擾SNX10基因后，Sh-SNX10-303組和Sh-SNX10-647組細(xì)胞的增殖能力明顯低于Sh-NC組(圖3)。

圖3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測宮頸癌SiHa和HeLa細(xì)胞增殖能力

2.5 流式細(xì)胞術(shù)分析RNA干擾后對宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響

SiHa和HeLa細(xì)胞RNA干擾SNX10基因后，細(xì)胞凋亡率較對照組明顯增加，表明干擾SNX10基因后，促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞的凋亡(圖4)。

圖4 SNX10敲低后對宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

SNX10是揀選連接蛋白家族的成員，一般來說，根據(jù)不同的結(jié)構(gòu)域SNXs分為3種類型，第一種是SNXs包含Bar (Bin,amphiphysin,Rvs)結(jié)構(gòu)域，包括SNX1、2、4、5、6、7、8、9、18、30、32和33。除了PX結(jié)構(gòu)域，還有C-端的Bar結(jié)構(gòu)域，是常被研究的連接蛋白家族成員的一類。第二類是只含PX結(jié)構(gòu)域的SNXs，包括SNX3、10、11、12、16、20、21、22、24和29。它們相對簡單結(jié)構(gòu)也提升了研究的難度，只有少數(shù)成員曾被研究。除了這兩種，其他蛋白家族成員被分為第三種，包括SNX13、14、15、17、19、23、25、26、27、28和31，這些蛋白含有許多不同的結(jié)構(gòu)域，例如FERM域，PDZ域，SH3域等等。不像傳統(tǒng)的內(nèi)體調(diào)節(jié)蛋白例如Rab，SNXs通常不整體上調(diào)內(nèi)體，只調(diào)節(jié)其中不同蛋白的運(yùn)輸，這使對SNXs的研究更有意義。

課題組前期基因芯片分析顯示SNX10基因在宮頸癌組織中較正常組織高表達(dá)，通過KEGG信號通路數(shù)據(jù)庫分析SNX10基因可能參與的信號途徑，SNX10基因參與了胞吞作用、WNT配體發(fā)生和轉(zhuǎn)運(yùn)、離子通道傳輸以及刺激感應(yīng)通道的作用。SNX10與V-ATPase相互作用，V-ATPase將質(zhì)子泵入囊泡中以誘導(dǎo)其酸化。含有V-ATP酶的囊泡分布在不同的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中，并在內(nèi)吞作用，胞吐作用，蛋白質(zhì)降解等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9]。有研究表明，在結(jié)直腸癌中，SNX10基因表達(dá)影響其增殖，但其對宮頸癌增殖的影響尚不明確，這促使我們進(jìn)一步研究。

通過組織芯片實(shí)驗(yàn)及Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SNX10蛋白在宮頸癌組織及細(xì)胞中高表達(dá)，HC-2檢測HPV感染結(jié)果與SNX10蛋白質(zhì)表達(dá)相關(guān)性分析表明SNX10蛋白質(zhì)表達(dá)與HPV感染不相關(guān)。RNA干擾SNX10基因表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞的凋亡率顯著增加，增殖也被明顯的抑制。腫瘤細(xì)胞具有低凋亡率并可以迅速擴(kuò)散，這種發(fā)生和發(fā)展的特征是不可控的。早期的腫瘤會(huì)在較短的時(shí)間內(nèi)快速增殖為較大腫瘤而不易被發(fā)現(xiàn)，對周圍組織造成壓迫。因此，通過研究影響宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中增殖相關(guān)分子對防治宮頸癌有重要意義。

研究表明SNX10基因可能參與MMP9運(yùn)輸。MMPs(基質(zhì)金屬蛋白酶)是鋅依賴性蛋白酶，有助于發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)，并通過消化各種各樣的底物來調(diào)節(jié)癌癥的進(jìn)展[10]，MMP有降解細(xì)胞外基質(zhì)來提高癌癥侵襲生長率和促進(jìn)血管生成，大量證據(jù)表明MMP-9在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用。破骨細(xì)胞敲除SNX10基因后，明顯降低了JNK，p38和ERK3種蛋白的磷酸化水平[11]。SNX10蛋白的高水平表達(dá)會(huì)下調(diào)EGFR的蛋白表達(dá)。在肝癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，SNX10的mRNA在腫瘤組織中高表達(dá)，并受到miR-30 d的調(diào)控，可作為潛在的肝癌標(biāo)志物[12]。miR-30 d在不同類型癌癥中對腫瘤的發(fā)展起到的作用不同，其在膀胱癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等九種癌癥中可以高頻率擴(kuò)增，并通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移，凋亡，增殖和分化而成為重要的發(fā)病機(jī)制[13]。但其在腎癌和前列腺癌中起到與其他癌癥中不同的作用——抑制了癌癥發(fā)展[14]。SNX10基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展的作用以及是否受到miR-30 d調(diào)控還不十分清楚，其表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不明確。

本研究發(fā)現(xiàn)SNX10基因在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)水平增高，且與癌細(xì)胞的增殖和凋亡相關(guān)，不受HPV感染的影響。通過RNA干擾實(shí)驗(yàn)使SNX10基因表達(dá)水平降低，它能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖并能夠促進(jìn)其凋亡。它在宮頸癌細(xì)胞中的增殖和凋亡的機(jī)制需要進(jìn)一步地實(shí)驗(yàn)證明。本實(shí)驗(yàn)揭示了SNX10基因或許會(huì)成為宮頸癌的一個(gè)潛在的治療靶標(biāo)。