miR-21-5p調(diào)控FGF18表達對結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)行為影響

席孝忠 李國強 肖雷 姚坤厚

[摘要] 目的 探究miR-21-5p調(diào)控成纖維細(xì)胞生長因子18（FGF18）表達對結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)行為作用及機制。

方法 應(yīng)用流式細(xì)胞分選術(shù)篩選CD133+/CD44+結(jié)腸癌干細(xì)胞，并行細(xì)胞培養(yǎng)、分組及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。分別應(yīng)用CCK-8法、Transwell小室法、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力及凋亡率。應(yīng)用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測miR-21-5p及FGF18 mRNA表達水平，Western blotting檢測CD44、CD133和FGF18蛋白表達水平。

結(jié)果 FGF18為miR-21-5p靶基因。與空白（Blank）組和陰性對照（NC）組相比，miR-21-5p模擬物（miR-21-5p mimic）組CD133+/CD44+細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率顯著降低，遷移、侵襲能力顯著提升，CD44、CD133和FGF18表達水平顯著上升（F=11.23～886.10，P均<0.05）;miR-21-5p抑制劑（miR-21-5p inhibitor）組和FGF18沉默表達（si-FGF18）組細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率顯著升高，遷移、侵襲能力顯著降低，CD44、CD133和FGF18表達水平顯著下調(diào)（F=10.23～764.70，P均<0.05）;而si-FGF18+miR-21-5p mimic組與Blank組和NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均>0.05）。

結(jié)論 下調(diào)miR-21-5p表達并沉默F(xiàn)GF18表達，可抑制結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進其凋亡。

[關(guān)鍵詞] 結(jié)腸腫瘤;腫瘤干細(xì)胞;微RNAs;基因，F(xiàn)GF18;基因沉默;細(xì)胞增殖;細(xì)胞凋亡;細(xì)胞運動

[中圖分類號] R735.35;R342.2

[文獻標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）06-0886-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.191

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211229.1628.004.html;2021-12-30 14：25：24

EFFECT OF MIR-21-5P ON THE BIOLOGICAL BEHAVIOR OF COLON CANCER STEM CELLS BY REGULATING THE EXPRESSION OF FIBROBLAST GROWTH FACTOR 18

XI Xiaozhong， LI Guoqiang， XIAO Lei， YAO Kunhou

（Department of Oncological Surgery， Xinyang Central Hospital， Xinyang 464000， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of miR-21-5p on the biological behavior of colon cancer stem cells by regulating the expression of fibroblast growth factor 18 （FGF18） and related mechanism.

Methods Flow cytometry sorting was used to screen out CD133+/CD44+ colon cancer stem cells， and cell culture， grouping， and plasmid transfection were performed. CCK-8 assay， Transwell chamber assay， and flow cytometry were used to measure cell proliferation/migration/invasion abilities and cell apoptosis. Quantitative real-time PCR was used to measure the expression levels of miR-21-5p and FGF18， and Western blotting was used to measure the protein expression levels of CD44， CD133， and FGF18.

Results FGF18 was the target gene of miR-21-5p. Compared with the blank group and the negative control （NC） group， the miR-21-5p mimic group had significant reductions in the proliferation inhibition rate and apoptosis rate of CD133+/CD44+ cells and significant increases in the migration and invasion abilities of CD133+/CD44+ cells， as well as significant increases in the expression levels of CD44， CD133， and FGF18 （F=11.23-886.10，P<0.05）; the miR-21-5p inhibitor group and the si-FGF18 group had significant increases in the proliferation inhibition rate and apoptosis rate of CD133+/CD44+ cells， significant reductions in the migration and invasion abilities of CD133+/CD44+ cells， and significant reductions in the expression levels of CD44， CD133， and FGF18 （F=10.23-764.70，P<0.05）; there were no significant differences between the si-FGF18+miR-21-5p mimic group and the blank/NC groups （P>0.05）.

Conclusion Downregulating the expression of miR-21-5p and silencing the expression of FGF18 can inhibit the proliferation， migration， and invasion of colon cancer stem cells and promote their apoptosis.

[KEY WORDS]colonic neoplasms; neoplastic stem cells; microRNAs;genes， FGF18; gene silencing; cell proliferation; apoptosis; cell movement

結(jié)腸癌是消化道癌癥主要表型，其惡性程度較高[1]，病死率位居惡性腫瘤前列，且呈逐年上升趨勢，地域和人群差異顯著[2]。研究表明，腫瘤干細(xì)胞分離和鑒定極大地推動了實體腫瘤如肺癌、消化道癌、生殖系統(tǒng)癌癥等的深入研究[3-5]。細(xì)胞表面標(biāo)志物，如CD133、CD44等，已被廣泛用于各類惡性腫瘤干細(xì)胞的鑒定，如消化道癌等[6]。此外，miRNA是一類可以通過阻斷mRNA翻譯或者降解目標(biāo)mRNA，從而發(fā)揮基因抑制的內(nèi)源性非編碼的小RNA。miRNA異常表達已被證實與癌細(xì)胞增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移等關(guān)聯(lián)密切，并參與惡性腫瘤進程，其中miR-21在結(jié)腸癌中高表達[7]。本研究基于生物學(xué)預(yù)測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長因子18（FGF18）為促癌基因[8]，是miR-21-5p靶基因之一，然而有關(guān)其在結(jié)腸癌中的研究尚未見報道。基于此，本研究主要探究了miR-21-5p調(diào)控FGF18表達對結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

結(jié)腸癌HT29細(xì)胞（中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供）;胰蛋白酶（Hyclone公司，USA）;DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco公司，USA）;細(xì)胞轉(zhuǎn)染序列（上海奇駿牛物科技有限公司）;分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）;倒置光學(xué)顯微鏡（寧波舜宇光學(xué)科技（集團）有限公司）;細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Sigma公司，USA）;miR-21-5p、FGF18引物合成（Takara，大連寶生物工程有限公司）;熒光定量PCR儀（ABI，USA）;BCA試劑盒（廣州威佳生物科技有限公司）;Western blotting試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 CD133+/CD44+結(jié)腸癌干細(xì)胞分選 將結(jié)腸癌HT29細(xì)胞進行常規(guī)消化，參照既往文獻的方法[9]，采用流式細(xì)胞分選技術(shù)分離篩選CD133+/CD44+結(jié)腸癌干細(xì)胞。將分選后細(xì)胞重懸，在37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO 2條件下于6孔板中培養(yǎng)。以供后續(xù)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲及凋亡等實驗應(yīng)用。

1.2.2 CD133+/CD44+細(xì)胞培養(yǎng)、分組及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

觀察CD133+/CD44+細(xì)胞的生長狀況，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO 2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞傳代培養(yǎng)過程中，對細(xì)胞進行離心和消化處理，吹打成單個細(xì)胞。重復(fù)上述操作，離心、棄細(xì)胞沉淀，吹打混勻成單細(xì)胞懸液后，轉(zhuǎn)至6孔板相同條件繼續(xù)培養(yǎng)備用。選取傳代后3～5 d處于對數(shù)生長期的狀態(tài)良好的細(xì)胞凍存?zhèn)溆谩?/p>

取細(xì)胞分為如下6組：空白對照組（A組，Blank組）、陰性對照組（B組，NC組）、miR-21-5p模擬物組（C組，miR-21-5p mimic組）、miR-21-5p抑制劑組（D組，miR-21-5p inhibitor組）、FGF18沉默表達組（E組，si-FGF18組）、FGF18沉默表達+ miR-21-5p模擬物組（F組，si-FGF18+miR-21-5p mimic組）。按照不同分組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，具體轉(zhuǎn)染操作如下。①Blank組：不轉(zhuǎn)染任何序列。②NC組：轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒。③miR-21-5p mimic組：轉(zhuǎn)染miR-21-5p mimic質(zhì)粒。④miR-21-5p inhibitor組：轉(zhuǎn)染miR-21-5p inhibitor質(zhì)粒。⑤si-FGF18組：轉(zhuǎn)染si-FGF18質(zhì)粒。⑥si-FGF18+miR-21-5p mimic組：轉(zhuǎn)染si-FGF18和 miR-21-5p mimic質(zhì)粒。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率 細(xì)胞增殖測定根據(jù)細(xì)胞計數(shù)試劑盒說明書進行操作。取各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞混懸液加入96孔板中，每組設(shè)6個復(fù)孔，置于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每孔加入CCK8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)。采用分光光度計測量450 nm波長處吸光度值，計算細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.4 Transwell小室法檢測細(xì)胞的遷移和侵襲能力 取各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞，消化離心后重懸計數(shù)。按常規(guī)操作程序分別進行細(xì)胞遷移和侵襲實驗。細(xì)胞遷移實驗步驟如下：細(xì)胞培養(yǎng)后取Transwell小室，使用40 g/L多聚甲醛固定，5 g/L結(jié)晶紫溶液染色并拭去未遷移細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下觀察并求取平均值。細(xì)胞侵襲實驗過程中，應(yīng)用Matrigel稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室，并在37 ℃條件下將實驗樣品自然風(fēng)干，其余操作同細(xì)胞遷移實驗。比較各組細(xì)胞遷移和侵襲能力。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞于流式管，胰蛋白酶消化液處理細(xì)胞，低溫離心處理后調(diào)節(jié)細(xì)胞密度。采集細(xì)胞懸液，按照Annexin-V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明進行操作，檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測miR-21-5p表達及FGF18 mRNA表達 經(jīng)細(xì)胞RNA沉淀、洗滌、溶解和濃度測定后，分別提取各組轉(zhuǎn)染后CD133+/CD44+細(xì)胞總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，參照說明書進行。取反應(yīng)液進行熒光定量PCR，參照說明書進行操作。采用相對定量法分別計算目的基因miR-21-5p和FGF18相對于內(nèi)參照（U6）的相對表達量。

1.2.7 Western blotting檢測CD133、CD44以及FGF18蛋白表達 待細(xì)胞生長至匯合狀態(tài)（80%），收集細(xì)胞加入裂解緩沖液，離心處理后提取各組CD133+/CD44+細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)不同濃度進行定量，待樣本處理完畢后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、室溫下脫脂奶粉中置于搖床中封閉。滴加一抗兔抗人CD133、CD44和鼠抗人FGF18，4 ℃過夜，PBS洗滌，然后應(yīng)用HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體孵育（全程避光）。內(nèi)參照為GAPDH。顯影和定影后，采用Image J系統(tǒng)分析計算蛋白相對含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。計量資料數(shù)據(jù)采用±s形式表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用q檢驗。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 miR-21-5p與FGF18靶向關(guān)系

通過在線分析軟件分析顯示，F(xiàn)GF18基因與miR-21-5p序列間存在特異結(jié)合區(qū)域（圖1），確定FGF18是miR-21-5p的靶基因。這一靶向關(guān)聯(lián)為本文細(xì)胞實驗奠定理論基礎(chǔ)。

2.2 miR-21-5p調(diào)控FGF18表達對結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，與Blank組和NC組相比，miR-21-5p mimic組CD133+/CD44+細(xì)胞增殖抑制率明顯降低（F=16.28，P<0.05），miR-21-5p inhibitor組和si-FGF18組明顯升高（F=26.53、23.96，P均<0.05），si-FGF18+miR-21-5p mimic組無明顯差異（P>0.05）。而與si-FGF18組相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic組CD133+/CD44+細(xì)胞增殖抑制率下降，差異有顯著性（t=6.181，P<0.05）。見表1。

2.3 miR-21-5p調(diào)控FGF18表達對結(jié)腸癌干細(xì)胞遷移和侵襲影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，與Blank組和NC組相比，miR-21-5p mimic組CD133+/CD44+細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著升高;miR-21-5p inhibitor組和si-FGF18組細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F 遷移=11.23～19.55，F(xiàn) 侵襲=21.68～52.85，P均<0.05）;si-FGF18+miR-21-5p mimic組細(xì)胞遷移和侵襲能力無明顯差異（P均>0.05）。而與si-FGF18組細(xì)胞相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic組細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯上升（t=4.927、8.073，P均<0.05）。見圖2。

2.4 miR-21-5p調(diào)控FGF18表達對結(jié)腸癌干細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與Blank組和NC組相比，miR-21-5p mimic組CD133+/CD44+細(xì)胞早、晚期凋亡率呈下降趨勢;而miR-21-5p inhibitor組和si-FGF18組凋亡率則上升（F 早期=17.22～35.88，F(xiàn) 晚期=24.12～109.80，P均<0.05）;si-FGF18+miR-21-5p mimic組凋亡率差異無顯著性（P均>0.05）。

而與si-FGF18組相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic組CD133+/CD44+細(xì)胞早、晚期凋亡下降（t=10.73、13.47，P均<0.05）。見表1。

2.5 miR-21-5p調(diào)控FGF18表達對miR-21-5p和FGF18相對表達影響

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與Blank組和NC組相比，miR-21-5p mimic組FGF18 mRNA和miR-21-5p的表達水平均顯著上升，miR-21-5p inhibitor組FGF18 mRNA和miR-21-5p表達水平均顯著下調(diào)（F FGF18=29.44、886.10， F miR-21-5p=12.18、764.70，P均<0.05）;si-FGF18組miR-21-5p表達差異無顯著性（P>0.05），而FGF18 mRNA表達水平顯著下降（F=32.90，P<0.05）;且si-FGF18+miR-21-5p mimic組miR-21-5p表達水平顯著上升（F=509.10，P<0.05），而FGF18表達無顯著差異（P>0.05）。見表1。

2.6 miR-21-5p調(diào)控FGF18表達對CD44、CD133和FGF18蛋白表達影響

Western blotting結(jié)果顯示，與Blank組和NC組細(xì)胞相比較，miR-21-5p mimic組CD44、CD133和FGF18蛋白表達水平均顯著上升（F=109.00～551.90，P均<0.05）;miR-21-5p inhibitor組和si-FGF18組的蛋白表達水平則顯著下降（F=9.31～36.45， P均<0.05），si-FGF18+miR-21-5p mimic組的蛋白表達水平無明顯變化（P均>0.05）。與si-FGF18組相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic組CD44、CD133和FGF18表達均呈上升趨勢（t=3.253～10.18，P均<0.05）。見圖3。

3 討論

本研究首先通過生物學(xué)預(yù)測軟件確定FGF18是miR-21-5p的靶基因。進而采用細(xì)胞培養(yǎng)并構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法，探究miR-21-5p調(diào)控FGF18表達對結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。本研究選用流式細(xì)胞分選技術(shù)篩選CD133+/CD44+結(jié)腸癌干細(xì)胞的臨床意義在于，上皮來源的惡性腫瘤的發(fā)生可能與腫瘤干細(xì)胞的增殖、分化等潛能存在關(guān)聯(lián)性[10]。針對腫瘤細(xì)胞的惡性特征，既往眾多研究已發(fā)現(xiàn)腫瘤的進程可歸因于腫瘤干細(xì)胞的特征，如其可自我更新、增殖分裂等，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的耐藥性、治療失敗、癌癥復(fù)發(fā)等不良后果。腫瘤治療多采用外源性干預(yù)手段抑制此類干細(xì)胞的自我更新，從而阻斷細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，最終實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞增殖分化、轉(zhuǎn)移等[11]。作為腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志物，CD133、CD44已被證實在肝癌、骨肉瘤等中呈顯著高表達，其表達上調(diào)可能與激活下游信號通路、抑制腫瘤細(xì)胞凋亡等相關(guān)聯(lián)[12-13]。另外，miR-21-5p已被報道與人類消化道癌癥等密切相關(guān)[14-15]，并通過作用眾多的基因靶點參與腫瘤進展，為腫瘤靶向治療提供新途徑。WU等[16]研究顯示，miR-21-5p高表達可通過抑制PTEN、激活P13K/Akt信號通路、誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等機制促進食管癌發(fā)生進程。因此，作者推測miR-21-5p有可能通過特定靶基因，干預(yù)結(jié)腸癌干細(xì)胞生物學(xué)進程。FGF18作為成纖維細(xì)胞因子，屬于纖維細(xì)胞因子（FGF）家族，是典型的促癌基因。FGF家族成員在血管生成、組織細(xì)胞增殖、成纖維細(xì)胞增生等方面發(fā)揮重要作用，通過翻譯轉(zhuǎn)錄可發(fā)揮多種潛在功能[17]。FGF18在癌癥中呈高表達，如在卵巢高級漿膜癌中呈顯著高表達，促進癌癥進展[18]。

本研究結(jié)果表明，下調(diào)miR-21-5p表達和沉默F(xiàn)GF18表達后CD133+/CD44+細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率顯著提升，而遷移和侵襲能力顯著降低;而上調(diào)miR-21-5p表達結(jié)果與此相反;且在上調(diào)miR-21-5p表達基礎(chǔ)上沉默F(xiàn)GF18表達，逆轉(zhuǎn)了沉默F(xiàn)GF18表達對細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的作用。本文結(jié)果提示，miR-21-5p低表達可在結(jié)腸癌干細(xì)胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮正向作用;同時，下調(diào)miR-21-5p表達可抑制FGF18表達，進一步凸顯了對結(jié)腸癌干細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用。此外，上調(diào)miR-21-5p表達后導(dǎo)致FGF18、CD133、CD44蛋白表達水平顯著上升;而下調(diào)miR-21-5p表達，靶向抑制FGF18，上述因子的表達水平均顯著逆轉(zhuǎn)。就其機制而言，微小RNA通常通過靶基因調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后表達。我們推測其可能與FGF18為miR-21-5p靶基因，miR-21-5p通過與其3′端非翻譯區(qū)特異性結(jié)合，抑制作為促癌基因FGF18的表達水平，從而達到抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進細(xì)胞凋亡的結(jié)果。LU等[19]報道，過表達miR-21-5p可靶向15-PGDH，促進膽管癌生長。YAN等[20]亦在其研究中通過基因組微陣列數(shù)據(jù)和靶向預(yù)測miR-21-5p可靶向PIK3R1，抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲，降低PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在乳癌中發(fā)揮重要作用。本研究亦通過類似機制性探討，初步顯示miR-21-5p與其靶基因FGF18在結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞中的作用，為臨床探究結(jié)腸癌治療提供了一定的實驗依據(jù)。

綜上所述，本研究證實抑制miR-21-5p表達并沉默F(xiàn)GF18表達，可抑制結(jié)腸癌腫瘤干細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進細(xì)胞凋亡。本實驗為靶向miR-21-5p和FGF18的分子治療策略提供了實驗基礎(chǔ)。同時，本研究有待進一步的動物移植瘤實驗驗證，并佐以進一步的實驗探究抑制miR-21-5p表達對腫瘤細(xì)胞藥物敏感性以及臨床病人預(yù)后方面的影響。

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（本文編輯 于國藝）