產(chǎn)維生素K2貝萊斯芽孢桿菌ND的誘變育種及突變子快速篩選

趙長樂，湯貴祥，萬銀平，黃曉梅，張慧莉

(石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆維吾爾自治區(qū) 石河子市 832000)

維生素K2(VK2)由一個萘醌核和一條聚異戊二烯側(cè)鏈組成，是一種脂溶性黃色結(jié)晶化合物，由Doisy等[1]從腐敗魚肉中首次發(fā)現(xiàn).Bhalerao等[2]研究發(fā)現(xiàn)VK2可以用來治療帕金森綜合征等線粒體疾病.陳雪英等[3]證明VK2在絕經(jīng)后大鼠的血管鈣化過程中有重要作用.王冠等[4]發(fā)現(xiàn)VK2對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者療效顯著，且與甲狀腺激素聯(lián)合使用效果更佳.

VK2可通過化學(xué)合成[5]和微生物發(fā)酵獲得.發(fā)酵法生產(chǎn)VK2的菌種多為黃桿菌、納豆芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等[6-8].培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化[9]、誘變育種是比較常用的提高菌種產(chǎn)量的手段，黎恒等[10]利用紫外和等離子誘變，獲得一株N-乙酰-D-氨基葡萄糖提高4.1倍的解淀粉芽孢桿菌突變子.褚清龍[11]對解淀粉芽孢桿菌的原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變，獲得一株酸性α-淀粉酶的活力由105U/mL提高到267U/mL的突變子.

20世紀(jì)60年代，原生質(zhì)體融合技術(shù)開始興起，使兩親本的基因組進(jìn)行發(fā)生重組并最終獲得具有雙親優(yōu)良性狀的融合子.相較于傳統(tǒng)的育種方法，原生質(zhì)體融合技術(shù)的重組率更高、受兩親本結(jié)合的限制小，能夠打破種間遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙問題，完全無需了解兩親本菌株作用機(jī)制和遺傳物質(zhì)[12-13]，因此是一種理想的用于改良菌種生產(chǎn)能力的方法.

貝萊斯芽孢桿菌ND(BacillusvelezensisND)是本實(shí)驗(yàn)室自納豆粉中篩選得到可以生產(chǎn)VK2(MK-7)的野生型菌株，該菌株在裝有2mL發(fā)酵培養(yǎng)基的試管中靜態(tài)發(fā)酵7d，VK2產(chǎn)量為27.57mg/L，在3L發(fā)酵罐中連續(xù)發(fā)酵7d，VK2產(chǎn)量達(dá)71.72mg/L，同發(fā)酵模式下產(chǎn)量居世界前列僅次于澳大利亞學(xué)者Berenjian團(tuán)隊(duì)[14]在極限攪拌和通氣狀態(tài)下的226mg/L.本研究對貝萊斯芽孢桿菌ND利用多種誘變手段進(jìn)行誘變，以求獲得VK2產(chǎn)量進(jìn)一步提高的優(yōu)質(zhì)工業(yè)菌種，同時(shí)對貝萊斯芽孢桿菌ND進(jìn)行原生質(zhì)體制備和融合的研究為后續(xù)基因組改組提供數(shù)據(jù)支持.由于VK2的含量普遍使用高效液相色譜法(HPLC)來檢測[15-16]，雖然測定的VK2含量精度高，但是通量低、耗時(shí)長、成本高不利于快速篩選突變子，為了克服上述弊端，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了用于快速篩選VK2突變子的檢測體系.

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

菌株：BacillusvelezensisND(GenBank：MN831888).該菌株是本實(shí)驗(yàn)篩選的一株可以生產(chǎn)VK2(MK-7)的野生菌株，能在含有較高濃度甲萘醌的培養(yǎng)基中生長，革蘭氏染色和菌落形態(tài)、培養(yǎng)特性均與枯草芽孢桿菌相似.

種子培養(yǎng)基：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖10g/L、NaCl 5g/L.

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸粉18g/L、大豆蛋白胨17g/L、甘油8g/L，K2HPO43g/L，CaCl22g/L，NaCl 80g/L.

篩選培養(yǎng)基：谷氨酸鈉0.1g/L、KH2PO46g/L、K2HPO4·3H2O 14g/L、檸檬酸鈉1g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、(NH4)2SO42g/L、葡萄糖0.5g/L.

高滲緩沖液(SMM)：蔗糖0.5mol/L，MgCl2·6H2O 0.02mol/L，順丁烯二酸0.02mol/L調(diào)節(jié)pH至6.5，115℃滅菌20min.

溶菌酶溶液：用SMM配置濃度為100mg/mL，0.22μm一次性濾膜過濾除菌.

40% PEG-6000溶液：使用高滲緩沖液配制，0.22μm一次性濾膜過濾除菌.

再生培養(yǎng)基：使用SMM緩沖液代替蒸餾水的種子培養(yǎng)基，115℃滅菌20min.

1.2 方法

1.2.1 菌株的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

靜態(tài)發(fā)酵：接種單菌落于種子培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以10%(體積分?jǐn)?shù))接種于裝有2mL發(fā)酵培養(yǎng)基的試管中，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7d.

發(fā)酵罐發(fā)酵：將生長至對數(shù)期菌液，以10%(體積分?jǐn)?shù))接種于裝有1L發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中連續(xù)培養(yǎng)7d，發(fā)酵溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為500r/min，通氣量為120L/h.

1.2.2 VK2檢測方法的建立

安捷倫1100高效液相色譜分析儀對VK2精確測定，色譜柱為COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ(4.6ID×250mm),參考尉鴻飛[6]利用HPLC檢測黃桿菌中VK2的方法.

VK2標(biāo)準(zhǔn)品用異丙醇溶解稀釋為16，32，64，100mg/L，吸取200μL于96孔板中以異丙醇作對照，均3個樣品重復(fù)，用酶標(biāo)儀(Molecular Devices,SpectraMax M2)檢測其在248nm下吸光度.

1.2.3 誘變菌株的篩選方法

甲萘醌是VK2的結(jié)構(gòu)類似物，對VK2的合成有抑制作用，研究證明，甲萘醌可協(xié)助篩選高產(chǎn)的突變菌株[17]，通過早期實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化，在篩選培養(yǎng)基中添加55mg/L甲萘醌，該劑量下致死率為90%左右，既保證了菌落的數(shù)量，又具備一定的篩選壓力.

挑取單菌落于裝有種子培養(yǎng)基的96孔深孔細(xì)胞板中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，以10%接種量接種于裝有2mL發(fā)酵培養(yǎng)基的試管中進(jìn)行靜態(tài)發(fā)酵7d，發(fā)酵結(jié)束后使用湯貴祥等[18]的方法提取VK2，由于HPLC檢測VK2精確度高但通量太低，無法短時(shí)間內(nèi)對大批量誘變菌株的VK2產(chǎn)量進(jìn)行檢測，先將VK2提取液使用酶標(biāo)儀通過分光光度法測定，再將產(chǎn)量高的進(jìn)行HPLC測定，構(gòu)建了一種可快速篩選高產(chǎn)VK2突變菌株的方法.

1.2.4 原生質(zhì)體的制備及再生

原生質(zhì)體制備率及再生率公式：制備率=(A-B)/A×100%；再生率=(C-B)/(A-B)×100%.

設(shè)A：酶解前的菌懸液于種子培養(yǎng)基固體平板生長的菌落數(shù)，B：酶解后的菌懸液于種子培養(yǎng)基固體平板生長的菌落數(shù)，C：酶解后的菌懸液于再生培養(yǎng)基固體平板生長的菌落數(shù).

菌懸液制備：取對數(shù)期菌液離心并用無菌水洗滌2次，菌泥用SMM緩沖液進(jìn)行懸浮.

最佳溶菌酶濃度的選擇：加溶菌酶至菌懸液中于37℃水浴鍋中反應(yīng)30min.為探究制備體系中酶濃度對原生質(zhì)體制備和再生的影響，溶菌酶終濃度分別為0.01，0.03，0.05，0.10，0.20mg/mL.

最佳酶解溫度的選擇：加入溶菌酶于菌懸液中至終濃度為0.1mg/mL，于水浴鍋中反應(yīng)20min.為探究溫度對原生質(zhì)體制備和再生的影響，酶解溫度分別為27，32，37，42，47℃.

最佳酶解時(shí)間的選擇：加入溶菌酶于菌懸液中至終濃度為0.1mg/mL，于32℃水浴鍋中進(jìn)行反應(yīng).為探究酶解時(shí)間對原生質(zhì)體制備和再生的影響，酶解時(shí)間分別為10，20，30，40，50min.

1.2.5 原生質(zhì)體滅活

滅活率計(jì)算公式：滅活率=(滅活前在再生培養(yǎng)基平板上生長的菌落數(shù)-滅活后在再生培養(yǎng)基平板上生長的菌落數(shù))/滅活前在再生培養(yǎng)基平板上生長的菌落數(shù)×100%.

滅活就是采用某些物理或者化學(xué)的手段對原生質(zhì)體懸液進(jìn)行處理，使其失去活性，但不致死.一般經(jīng)過滅活處理后，因原生質(zhì)體內(nèi)部的部分結(jié)構(gòu)損傷，原生質(zhì)體會喪失自我修復(fù)的能力[19].本次實(shí)驗(yàn)采用熱滅活和紫外滅活，一方面，幾乎能夠省去部分或全部的標(biāo)記工作減少工作量；另一方面，可以排除雙方親本類型的再生，便于選擇需要的融合子，因而這項(xiàng)技術(shù)在微生物育種中已被廣泛使用[20].

原生質(zhì)體的熱滅活：制備好的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)移于1.5mL的EP管中，置于60℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行處理.為探究處理時(shí)間對原生質(zhì)體的滅活效果，處理時(shí)間設(shè)置為2，4，6，8，10min，根據(jù)10倍稀釋法稀釋至合適濃度后涂布于再生培養(yǎng)基平板.

原生質(zhì)體的紫外滅活：將制備好的原生質(zhì)體置于紫外燈下30cm處進(jìn)行處理.為探究紫外照射時(shí)間對原生質(zhì)體的滅活效果，照射時(shí)間設(shè)置為20，30，40，50，60，70s，根據(jù)10倍稀釋法稀釋至合適濃度后涂布于再生培養(yǎng)基平板.

1.2.6 原生質(zhì)體融合

融合頻率=融合后再生培養(yǎng)基平板上生長的菌落數(shù)/滅活前雙親原生質(zhì)體總數(shù)×100%.

分別取等量的，紫外滅活、熱滅活后的原生質(zhì)體懸液于1.5mL EP管中混合均勻，37℃，200r/min震蕩5min，后4000r/min離心5min收集菌體，立即加入1mL 40% PEG-6000來懸浮菌泥，置于37℃中，融合完成后3000r/min離心洗滌2次，最后稀釋涂布于再生培養(yǎng)基平板.為探究原生質(zhì)體最佳融合時(shí)間，融合時(shí)間分別為2，4，6，8，10min.

1.2.7 貝萊斯芽孢桿菌ND的單因素誘變

菌懸液的制備：取對數(shù)期菌液6000r/min離心5min，再用無菌水離心洗滌2次.

紫外誘變：菌懸液于7cm的平皿中攪拌狀態(tài)下照射30s，并于黑暗中冰浴1h以抑制光修復(fù)酶的活性，根據(jù)10倍稀釋法稀釋至合適濃度，并涂布于篩選培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng).為探究誘變距離對貝萊斯芽孢桿菌ND的誘變效應(yīng)，誘變距離設(shè)置為10，20，30，40，50cm.

NTG誘變：先用適量丙酮將NTG溶解，然后加入9倍體積的0.1mol/L的PBS緩沖液(pH=6)，配置成1mg/mL的母液備用，菌懸液使用0.1mol/L的PBS緩沖液(pH=6)制備.菌懸液中加入NTG母液致終濃度為100μg/mL，于37℃，200r/min下分別處理2，8，14，20，26min，誘變結(jié)束后用生理鹽水洗滌2次以終止反應(yīng).

EMS誘變：菌懸液使用0.1mol/L的PBS緩沖液(pH=6)制備，取EMS原液于菌懸液至終濃度0.15mol/L，37℃，200r/min下分別處理15，30，45，60，75，90min，誘變結(jié)束后用生理鹽水洗滌2次以終止反應(yīng).

DES誘變：菌懸液使用0.1mol/L的PBS緩沖液(pH=7.2)制備.取DES原液加2倍體積的乙醇助溶，最后加入菌懸液中至終濃度為2%，37℃，200r/min下分別處理5，10，15，20，25，30min，誘變結(jié)束后用生理鹽水洗滌2次以終止反應(yīng).

ARTP誘變：取10μL菌懸液于載片上，涂勻后轉(zhuǎn)移至操作箱進(jìn)行誘變，工作條件為：10SLM，120W，分別處理20，50，80，110，140s.誘變結(jié)束后將載片轉(zhuǎn)移至裝有1mL無菌水的EP管中振蕩1min徹底洗脫載片上的菌體，根據(jù)10倍稀釋法稀釋至合適濃度涂布于篩選培養(yǎng)基平板.

1.2.8 貝萊斯芽孢桿菌ND的復(fù)合誘變

誘變劑的復(fù)合處理常有一定的協(xié)同效應(yīng)，增強(qiáng)誘變效果，其突變率普遍比單獨(dú)處理的高[21].EMS-紫外復(fù)合誘變：菌懸液在紫外燈下50cm處照射30s，離心并用0.1mol/L的PBS緩沖液(pH=6)進(jìn)行懸浮，加EMS至終濃度為0.15mol/L，處理45min，誘變結(jié)束后用生理鹽水洗滌2次以終止反應(yīng).

LiCl-紫外復(fù)合誘變：菌懸液于紫外燈下50cm處照射30s，誘變后菌懸液涂布于含有1%，1.5%，2%，2.5%，3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))LiCl的篩選培養(yǎng)基平板上.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的發(fā)酵結(jié)果

貝萊斯芽孢桿菌野生型菌株ND在3L發(fā)酵罐中的連續(xù)發(fā)酵如圖1所示，隨著發(fā)酵的進(jìn)行發(fā)酵液中的甘油逐漸被消耗，菌體在80h前急劇增殖，80h后發(fā)酵液中菌體數(shù)量逐漸穩(wěn)定，VK2的含量(HPLC測定)始終處于增長狀態(tài)，連續(xù)發(fā)酵168h后發(fā)酵液中VK2產(chǎn)量達(dá)到71.72mg/L.

2.2 VK2濃度高通量檢測方法與HPLC方法評定

如圖2(a)所示，5個濃度梯度的VK2標(biāo)準(zhǔn)品和發(fā)酵液提取液的HPLC檢測曲線，將峰面積對VK2濃度進(jìn)行擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=33.784x，R2=0.9979可信度較高，且發(fā)酵提取的樣品經(jīng)過HPLC純化后特征峰清晰無雜峰，可用于準(zhǔn)確測定VK2濃度.

如圖2(b)所示，以VK2濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液在248nm下吸光度為縱坐標(biāo)擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.02309+7.25097×10-4x，R2=0.99824，由此我們判定分光光度法檢測VK2的含量是可行的.提取誘變菌株發(fā)酵液中的VK2，分別用HPLC和分光光度法對提取液中的VK2含量進(jìn)行檢測，如圖2(c)所示，兩種檢測方法的測定結(jié)果一致性較低，可能發(fā)酵液提取物中的雜質(zhì)干擾了VK2含量檢測的準(zhǔn)確性；當(dāng)VK2含量高于30mg/L時(shí)，特征吸收波長下的吸收值變大，相對的降低了雜質(zhì)吸收的干擾，兩種測定方法的結(jié)果存在很好的相關(guān)性(y=27.27405+3.78559x，R2=0.99301)(圖2(d)).表1列出了經(jīng)過隨機(jī)誘變獲得的部分菌株發(fā)酵提取液中的VK2含量經(jīng)HPLC和分光光度法測定的結(jié)果.每個樣品做4次重復(fù)，可以看出VK2含量經(jīng)分光光度法測定的重復(fù)性較好.綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)雖然分光光度法不能用于對發(fā)酵液提取液中的VK2濃度進(jìn)行定量檢測，但是其檢測結(jié)果與HPLC檢測結(jié)果的線性關(guān)系可以用來輔助篩選高產(chǎn)突變菌株.

表1 酶標(biāo)儀檢測與液相色譜測定發(fā)酵液中維生素K2含量Tab.1 Detection of Vitamins K2 in fermentation broth by microplate reader and liquid chromatography

2.3 貝萊斯芽孢桿菌ND原生質(zhì)體的制備與再生

2.3.1 溶菌酶濃度對原生質(zhì)體制備與再生的影響

結(jié)果如圖3(a)所示，隨著酶濃度的增大，貝萊斯芽孢桿菌ND原生質(zhì)體的制備率逐漸增大，而再生率則逐漸降低，大溶菌酶濃度超過0.1mg/L時(shí)再生率驟降，過高的酶濃度不利于原生質(zhì)體的再生[22].綜合考慮原生質(zhì)體再生率和制備率，選擇溶菌酶0.1mg/mL為原生質(zhì)體最佳制備濃度，此時(shí)再生率為8.2%，制備率為94.5%.

2.3.2 酶解溫度對原生質(zhì)體制備的影響

如圖3(b)所示，隨著處理溫度的升高，貝萊斯芽孢桿菌ND原生質(zhì)體的制備率逐漸增加，而原生質(zhì)體的再生率隨溫度先增加后減少，32℃時(shí)原生質(zhì)體的再生率最高，有研究表明隨著溫度的提高，酶解速度加快，與此同時(shí)酶也因溫度升高逐漸變性從而失活，酶反應(yīng)的最適溫度是這兩種效應(yīng)的共同結(jié)果[23].因此，綜合考慮確定酶解的最適溫度為32℃，此時(shí)原生質(zhì)體再生率為17.5%，制備率為81%.

2.3.3 酶解時(shí)間原生質(zhì)體制備的影響

結(jié)果如圖3(c)所示，隨著酶解時(shí)間的增加，貝萊斯芽孢桿菌ND原生質(zhì)體的制備率逐漸增加，而再生率逐漸降低，而再生率先增高后降低，20min時(shí)其再生率最高，而后隨著處理時(shí)間的增加再生率逐漸下降至0.1%.一般認(rèn)為酶解時(shí)間大概在20～40min之間為宜，過長處理時(shí)間反而會對原生質(zhì)體的再生產(chǎn)生不利影響[24]，可能是酶解時(shí)間過長，細(xì)胞壁降解程度增大導(dǎo)致喪失了細(xì)胞壁合成所需的引物從而不利形成新的細(xì)胞壁.因而20min為貝萊斯芽孢桿菌ND原生質(zhì)體制備最佳酶解時(shí)間，此時(shí)再生率為41.2%，制備率為92.5%.

2.4 貝萊斯芽孢桿菌ND原生質(zhì)體的滅活與融合

熱滅活主要是在高溫環(huán)境中破壞原生質(zhì)體中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及活性，結(jié)果如圖4(a)所示，隨著處理時(shí)間的增加，滅活率逐漸增加，在6min時(shí)滅活率已達(dá)到100%.

紫外滅活處理主要作用就是使細(xì)菌內(nèi)部的DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使細(xì)菌的菌體DNA損傷而失活,如圖4(b)所示，隨著時(shí)間的增加，滅活率急劇增加，處理40s時(shí)，滅活率已接近100%.

如圖4(c)所示，隨著融合時(shí)間的增加，原生質(zhì)體的融合頻率先增加，在6min時(shí)的融合頻率最高，為9.8%，隨后融合頻率下降，因?yàn)镻EG對細(xì)胞有毒害作用，隨著處理時(shí)間的延長，對原生質(zhì)體的損傷程度增加不利于原生質(zhì)體的再生.

2.5 貝萊斯芽孢桿菌ND誘變條件的確定

2.5.1 紫外誘變劑量的確定

菌液距離紫外燈越近，單位時(shí)間內(nèi)所吸收的輻射量越高.如圖5(a)所示，致死率隨誘變距離的增大逐漸降低，正突變率隨距離的增大增突變率曲線呈“U型”.誘變距離為10cm時(shí)致死率為99.99%，正突變率最高，為83.33%，30cm時(shí)致死率為78.74%，正突變率最低，為50.00%，50cm致死率為20.12%，正突變率為66.67%.因此在進(jìn)行單因素誘變時(shí)為了盡大可能獲得高產(chǎn)突變株，誘變距離選為10cm，綜合考慮在進(jìn)行復(fù)合誘變時(shí)為兼顧正突變率和足夠的存活菌體數(shù)量，誘變距離選為50cm.

2.5.2 NTG誘變劑量的確定

如圖5(b)所示，在NTG處理在2～14min時(shí)間段，致死率由81.46%逐漸增大到98.07%，而后致死率保持較為穩(wěn)定的水平不再增減，而正突變率則隨著處理時(shí)間的增加先增高再降低，14min時(shí)正突變率最高45%.因此選擇對貝萊斯芽孢桿菌ND進(jìn)行NTG誘變最佳的處理時(shí)間為14min.

2.5.3 EMS誘變劑量的確定

圖5(c)所示，致死率隨EMS處理時(shí)間的延長從3.53%逐漸增大到98.96%，正突變率曲線為先降低后升高至最大再持續(xù)降低的“馬鞍形”，處理時(shí)間在45min時(shí)正突變率達(dá)到最大為95%,此時(shí)致死率為77.7%.因此選擇對貝萊斯芽孢桿菌ND進(jìn)行EMS誘變最佳條件為45min.

2.5.4 DES誘變劑量的確定

圖5(d)所示，致死率隨DES處理時(shí)間的延長由43.88%增大到96.08%，而正突變率曲線為先先升高再降低最后繼續(xù)升高的“馬鞍形”，當(dāng)處理40min時(shí)正突變率亦是最大，為70%，致死率此時(shí)為99.92%.因此選擇對貝萊斯芽孢桿菌ND進(jìn)行DES誘變最佳條件為40min.

2.5.5 ARTP誘變劑量的確定

圖5(e)所示，致死率和正突變率曲線均隨著在ARTP處理時(shí)間的增加呈現(xiàn)出先快速增高后趨于平穩(wěn)的趨勢，當(dāng)ARTP處理140s時(shí)正突變率達(dá)到最高為40%，此時(shí)致死率為95%.因此選擇對貝萊斯芽孢桿菌ND進(jìn)行APTP誘變最佳條件為140s.

2.5.6 LiCl-紫外復(fù)合誘變劑量的確定

圖5(f)所示，隨著培養(yǎng)基中LiCl濃度由小逐漸增大，致死率由70.14%逐漸增大到99.05%，而正突變率曲線則隨著LiCl濃度的增大先增加后降低，當(dāng)LiCl濃度為2%時(shí)正突變率最大達(dá)到100%，此時(shí)致死率為85.86%.因此培養(yǎng)基中LiCl最佳添加濃度為2%.

2.5.7 誘變方法的比較

對比貝萊斯芽孢桿菌ND經(jīng)各種誘變處理的正突變率和單次誘變后VK2提高幅度.如圖6所示，菌種經(jīng)EMS單因素誘變時(shí)正突變率最高，為95%，NTG誘變正突變率最低為45%，但NTG誘變的菌株VK2產(chǎn)量提高幅度最高，為35.34%，猜測是貝萊斯芽孢桿菌ND對NTG最為敏感，NTG對其基因組的改變程度最大.另外值得注意的是，復(fù)合誘變的誘變效果相較于單因素誘變，突變菌株VK2產(chǎn)量提高幅度均較單因素誘變明顯，LiCl-紫外復(fù)合誘變的正突變率最高，單次VK2產(chǎn)量提高幅度也達(dá)到了較高的水平，可能與LiCl對細(xì)菌的修復(fù)系統(tǒng)活性的影響有關(guān)[25].

2.7 突變菌株的VK2生產(chǎn)能力驗(yàn)證

鑒于微生物對同一種誘變劑連續(xù)誘變表現(xiàn)出的“疲勞效應(yīng)”，本實(shí)驗(yàn)依次使用紫外、NTG、EMS、DES、ARTP、LiCl+紫外、EMS+紫外進(jìn)行誘變，野生型菌株經(jīng)誘變10次后共得到4株VK2生產(chǎn)能力明顯增加的菌株，分別為FU23-7(誘變7輪獲得)、A35-9、A99-9(誘變9輪獲得)、E3-10(誘變10輪獲得)，將上述4株菌株和野生菌株ND同時(shí)在裝有2mL發(fā)酵培養(yǎng)基的試管中進(jìn)行靜態(tài)發(fā)酵，7d后測定菌體干重并提取發(fā)酵液中VK2進(jìn)行HPLC檢測.如表2所示，E3-10每升發(fā)酵液中細(xì)胞干重(DCW)和VK2產(chǎn)量均較野生菌有大幅度額提高，其VK2產(chǎn)量為36.23mg/L,較野生型菌株ND 27.57mg/L提高31.42%.對E3-10進(jìn)行傳代穩(wěn)定性研究，如圖7所示，E3-10連續(xù)傳代8次后，突變菌株VK2生產(chǎn)能力穩(wěn)定.

表2 突變菌株的生產(chǎn)能力Tab.2 Production capacity of mutants

3 結(jié) 論

對發(fā)酵提取液中VK2含量的檢測，本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)酵提取液中VK2含量高于30mg/L時(shí)，可以將分光光度法通量高與HPLC檢測準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)想結(jié)合，構(gòu)建一個可以篩選突變菌株的檢測方法，大大提高了產(chǎn)VK2菌株誘變育種的工作效率.

由于單一誘變劑連續(xù)處理菌株具有“疲勞效應(yīng)”，并且國內(nèi)外鮮有對貝萊斯芽孢桿菌誘變的報(bào)道，本研究利用常見誘變劑以及新興ARTP誘變技術(shù)，對貝萊斯芽孢桿菌ND進(jìn)行了紫外、NTG、EMS、DES、ARTP、LiCl+紫外、EMS+紫外誘變，為同行對貝萊斯芽孢桿菌ND進(jìn)行誘變提供了的數(shù)據(jù)支持和經(jīng)驗(yàn)參考，并最終獲得一株VK2產(chǎn)量較野生型提高31.42%的能穩(wěn)定遺傳的突變菌株.

對貝萊斯芽孢桿菌ND原生質(zhì)體制備研究得出，溶菌酶的質(zhì)量濃度為0.1mg/mL，酶解20min，酶解溫度為32℃時(shí)原生質(zhì)體的再生效果較好，制備率也較高.滅活后的原生質(zhì)體在40% PEG-6000誘導(dǎo)下，于37℃下處理6min融合頻率最高，為貝萊斯芽孢桿菌的基因組改組提供了經(jīng)驗(yàn)參考.