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    一對稱性色素異常癥家系A(chǔ)DAR基因突變分析及產(chǎn)前診斷

    2021-01-12 03:39:56秦艷芳朱留洋王聰慧孔祥東
    皮膚性病診療學(xué)雜志 2020年6期
    關(guān)鍵詞:無義證者家系

    秦艷芳, 朱留洋, 王聰慧, 孔祥東

    (1.濮陽市油田總醫(yī)院,河南 濮陽 457001;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 鄭州 450052)

    遺傳性對稱性色素異常癥(dyschromatosis symetrica hereditaria,DSH),也稱肢端色素沉著癥,在各個種族中可見,但多見于亞洲人,其中中國和日本報道較多[1]。該病主要臨床表現(xiàn)為肢端伸側(cè)出現(xiàn)對稱性色素減退斑和色素沉著斑,尤其是手、足背部明顯,有時面部出現(xiàn)雀斑樣皮損,可不伴色素減退斑,常在嬰兒期或兒童早期出現(xiàn),青春期表現(xiàn)較為明顯,發(fā)病進程比較緩慢,病程伴隨終生[2-3]。本病一般無自覺癥狀,日曬可加重其癥狀。致病基因為ADAR基因。其組織病理學(xué)無典型改變,活檢發(fā)現(xiàn)色素減退斑處黑素缺失時,電鏡下可觀察到黑素細胞狀態(tài)異常;活檢見色素沉著斑處基底層黑素增多時,電鏡下可見黑素細胞代謝活性增高、細胞增多,黑素細胞擁有更多的樹突和大量的Ⅳ期黑素小體[4]。

    通過對不同家系及散在發(fā)病者的研究,迄今已發(fā)現(xiàn)二百多種不同的突變,包括錯義突變、無義突變、移碼突變、剪接區(qū)突變和復(fù)雜的插入/缺失突變等[5]。導(dǎo)致發(fā)病的主要是錯義突變,發(fā)生在第9~15外顯子的突變達60%以上[6]。本研究對一中國漢族DSH家系行ADAR基因突變檢測,分析其致病性及作出產(chǎn)前診斷。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料

    先證者,男,6歲,頸部、雙側(cè)關(guān)節(jié)、雙手背和足背處色素異常5年余?;颊?個月時頸部、雙側(cè)關(guān)節(jié)、雙手背和足背處出現(xiàn)散在色素減退斑和沉著斑,針尖及粟粒大小, 隨著年齡增長皮疹面積逐漸增大,并蔓延至雙前臂伸側(cè)、臀部、面部,尤其手部為重。表現(xiàn)為手足背、頸、臀部不規(guī)則色素沉著或減退斑,顏色深淺不一、部分融合成網(wǎng)狀(圖1),日曬后皮損可加重。黏膜、指(趾)甲、牙齒和毛發(fā)均正常。先證者祖母,自幼發(fā)病,未在意,生育后于外院行皮損活檢診斷為DSH,現(xiàn)已去世,資料丟失。先證者父親,1歲時發(fā)病,未予診治。先證者母親,30歲,再次妊娠,孕18周,擬通過產(chǎn)前診斷檢測胎兒是否患DSH,就診于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院遺傳與產(chǎn)前診斷中心。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(批件號:KS-2018-KY-36),患者及家屬同意并簽署知情同意書。

    圖1 先證者頸部右側(cè)臨床圖片

    1.2 方法

    1.2.1 基因組DNA提取 采集其家系10個成員(先證者及其父親、母親、姑姑、姑父、表姐、叔叔、嬸嬸、堂姐、堂哥)靜脈血各2 mL,采集先證者母親羊水20 mL,采用美國Promega公司DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

    1.2.2 高通量測序及Sanger測序驗證 利用Ion Personal Genome Machi-ne(PGMTM)測序儀進行高通量測序。目標(biāo)捕獲區(qū)平均測序深度為126 X,測序覆蓋度為98.21%,測序深度大于100 X的靶向讀長達100%,根據(jù)ACMG的遺傳變異分析指南對所有檢測到的變異進行篩選,設(shè)計引物并對突變位點進行Sanger測序,分析結(jié)果。

    1.2.3 引物設(shè)計 根據(jù)ADAR基因第二外顯子編碼區(qū)和側(cè)翼序列設(shè)計引物,均由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物:5′-CGGAAGACAGAAACTCCAC-3′,下游引物:5′-CTGCTC ACAAATCAGCCAAG-3′。

    1.2.4 PCR擴增 擴增條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s,58 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,共33個循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴增結(jié)束后,PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、純化后直接在3130XL一代測序儀(Life公司)上測序,所有測序結(jié)果與dbsnp.1000Genomes Project等數(shù)據(jù)庫相關(guān)數(shù)據(jù)進行分析比對。

    2 結(jié)果

    2.1 家系調(diào)查

    經(jīng)調(diào)查,該家系3代有3例發(fā)病(圖2),男女比例為2 ∶1,結(jié)合該家系遺傳史、典型臨床表現(xiàn)及單基因病種檢測,確診為常染色體顯性遺傳DSH。

    圖2 家系譜

    2.2 基因變異定性分析及家系胎兒產(chǎn)前診斷

    結(jié)果顯示,先證者、先證者父親、先證者母親羊水中均攜帶ADAR 基因c.613C>T(p.Q205X)位點雜合變異,而家系中其他人員未見該改變(圖3)。該突變在dbSNP數(shù)據(jù)庫、1000Genomes Project 數(shù)據(jù)庫中均未找到。使用polyphen2(http://genetics.bwh. Harvard. edu/pph2/),SIFT(http:// sift. jcvi.org/)和Mutation taster( http: // www. Mutatio -ntaster.org/)等生物信息軟件對該突變進行致病性預(yù)測,結(jié)果表明,ADAR 基因c.613C>T(p.Q205X)位點雜合變異是該家系的致病突變而不是單核苷酸多態(tài)性。

    圖3 基因測序結(jié)果Fig.3 Gene sequencing results.

    3 討論

    隨著DSRAD/ADAR基因確定為DSH的致病基因,對于不同家系致病基因突變位點的檢測已成為研究DSH的一個熱點。ADAR基因總長30 kb,有15個外顯子,可編碼1 226個氨基酸[7]。ADAR也稱雙鏈RNA特異性腺苷脫氨酶,該酶選擇性作用于mRNA前體,將相應(yīng)位點上腺嘌呤核苷(A)脫氨基轉(zhuǎn)換成次黃嘌呤核苷(I)[8]。含有2個腺苷脫氨基酶Zalpha區(qū)域、3個ds-RNA結(jié)合區(qū)域和1個脫氨基區(qū)域,分別對應(yīng)于外顯子2、外顯子2-7和外顯子9-15[9-10]。該基因不但將mRNA前體特異位點的A編輯為I,還可編輯雙鏈RNA中約40%~50%的An41[11]。彭琛等[7]對一DSH 并發(fā)銀屑病家族進行基因檢測,發(fā)現(xiàn)先證者及家系中其他患者ADAR1 基因均存在第8外顯子突變,家系中非患病者及無家系關(guān)系的對照組均未發(fā)現(xiàn)該突變。突變 c.2745_2746del CT(p.D582X),即在第 8 外顯子中第 2 745~2 746 位堿基C及堿基T缺失,由于框移突變造成第582位密碼子由TCT變成TGA,終止密碼子提前出現(xiàn),導(dǎo)致其后12個氨基酸缺失,酶的催化功能受損,引起DSH的發(fā)生。

    DSH是一種常染色體顯性遺傳病,但也存在散發(fā)病例[12]。曾榮等[5]提取一家系中2例DSH患者外周血DNA,以基因組DNA為模板擴增出PCR產(chǎn)物,并純化后測序,將患者ADAR1基因全部編碼區(qū)測序結(jié)果比對數(shù)據(jù)庫的序列,結(jié)果顯示,2例患者ADAR1基因錯義突變(c.662C>T),引起ADAR1基因中編碼的色氨酸(CGG)變成精氨酸(TGG),而家系中未患病及50位與本家系無關(guān)的正常人未見該改變。本研究中,該家系3代12人中3例發(fā)病,孕18周的胎兒經(jīng)檢測為確診患者,每代均有發(fā)病,遺傳方式符合常染色體顯性遺傳,無論胎兒為哪種性別,其再發(fā)風(fēng)險高達50%。

    本研究將PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與polyphen2、SIFT和 Mutation taster中相對應(yīng)的正常人ADAR基因序列進行比對,檢測到該家系中患者出現(xiàn)雜合突變,ADAR基因的第2號外顯子613位堿基胞嘧啶(C)突變成胸腺嘧啶(T),造成編碼氨基酸的基因發(fā)生無義突變,最終導(dǎo)致第205位氨基酸形成終止密碼子, 即p.Q205X,使ADAR基因所編碼的蛋白提前終止。在表達過程中截短蛋白的產(chǎn)生導(dǎo)致其后大片氨基酸缺失,或可能引起無義介導(dǎo)的mRNA衰減,減少ADAR蛋白的表達,造成單倍劑量不足,促使酶蛋白的催化功能異常,最終導(dǎo)致黑素母細胞功能異常,從而產(chǎn)生DSH相應(yīng)的臨床癥狀。先證者及先證者父親根據(jù)臨床表現(xiàn)診斷DSH,而臨床表型正常的先證者母親未發(fā)現(xiàn)突變,表明發(fā)現(xiàn)的無義突變(c.613C>T)是該患者的致病突變而不是單核苷酸多態(tài)性。胎兒ADAR基因檢測顯示與先證者及先證者父親基因檢測結(jié)果相同,皆出現(xiàn)c.613C>T(p.Q205X)位點無義突變,從而亦確診為DSH。

    經(jīng)查閱國內(nèi)外文獻發(fā)現(xiàn),本研究報告的c.613C>T(p.Q205X)為未曾報道過的無義突變,該突變擴大了DSH的基因譜。通過基因測序獲得的大量突變數(shù)據(jù),可為DSH的基因型與表型關(guān)聯(lián)、致病機制及治療等進一步研究提供幫助。DSH因病變部位暴露的皮膚影響美觀,常給患者帶來心理負擔(dān)。因此,防治關(guān)鍵是檢測其致病基因,找出致病基因的突變位點進行產(chǎn)前篩查,同時作出產(chǎn)前診斷,預(yù)防下一代患者的發(fā)生。

    產(chǎn)前診斷技術(shù)是指利用超聲檢查、母體血清學(xué)篩查、無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測、胎兒染色體核型分析、熒光原位雜交、染色體芯片分析及二代測序等技術(shù)對胚胎或胎兒的發(fā)育情況及是否患病等方面進行檢測診斷[13]。利用產(chǎn)前診斷技術(shù)可盡早發(fā)現(xiàn)缺陷胎兒,并判斷其能否繼續(xù)妊娠,從而降低出生缺陷率,減輕家庭和社會的經(jīng)濟和精力負擔(dān)、提高生活質(zhì)量等。本研究中,先證者父母再次懷孕時,為避免生育遺傳性對稱性色素異?;颊叨M行產(chǎn)前診斷。先證者長大成人婚育前建議進行遺傳咨詢。

    致謝:感謝鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院老師在實驗過程中的幫助及指導(dǎo)。

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