木瓜蛋白酶酶解制備豌豆蛋白自由基清除肽(1)

張樹(shù)成 楊進(jìn)潔

摘要：本研究以豌豆蛋白為原料，選用木瓜蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解，利用響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)優(yōu)化選取最佳的酶解條件。豌豆蛋白木瓜蛋白酶酶解最佳條件：加酶量12.1%（E/S）、溫度60.2℃、pH 6.46、底物濃度7.15%（g/ml）。此條件下，最佳.O2.- 清除率為64.0%。經(jīng)驗(yàn)證，所建模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確可靠，酶解產(chǎn)物自由基清除率高，為相關(guān)生產(chǎn)和工藝產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供參考價(jià)值。酶解液經(jīng)透析分離，自由基清除率能力最強(qiáng)的酶解肽分子量小于1 KDa，說(shuō)明酶解后得到的肽大多是2～8肽，.O2.-清除率為65.3±0.22%。經(jīng)顯著性分析發(fā)現(xiàn)透析能夠顯著提高抗氧化肽的純化率，提高抗氧化肽對(duì)自由基的清除能力。

關(guān)鍵詞：豌豆蛋白;木瓜蛋白酶;酶解;自由基清除率

豌豆（Pea）是我國(guó)的主要農(nóng)作物之一。豌豆富含淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素及多種微量元素。具有調(diào)和脾胃、抗菌消炎、防癌治癌、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)等功效。豌豆的種植面積廣，價(jià)格低廉，在我國(guó)擁有相當(dāng)豐富的資源，存在著極大的開(kāi)發(fā)潛能。近年，酶解豌豆蛋白生成活性肽，比如抗氧化、降血壓等，逐步成為研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)豌豆蛋白木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物DPPH清除率達(dá)98.2%，是一個(gè)很好的抗氧化肽資源。

我國(guó)對(duì)于豌豆的利用以淀粉為主，其對(duì)蛋白質(zhì)的利用率較低。但在現(xiàn)階段，豌豆蛋白的綜合利用成為了國(guó)際上的一個(gè)研究熱點(diǎn)。與其他豆科植物相比，豌豆富含賴氨酸，世界衛(wèi)生組織推薦值的1.5倍。但其蛋氨酸和胱氨酸的含量較低，僅為推薦值的四分之一和五分之一。

除此以外，國(guó)際上現(xiàn)研究，豌豆蛋白通過(guò)酶解所獲得的豌豆蛋白肽具有一些活性功能。比如，Ndiaye等人研究發(fā)現(xiàn)豌豆酶解液具有抗氧化、降低炎癥和免疫調(diào)節(jié)的作用。而Huan Li等人的研究則表明，豌豆蛋白酶解后的產(chǎn)物為陽(yáng)離子多肽，該多肽可以有效調(diào)節(jié)Ca MK II的活性，因而可以作為保健品被利用于心血管疾病的預(yù)防方面。Samson等人則發(fā)現(xiàn)豌豆蛋白可以抑制ACE酶的活性，從而起到降血壓的作用。

酶法酶解生產(chǎn)抗氧化活性肽大多采用蛋白質(zhì)酶解的方式。在酶解過(guò)程中，主要運(yùn)用動(dòng)物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶。本文采用了木瓜蛋白酶對(duì)豌豆蛋白進(jìn)行酶解。

本研究旨在以自由基清除能力作為抗氧化活性的評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建立豌豆蛋白酶解條件預(yù)測(cè)酶解產(chǎn)物自由基清除率模型，以及最佳酶解條件和酶解產(chǎn)物，從而為豌豆蛋白的開(kāi)發(fā)利用和加工拓寬思路、提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

木瓜蛋白酶購(gòu)自濟(jì)寧元素高科生物科技有限公司，木瓜蛋白酶的酶活力為50234 u/g。甲醛溶液等所用試劑均為分析純。豌豆蛋白購(gòu)自煙臺(tái)雙塔食品股份有限公司，主要組成為水分4.62±0.02%，蛋白質(zhì)73.2±0.23%，粗脂肪0.22±0.01%，灰分4.62±0.03%。

1.2 試驗(yàn)儀器

單螺桿擠壓機(jī)由山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院研制。

1.3 豌豆蛋白的酶解

稱取一定質(zhì)量的豌豆蛋白，加入一定質(zhì)量的蛋白酶和一定pH值的磷酸鹽緩沖溶液，搖勻，置于恒溫振蕩水浴鍋中，酶解3 h，沸水浴滅酶10 min。冷卻后，將蛋白酶解液過(guò)濾，濾液，記為酶解物。

1.4 自由基清除活性響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

響應(yīng)面法是利用多元二次回歸方程，來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)回歸方程尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法。

1.5 酶解產(chǎn)物自由基O2.- 清除率活性研究

根據(jù)玄紅專等人的方法 ，加以調(diào)整。實(shí)驗(yàn)組取0.3 mL的濾液加入試管中，準(zhǔn)確移取5 mL Tris-HCl緩沖溶液（pH為8.2），于37℃恒溫水

空白組將濾液更換為蒸餾水，實(shí)驗(yàn)步驟與上述相同。參比為5.3 mL的蒸餾水和0.3 mL的鄰苯三酚溶液。計(jì)算公式如下：

清除率=（ΔA0-ΔA）/ΔA0×100%

其中，ΔA0為空白組吸光度每分鐘的增值;ΔA為實(shí)驗(yàn)組吸光度每分鐘的增值。

1.6 透析袋分離豌豆蛋白抗氧化肽

采用7、3.5、1 KDa的透析袋，對(duì)酶解液進(jìn)行依次分離。預(yù)處理好的透析袋中加入約三分之二的酶解液，兩端封好，放在蒸餾水中進(jìn)行攪拌，每隔一段時(shí)間換一次水，直至透出液不再有顏色變化，將透出液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，對(duì)濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得到豌豆蛋白抗氧化肽粉。

1.7 豌豆蛋白抗氧化肽的抗氧化活性測(cè)定

對(duì)1.6中收集得到的分子量為小于1 KDa、1～3.5 KDa、1～3.5 KDa和大于7 KDa的豌豆蛋白抗氧化肽粉進(jìn)行O2.- 清除率的測(cè)定。

1.8 豌豆蛋白酶解產(chǎn)物分子量分布的測(cè)定

用Waters Protein-Pak 125A 300 mm×7.8 mm色譜柱對(duì)經(jīng)透析袋分離后得到的分子量小于1 KDa的組分進(jìn)行分子量分布的分析。流動(dòng)相：乙腈/水/三氟乙酸，45/55/0.1（V/V），檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm流速：0.5 mL/min柱溫：30℃。

1.9數(shù)據(jù)分析

每個(gè)操作3次平行。利用SAS 9.1軟件建立回歸模型方程，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Anova分析，Duncan test確定平均值差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解物O2.-清除活性實(shí)驗(yàn)

在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定酶解時(shí)間3 h，選取加酶量（A）、溫度（B）、pH值（C）、底物濃度（D）為變量，以酶解物的自由基清除率活性為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4因素5水平共26個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)進(jìn)行二次回歸設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和分析。實(shí)驗(yàn)方案、實(shí)驗(yàn)條件及結(jié)果列于表1表2中。

以O(shè)2.- 清除率為響應(yīng)值，經(jīng)回歸擬合后，木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白的O2.- 清除率的回歸方程為：O2.- 清除率=-1481+32.2*A+21.7*B+186*C+21.4*D-0.108*AB-1.06*AC+0.377*AD-0.440*BC+0.208*BD+0.394*CD-0.874*A2-0.156*B2-11.4*C2-2.76*D2。

注：-為不顯著（P>0.05），*為顯著（P<0.05），**為極顯著（P<0.01）。

由表3可知，所建模型是顯著的，失擬向是不顯著的，說(shuō)明無(wú)失擬因子存在，該模型與真實(shí)測(cè)量值擬合良好。底物濃度、底物濃度的二次項(xiàng)、加酶量的二次項(xiàng)、溫度的二次項(xiàng)、pH的二次項(xiàng)影響極顯著。說(shuō)明在木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白過(guò)程中，底物濃度、底物濃度的二次項(xiàng)、加酶量的二次項(xiàng)、溫度的二次項(xiàng)、pH的二次項(xiàng)對(duì)O2.- 清除率有顯著影響。由F值可知，F(xiàn)值越大對(duì)豌豆蛋白酶解度的影響就越大，所以各因素對(duì)豌豆蛋白酶解液O2.- 清除率的影響次序：底物濃度>酶解溫度>加酶量>pH。

2.2 最佳自由基清除率條件

以O(shè)2.- 清除率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)回歸方程進(jìn)行偏微分，得出最佳酶解條件：加酶量12.1%、溫度60.2℃、pH 6.46、底物濃度7.15%。在此條件下，得到最佳O2.- 清除率為64.0%。

2.3驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

經(jīng)驗(yàn)證，在此條件下，得到O2.- 清除率為65.3±0.22%。方差分析無(wú)顯著性差異。這說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確可靠，可用于豌豆蛋白酶解物.O2.-清除率效果預(yù)測(cè)及酶解條件確定和篩選。

2.4 豌豆蛋白抗氧化肽的分離

對(duì)用透析袋分離得到的四個(gè)不同分子量的組分肽進(jìn)行抗氧化化性測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

由表4可知，不同分子量的豌豆蛋白抗氧化肽均具有O2.- 的清除能力，其清除能力隨分子量減小而增大。分子量小于1 KDa的清除能力最強(qiáng)。這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。因此后邊實(shí)驗(yàn)以分子量小于1 KDa的組分為研究材料。

2.5?豌豆蛋白酶解物小于1 KDa組分的分子量分析

2.5.2?分子量小于1 KDa的酶解產(chǎn)物分子量分布圖

由圖1可知，經(jīng)1 KDa透析袋分離后的酶解液，分子量大多集中在200～800 Da左右，說(shuō)明酶解后得到的肽大多是2～8肽，這與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致。

3.結(jié)論

木瓜蛋白酶酶解豌豆蛋白最佳酶解條件：加酶量12.1%、溫度60.2℃、pH 6.46、底物濃度7.15%。此條件下，最佳O2.-清除率為64.0%。得到了豌豆蛋白木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物自由基清除預(yù)測(cè)模型，該模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確可靠，可用于豌豆蛋白的生產(chǎn)預(yù)測(cè)和工藝開(kāi)發(fā)。

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