TLR4/MyD88/NF-κB在克羅恩病結(jié)腸組織的表達(dá)及臨床意義

朱瑞齊 莊培麗 周璐 王丹丹 馮百歲

[關(guān)鍵詞] 克羅恩病;TLR4;MyD88;NF-κB

[中圖分類號(hào)] R735.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）29-0017-04

Expression and clinical significance of TLR4/MyD88/NF-κB in the colonic tissues of patients with Crohn′s disease

ZHU Ruiqi? ?ZHUANG Peili? ?ZHOU Lu? ?WANG Dandan? ?FENG Baisui

Department of Gastroenterology， the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou? ?450003， China

[Abstract] Objective To explore the expressions of toll-like receptor 4 （TLR4）， myeloid differentiation factor 88 （MyD88） and nuclear factor kappa B （NF-κB） in the colonic tissues of patients with Crohn′s disease （CD） by immunohistochemistry， and to analyze whether there are differences between groups and whether there is any correlation between them and disease activity. Methods A total of 17 colonic tissue specimens from CD patients hospitalized in The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University and 5 colonic tissue specimens from the control group were collected. The expressions of TLR4， MyD88 and NF-κB were compared between the two groups，and their expressions in the groups with different severity of CD were also compared to see if there was any difference. Results The expression levels of TLR4， MyD88 and NF-κB in colonic tissues were higher in the CD group than those in the normal control group. The expression levels of TLR4 and MyD88 were significantly moderately correlated with erythrocyte sedimentation rate （ESR）， and the expression level of NF-κB was significantly moderately correlated with C-reactive protein （CRP） and albumin levels. Conclusion The expressions of TLR4， MyD88， and NF-κB in colonic tissues of CD patients are higher than those in normal colonic tissues， and the TLR4/MyD88/NF-κB pathway plays an important role in the pathogenesis of CD. The expression levels of TLR4， MyD88 and NF-κB are significantly correlated with various inflammatory indicators.

[Key words] Crohn′s disease; Toll-like receptor 4; Myeloid differentiation factor 88; Nuclear factor kappa B

炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）是一種與人體免疫密切相關(guān)的慢性腸道疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn′s disease，CD），典型臨床表現(xiàn)為持續(xù)或反復(fù)發(fā)作的腹痛、黏液膿血便和體重減輕等，可伴有皮膚、眼部、肝膽等腸外表現(xiàn)[1]。近20余年來(lái)，我國(guó)IBD患者就診人數(shù)呈快速上升趨勢(shì)[2]。IBD的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，遺傳、環(huán)境、免疫失調(diào)等多種因素均參與其發(fā)病[3]。越來(lái)越多的研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)相關(guān)通路在CD發(fā)病中尤為重要。

有研究發(fā)現(xiàn)，在葡聚糖硫酸鈉（Dextran sulfate sodium，DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中發(fā)現(xiàn)小鼠結(jié)腸組織炎癥部位TLR4、MyD88、NF-κB高表達(dá)，并且通過(guò)一種新型可溶性蛋白HM0539證明該物質(zhì)可通過(guò)減少TLR4的激活并抑制MyD88的轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)下游NF-κB的激活對(duì)小鼠結(jié)腸炎顯示出顯著的保護(hù)作用[4-5]。TLR是先天性免疫識(shí)別受體的重要部分，在對(duì)病原微生物的識(shí)別中發(fā)揮著重要作用，TLR4通過(guò)非特異性地和病原相關(guān)分子結(jié)合啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，引發(fā)腸道炎癥介質(zhì)的釋放，參與UC的發(fā)病[6]。MyD88是含有TLR結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，它作為TLR信號(hào)通路中的下游信號(hào)因子在TLR信號(hào)通路中起著關(guān)鍵作用[7]。TLR4可通過(guò)MyD88途徑進(jìn)行信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。NF-κB是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于各種組織，在免疫和炎癥反應(yīng)中有著重要地位，NF-κB是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)，在腫瘤及炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)中起著至關(guān)重要的作用[8-9]。越來(lái)越多的研究證實(shí)，TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路在UC的發(fā)病中有重要作用[10]。但該通路在CD發(fā)病中作用有待進(jìn)一步研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年12月至2020年12月鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科入院治療的CD患者內(nèi)鏡活檢標(biāo)本或手術(shù)切除的結(jié)腸組織標(biāo)本共17例，其中男12例，女5例。CD的診斷及評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)均嚴(yán)格按照2018年炎癥性腸病學(xué)組制定的共識(shí)執(zhí)行。所選患者排除其他自身免疫性疾病、嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良及急性感染性疾病。收集5例同時(shí)期住院行結(jié)直腸癌手術(shù)的患者切緣陰性的組織標(biāo)本作為對(duì)照組，并由專業(yè)的病理醫(yī)生確認(rèn)。上述實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意后實(shí)施，所選患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)腸組織TLR4、MyD88、NF-κB的表達(dá)情況，所用主要試劑為北京Bioss公司生產(chǎn)的兔源Toll樣受體4抗體和兔源MyD88抗體及Affinit公司生產(chǎn)的兔源NF-κB p65抗體;通過(guò)入院病歷收集患者的性別、年齡、病程等資料，記錄患者入院時(shí)的癥狀（腹痛、大便次數(shù)等）、體征、既往史等，收集入院后首次血常規(guī)、肝功、ESR、CRP、腸鏡報(bào)告等。采用Best CDAI評(píng)分對(duì)CD患者的病情評(píng)估并分組，共包含稀便次數(shù)、腹痛程度、一般情況、腸外表現(xiàn)與并發(fā)癥、阿片類止瀉藥、腹部包塊、血細(xì)胞比容降低值、100×（1-體重/標(biāo)準(zhǔn)體重）共8項(xiàng)指標(biāo)，計(jì)算各指標(biāo)得分后乘以相關(guān)權(quán)重得出總分，<150分為緩解期，≥150分為活動(dòng)期，其中150～220分為輕度，221～450分為中度，>450分為重度。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分析

免疫組化的結(jié)果在400倍高倍鏡下觀察，隨機(jī)選取3個(gè)不同視野計(jì)算均值。①計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞百分比：0～5%計(jì)0分;6%～25%計(jì)1分;26%～50%計(jì)2分;51%～75%計(jì)3分;>75%計(jì)4分。②染色強(qiáng)度：無(wú)著色為0分;淺黃色為1分;棕黃色為2分;黃褐色為3分;然后計(jì)算上述兩項(xiàng)得分的乘積，所得值即為陽(yáng)性等級(jí)評(píng)分：0分計(jì)為陰性，1～4分計(jì)為弱陽(yáng)性，5～8分計(jì)為陽(yáng)性，9～12分則計(jì)為強(qiáng)陽(yáng)性，染色結(jié)果由2位病理科醫(yī)生在雙盲情況下觀察所得。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析并處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用（x±s）表示，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，各組數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性或正態(tài)檢驗(yàn)后，兩組或多組比較采用單因素方差分析的S-N-K多重比較或秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較

收集17例CD患者結(jié)腸組織標(biāo)本，根據(jù)Best CDAI評(píng)分對(duì)患者的病情程度進(jìn)行評(píng)估，其中緩解期6例，輕度6例，中重度5例，同時(shí)收集5例結(jié)直腸癌手術(shù)患者的切緣組織的病理蠟塊;組間性別和年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 免疫組化法檢測(cè)CD患者結(jié)腸組織TLR4、MyD88和NF-κB的表達(dá)

2.2.1 TLR4? 為廣泛表達(dá)的受體，在多種炎性細(xì)胞及結(jié)腸組織的黏膜上皮細(xì)胞等均可表達(dá)，對(duì)照組和CD組相比陽(yáng)性細(xì)胞占比更少且染色程度更輕，CD組間均可見(jiàn)大量呈淡黃色或棕黃色的陽(yáng)性區(qū)域?；颊呓Y(jié)腸組織TLR4表達(dá)的陽(yáng)性等級(jí)評(píng)分平均水平，中重度CD組為（6.80±1.98）分、輕度CD組（6.50±2.03）分、緩解期CD組為（4.83±1.05）分，較對(duì)照組的（2.33±0.47）分表達(dá)水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;CD組組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖1、封三圖1。

2.2.2 MyD88? 定位于細(xì)胞質(zhì)，表達(dá)情況如下，對(duì)照組和緩解期CD組與活動(dòng)期CD組相比陽(yáng)性細(xì)胞占比更少且染色程度更輕，活動(dòng)期CD組可見(jiàn)中等至大量呈淡黃色或棕黃色的區(qū)域。結(jié)腸組織MyD88表達(dá)的陽(yáng)性等級(jí)評(píng)分的平均水平如下，中重度CD組為（5.80±0.56）分、輕度CD組為（6.00±1.25）分，較緩解期CD組（2.94±1.53）分和對(duì)照組（1.13±0.41）分表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，輕度CD組和中重度組間相比以及緩解期組和對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2、封三圖2。

2.2.3 NF-κB? 為廣泛表達(dá)的受體，是諸多信號(hào)通路核心樞紐之一，靜息狀態(tài)下多存在于細(xì)胞漿，活化后則存在于細(xì)胞核。其表達(dá)情況，CD各組和對(duì)照組相比陽(yáng)性細(xì)胞占比更多且染色程度更重，CD組間均可見(jiàn)大量呈棕黃色或者黃褐色陽(yáng)性區(qū)域?；颊呓Y(jié)腸組織NF-κB表達(dá)的陽(yáng)性等級(jí)評(píng)分平均水平，中重度CD組為（7.93±1.17）分、輕度CD組為（6.83±2.19）分、緩解期CD組為（5.17±1.24）分，較對(duì)照組的（2.93±0.60）分水平高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;緩解期組相比輕度CD組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;相比中重度組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2、封三圖3。

2.3 TLR4、MyD88和NF-κB的表達(dá)與各臨床指標(biāo)及彼此之間的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NF-κB與CRP間存在顯著的中等強(qiáng)度正相關(guān)，與白蛋白存在顯著的中等強(qiáng)度負(fù)相關(guān)，與其余指標(biāo)無(wú)明顯相關(guān);TLR4和MyD88與ESR間存在顯著的中等強(qiáng)度正相關(guān)，與其余指標(biāo)無(wú)明顯相關(guān)，即TLR4、MyD88、NF-κB與炎癥指標(biāo)關(guān)系密切。TLR4、MyD88和NF-κB在CD組表達(dá)升高且彼此間存在不同程度的正相關(guān)，TLR4和MyD88間存在顯著強(qiáng)相關(guān)，MyD88與NF-κB間存在顯著強(qiáng)相關(guān)，可以推測(cè)上述指標(biāo)與CD發(fā)病及疾病活動(dòng)關(guān)系密切。見(jiàn)表3。

3 討論

IBD 是一組病因不明、發(fā)病機(jī)制不清的腸道慢性炎癥性疾病，包括 UC和CD兩種類型。CD病變可累及整個(gè)消化道，主要癥狀為腹痛和腹瀉，可伴體重減輕、發(fā)熱、疲勞、貧血等全身表現(xiàn)，可并發(fā)瘺管、腹腔膿腫、腸腔狹窄、腸梗阻和肛周膿腫等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。近年來(lái)我國(guó)IBD發(fā)病及就診人數(shù)不斷上升，給社會(huì)及患者家庭帶來(lái)巨大的負(fù)擔(dān)[11]。隨著越來(lái)越多的生物制劑不斷問(wèn)世及投入使用，很大程度地改善患者的生活質(zhì)量，但不是所有患者均對(duì)生物制劑應(yīng)答良好，且目前仍缺乏能根治或長(zhǎng)期有效維持緩解的手段，現(xiàn)有研究表明免疫功能紊亂在IBD發(fā)病中占重要地位，所以對(duì)于IBD發(fā)病機(jī)制的研究非常重要。

本研究中，通過(guò)免疫組化的方法檢測(cè)CD結(jié)腸組織中TLR4、MyD88和NF-κB的表達(dá)發(fā)現(xiàn)TLR4、MyD88和NF-κB在CD患者的結(jié)腸黏膜中表達(dá)均高于對(duì)照組，活動(dòng)期的CD結(jié)腸組織中MyD88的表達(dá)高于緩解期，下游分子NF-κB在中重度患者的表達(dá)也高于緩解期的患者。同時(shí)，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，NF-κB與CRP間存在顯著的中等強(qiáng)度正相關(guān)，與白蛋白存在顯著的中等強(qiáng)度負(fù)相關(guān)。TLR4和MyD88與ESR間存在顯著的中等強(qiáng)度正相關(guān)，上述結(jié)果提示TLR4、MyD88、NF-κB與CD的發(fā)病關(guān)系密切且與疾病活動(dòng)度相關(guān)。相關(guān)分析還顯示，TLR4和MyD88間存在顯著強(qiáng)相關(guān)，而MyD88與NF-κB也存在顯著強(qiáng)相關(guān)，所以本研究推測(cè)該通路聯(lián)系緊密，彼此間以正向調(diào)節(jié)的形式參與CD發(fā)病，且信號(hào)間的傳遞受其他因素干擾較小。

有研究證實(shí)，通過(guò)應(yīng)用NF-κB抑制劑PDTC等證明通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，可以減輕腸道的炎癥反應(yīng)[12]。不僅如此，益生菌、短鏈脂肪酸、寡糖等有利于減輕腸道炎癥反應(yīng)的物質(zhì)均有抑制NF-κB表達(dá)的作用[13-15]。但NF-κB作為多條信號(hào)通路的共同下游信號(hào)因子，除本文中提到的TLR4/MyD88/NF-κB通路外，MLCK/NF-κB[16]和TLR4/MAPK/NF-κB[13]等信號(hào)通路也參與了IBD的發(fā)病，具體哪條通路更重要，其機(jī)制復(fù)雜仍需進(jìn)一步研究。不僅如此，通過(guò)CD147刺激腸上皮細(xì)胞中NF-κB的磷酸化，會(huì)加重腸道炎癥反應(yīng)[17]。種種跡象均表明NF-κB在IBD的發(fā)病中非常重要。此外，TLR4非特異性地和病原相關(guān)分子結(jié)合啟動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過(guò)抑制其表達(dá)也可以發(fā)揮減輕腸道炎癥反應(yīng)的作用[18]。但作為上游信號(hào)因子，TLR4不僅可通過(guò)經(jīng)典的MyD88誘導(dǎo)NF-κB的表達(dá)增加，還可以通過(guò)非經(jīng)典的MyD88途徑及MAPK等途徑來(lái)誘導(dǎo)NF-κB的表達(dá)增加[19]。所以，本研究可通過(guò)TNBS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型驗(yàn)證上述結(jié)果，同時(shí)通過(guò)特異性的抑制MyD88的表達(dá)來(lái)觀察NF-κB的表達(dá)情況及對(duì)腸道炎癥反應(yīng)的抑制作用。

綜上所述，CD結(jié)腸組織中TLR4、MyD88和NF-κB的表達(dá)在本實(shí)驗(yàn)中相比于對(duì)照組表達(dá)增加，且TLR4、MyD88和NF-κB與疾病活動(dòng)度相關(guān)的臨床炎癥指標(biāo)間存在相關(guān)性。但本研究為單中心小樣本研究，免疫組化的結(jié)果也存在一定的主觀差異，所以仍需更多的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證上述結(jié)果，需要相關(guān)的動(dòng)物或細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證上述通路的具體機(jī)制。

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（收稿日期：2021-05-08）