基于腫瘤動(dòng)物模型病理學(xué)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)

王敏，谷弘，王毅君，馬嵐

（蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，甘肅 蘭州）

0 引言

腫瘤是臨床常見疾病，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)[1]。在醫(yī)學(xué)本科實(shí)踐教學(xué)中，由于腫瘤病程較長(zhǎng)，以腫瘤患者為研究對(duì)象觀察腫瘤的發(fā)生發(fā)展并進(jìn)行病理診斷存在困難。因此，醫(yī)學(xué)本科生對(duì)于腫瘤知識(shí)的學(xué)習(xí)主要是通過病理學(xué)大體標(biāo)本及組織切片的觀察來獲取，或者在臨床實(shí)習(xí)過程中，通過腫瘤患者臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果進(jìn)行學(xué)習(xí)。這樣的知識(shí)獲取過程，學(xué)生多以被動(dòng)接受為主，往往缺少獨(dú)力思考和強(qiáng)化訓(xùn)練的環(huán)節(jié)，對(duì)知識(shí)掌握不牢固、不靈活。

隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步發(fā)展，國(guó)家對(duì)新時(shí)代醫(yī)學(xué)高等教育提出了更高的要求：“卓越醫(yī)生教育培養(yǎng)計(jì)劃2.0”提出了以勝任力為導(dǎo)向的教育教學(xué)改革[2]。目前國(guó)內(nèi)很多醫(yī)學(xué)院校進(jìn)行了嘗試，開設(shè)多種綜合性實(shí)驗(yàn)以提升教學(xué)效果[3-8]。為了加強(qiáng)腫瘤基礎(chǔ)理論與臨床表現(xiàn)的聯(lián)系，提高學(xué)生的臨床思維和實(shí)踐操作能力，設(shè)計(jì)了《肝癌小鼠模型的建立及病理學(xué)檢測(cè)》形態(tài)學(xué)綜合性實(shí)驗(yàn)，并融合多元化的思政元素，在實(shí)踐中取得了較好的教學(xué)效果。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目包括腫瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)、肝癌荷瘤小鼠模型建立、腫瘤組織病理學(xué)檢測(cè)、結(jié)果分析及臨床案例討論。實(shí)驗(yàn)計(jì)劃14 學(xué)時(shí)共4 周完成，第1 周腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)4 學(xué)時(shí)，第2 周腫瘤動(dòng)物模型的建立4 學(xué)時(shí)，中間間隔2 周對(duì)荷瘤小鼠的生長(zhǎng)進(jìn)行觀察記錄，第3 周荷瘤小鼠的病理學(xué)檢測(cè)4 學(xué)時(shí)，第4周實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析及臨床案例討論2 學(xué)時(shí)。

2 教學(xué)目標(biāo)

2.1 基礎(chǔ)理論知識(shí)的綜合運(yùn)用

要求學(xué)生掌握關(guān)于腫瘤的病理學(xué)知識(shí)，如腫瘤的致病因素、形態(tài)及對(duì)機(jī)體的影響等；熟悉正常肝臟的解剖學(xué)、組織學(xué)特點(diǎn)及正常生理功能；了解肝癌的病因、病理、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查等內(nèi)容。將基礎(chǔ)理論知識(shí)與臨床課程的知識(shí)點(diǎn)融會(huì)貫通，培養(yǎng)學(xué)生知識(shí)整合能力。

2.2 實(shí)踐操作技能的強(qiáng)化訓(xùn)練

要求學(xué)生掌握細(xì)胞傳代培養(yǎng)、計(jì)數(shù)及活性檢測(cè)，熟悉腫瘤動(dòng)物模型的建立方法及荷瘤小鼠的觀察指標(biāo)，掌握病變組織的大體觀察及取材、病理組織切片或涂片標(biāo)本制備及染色方法，提高學(xué)生實(shí)踐操作能力。

2.3 自主創(chuàng)新能力的培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目以學(xué)生為主體，中間設(shè)置開放環(huán)節(jié)，如接種細(xì)胞濃度的選擇、化療藥物種類、濃度、藥物作用時(shí)間的設(shè)置等，學(xué)生均以團(tuán)隊(duì)小組為單位進(jìn)行資料查閱、實(shí)驗(yàn)操作、結(jié)果分析及臨床案例的討論，能夠培養(yǎng)學(xué)生的團(tuán)隊(duì)協(xié)作精神及自主創(chuàng)新能力。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞株清潔級(jí)昆明種小鼠，18～22g，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；小鼠H22 肝癌細(xì)胞株，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器CO2培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、倒置相差顯微鏡、小動(dòng)物電子秤、病理取材臺(tái)、體式顯微鏡、組織包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)、生物顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)、酶標(biāo)儀等。

3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑3%～5%苦味酸溶液、生理鹽水、環(huán)磷酰胺、10%水合氯醛、乙醇、二甲苯、石蠟、10%中性福爾馬林溶液、蘇木素染液、伊紅Y 染液、甲胎蛋白（AFP）檢測(cè)試劑盒等。

3.2 腫瘤細(xì)胞準(zhǔn)備

小鼠肝癌細(xì)胞株H22 用含10%FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80-90%時(shí)，胰酶消化，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，細(xì)胞活性良好，配置成濃度為1×107個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液。

3.3 肝癌小鼠模型建立

3.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型建立將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、皮下移植瘤組、腹水瘤組、實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移組及藥物治療組。荷瘤組實(shí)驗(yàn)小鼠分別于右側(cè)腋部皮下、腹腔、尾靜脈注射腫瘤細(xì)胞懸液0.2mL，構(gòu)建皮下移植瘤、腹水瘤及實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移瘤小鼠模型，空白對(duì)照組小鼠相同部位注射生理鹽水0.2mL。

3.3.2 荷瘤小鼠的藥物治療皮下移植瘤及實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移瘤模型小鼠在腫瘤細(xì)胞接種后24h，按30mg/kg 體重通過腹腔注射環(huán)磷酰胺溶液，隔天1 次，連續(xù)14 天。

3.4 荷瘤小鼠的一般觀察

3.4.1 每日觀察各組小鼠的精神狀態(tài)、體毛、飲食、活動(dòng)及糞便情況，稱重并繪制小鼠體重生長(zhǎng)曲線。

3.4.2 皮下移植瘤模型及相應(yīng)藥物治療組小鼠每日觀察接種部位有無感染，腫瘤生長(zhǎng)后有無自然消退，待右側(cè)腋窩皮下可觸及結(jié)節(jié)后，每隔一天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的最長(zhǎng)徑（a）和與其垂直的短徑（b），根據(jù)體積公式V=1/2×a×b2（mm3）[9]計(jì)算荷瘤小鼠皮下移植瘤的體積，繪制腫瘤體積生長(zhǎng)曲線。腹水瘤模型小鼠每日觀察小鼠腹部變化，測(cè)量腹圍，評(píng)價(jià)癌性腹水形成情況。

3.5 荷瘤小鼠病理學(xué)檢測(cè)

3.5.1 荷瘤小鼠病理學(xué)大體觀察實(shí)驗(yàn)小鼠麻醉后頸椎脫臼法處死。觀察并記錄腫瘤組織的分布、形狀、質(zhì)地、界限、長(zhǎng)短徑、重量、與周圍組織的粘連情況；觀察荷瘤小鼠各臟器的表面是否有結(jié)節(jié)，稱重；抽取小鼠腹水，觀察其顏色和體積；并與對(duì)照組小鼠進(jìn)行比較[10]。大體觀察結(jié)束后將小鼠腹部進(jìn)行縫合，實(shí)現(xiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的人文關(guān)懷。

3.5.2 組織切片、腹水涂片的制作及HE 染色腫瘤組織及小

鼠臟器經(jīng)固定、取材、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等過程，制成石蠟切片。腹水抽取后滴于載玻片上制成腹水涂片。常規(guī)蘇木素-伊紅染色，封片。

3.5.3 鏡下觀察生物顯微鏡下觀察荷瘤小鼠腫瘤組織及各臟器的組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，從低倍到高倍。通過觀察對(duì)照組小鼠各臟器的組織切片，比較正常組織與病理組織形態(tài)的差異。

3.6 荷瘤小鼠的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)

各組小鼠麻醉后眼眶取血法收集血液標(biāo)本，置于枸櫞酸鈉抗凝管中，室溫2000 rpm/min 離心15min，收集血漿待用。采用ELISA 雙抗體夾心法，操作嚴(yán)格按照AFP 檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行，測(cè)定實(shí)驗(yàn)小鼠血漿AFP 水平。

3.7 臨床案例討論

通過對(duì)某臨床案例中患者的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)進(jìn)行分析，觀察病理大體標(biāo)本和鏡下切片，明確該患者的病理診斷，分析該患者出現(xiàn)上腹疼痛、消瘦、腹水等癥狀體征的原因；討論該患者的疾病病程。使學(xué)生掌握肝癌的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室陽性指標(biāo)，熟悉肝癌的轉(zhuǎn)移途徑、診斷及鑒別診斷。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論

4.1 實(shí)驗(yàn)小鼠體重生長(zhǎng)情況觀察

不同實(shí)驗(yàn)組小鼠體重變化如圖1 所示。結(jié)果顯示，各對(duì)照組小鼠體重隨著時(shí)間緩慢增加，但皮下移植瘤組和實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移組小鼠的體重在緩慢增加后又逐漸降低，提示可能隨著腫瘤的發(fā)展，腫瘤影響小鼠機(jī)體功能，導(dǎo)致其體重減輕。藥物治療組與對(duì)照組小鼠相比，雖然也有體重減輕，但是均高于荷瘤組，表明藥物治療能夠減緩荷瘤所致的小鼠體重降低。此外，腹水瘤模型組小鼠體重增長(zhǎng)明顯快于對(duì)照組，可能是由于癌性腹水的快速增長(zhǎng)，導(dǎo)致小鼠體重的相對(duì)增加。

圖1 各組實(shí)驗(yàn)小鼠體重生長(zhǎng)曲線

4.2 荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況觀察

實(shí)驗(yàn)小鼠的腫瘤生長(zhǎng)情況如圖2 所示。皮下移植瘤模型小鼠在腫瘤細(xì)胞接種后4-5 天皮下可觸及腫瘤結(jié)節(jié)，腫瘤體積隨著時(shí)間逐漸增大；當(dāng)使用環(huán)磷酰胺治療后，皮下腫瘤結(jié)節(jié)的體積顯著小于未治療組，表明化療藥物治療能夠減緩腫瘤的生長(zhǎng)。腹水瘤小鼠的腹圍能夠代表癌性腹水的產(chǎn)生情況，結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，腹水瘤模型小鼠腹圍隨著時(shí)間顯著增加。

圖2 各組實(shí)驗(yàn)小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況

4.3 荷瘤小鼠腫瘤組織的病理學(xué)檢測(cè)

對(duì)各組實(shí)驗(yàn)小鼠的腫瘤組織及臟器進(jìn)行大體及鏡下觀察，部分結(jié)果如圖3 所示。皮下移植瘤模型小鼠腋下接種部位可見突出皮膚的腫物形成，切開皮膚可見完整的瘤體組織，藥物治療組小鼠的瘤體組織明顯小于未治療組。經(jīng)HE 染色后光鏡下觀察，可見腫瘤細(xì)胞排列紊亂，大小形態(tài)不一，核漿比例失調(diào)，細(xì)胞核形態(tài)不一，核大深染，可見巨核、雙核現(xiàn)象，并伴有壞死組織及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。剝?nèi)?shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移組小鼠的肺組織在體視顯微鏡下觀察，可見對(duì)照組小鼠肺組織表面光滑，荷瘤組小鼠肺表面出現(xiàn)部分直徑為2-3mm 的小結(jié)節(jié)。肺組織切片觀察對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)腫瘤組織，荷瘤組出現(xiàn)大片癌組織，呈團(tuán)塊狀分布。腹水瘤模型小鼠腹水涂片結(jié)果顯示，腫瘤細(xì)胞大小形態(tài)不一，核漿比例失調(diào)，核大深染，符合肝癌H22 細(xì)胞的形態(tài)。

4.4 荷瘤小鼠血漿AFP 水平檢測(cè)

酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠血漿AFP 水平，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，三種模型小鼠血漿AFP 水平均顯著升高，藥物治療組小鼠血漿AFP 水平低于荷瘤組，提示化療藥物治療能夠減緩由于荷瘤所致的小鼠血漿AFP 含量增加（見表1）。

表1 實(shí)驗(yàn)小鼠血漿AFP 水平（±s）

表1 實(shí)驗(yàn)小鼠血漿AFP 水平（±s）

注：NA 表示無相關(guān)數(shù)據(jù)

皮下移植瘤模型（ng/mL） 實(shí)驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移瘤模型（ng/mL） 腹水瘤模型（ng/mL）對(duì)照組 1.26±0.07 1.28±0.06 1.29±0.04荷瘤組 3.97±0.22 3.63±0.11 2.65±0.13藥物治療組 2.66±0.16 2.93±0.08 NA

圖3 荷瘤小鼠腫瘤組織形態(tài)觀察（HE 染色，Bar=50μm）

5 實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果

本實(shí)驗(yàn)通過建立腫瘤動(dòng)物模型，學(xué)生不僅能夠觀察腫瘤的大體標(biāo)本和組織切片，而且可以直觀的觀察腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移情況，從而更立體化的理解腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，鞏固病理學(xué)相關(guān)知識(shí)內(nèi)容。通過臨床案例討論，將基礎(chǔ)理論與臨床表現(xiàn)有機(jī)結(jié)合，學(xué)生通過觀察荷瘤小鼠的一般情況，能夠更深層次的理解肝癌患者臨床癥狀、體征如消瘦、腹水、惡病質(zhì)等的產(chǎn)生原因。通過荷瘤動(dòng)物的病理學(xué)檢測(cè)，使學(xué)生們掌握臨床病理常用檢測(cè)方法，不僅強(qiáng)化理論教學(xué)，更促使學(xué)生從被動(dòng)學(xué)習(xí)轉(zhuǎn)向主動(dòng)學(xué)習(xí)，開拓科研思維，增強(qiáng)實(shí)踐操作能力。此外，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后處死及大體觀察后進(jìn)行縫合等實(shí)驗(yàn)操作細(xì)節(jié)，有機(jī)融合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)的相關(guān)內(nèi)容，能夠培養(yǎng)學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的人文關(guān)懷。

6 結(jié)語

細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物模型建立及病理檢測(cè)這些均是醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究或臨床中常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。本綜合性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以上述實(shí)驗(yàn)方法為載體，有機(jī)整合細(xì)胞生物學(xué)、病理學(xué)、免疫學(xué)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)和內(nèi)科學(xué)的相關(guān)教學(xué)內(nèi)容，使實(shí)驗(yàn)教學(xué)緊密結(jié)合醫(yī)學(xué)發(fā)展前沿。這樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，注重功能、代謝、形態(tài)改變與臨床的內(nèi)在聯(lián)系，能夠幫助學(xué)生構(gòu)建系統(tǒng)的思維方式，加強(qiáng)其綜合創(chuàng)新能力，培養(yǎng)能夠運(yùn)用交叉學(xué)科知識(shí)解決未來醫(yī)學(xué)領(lǐng)域前沿問題的高層次醫(yī)學(xué)創(chuàng)新人才。