異種脫細(xì)胞基質(zhì)支架移植修補(bǔ)膀胱的研究

鄧 飛， 胡幗穎， 顧漢卿

(1.北京市順義區(qū)醫(yī)院泌尿外科， 北京 101300；2.天津市泌尿外科研究所， 天津 300211)

由腫瘤、結(jié)核等原因引起的膀胱大面積缺損一直是臨床難題，現(xiàn)在多采用腸管(回腸、結(jié)腸)替代膀胱。但是胃腸道組織，不可避免地存在代謝異常、分泌腸液、感染、尿路結(jié)石、隨時間推移發(fā)生攣縮等一系列并發(fā)癥。 近年來，各種各樣生物可降解支架材料，特別是異體脫細(xì)胞基質(zhì)支架以其低抗原性，種屬差異小，更符合生理特性，引起了研究者的重視，被研制開發(fā)并成功用于動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行膀胱修補(bǔ)替代〔1〕。以膠原為主要成分構(gòu)成的異體脫細(xì)胞基質(zhì)支架除了起著支持、連接細(xì)胞的作用外,還為細(xì)胞的生長、代謝提供場所,并對細(xì)胞生長、代謝起重要的調(diào)節(jié)作用。將其作為宿主細(xì)胞生長的載體,完成對缺損組織的修復(fù),是近年來組織工程學(xué)的重大進(jìn)展〔2〕。 豬膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)(bladder acellular matrix，BAM)和豬真皮脫細(xì)胞基質(zhì)(dermal acelluar matrix，DAM)是利用生物酶和相關(guān)試劑除去膀胱、真皮組織中的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，留下細(xì)胞外基質(zhì)，成為無細(xì)胞和富含膠原、彈性蛋白、平滑肌結(jié)構(gòu)、血管框架的基質(zhì)。這種材料具有良好的生物相容性和機(jī)械穩(wěn)定性，免疫原性相對較低，從而為細(xì)胞再生提供了一個良好的支架，營造了細(xì)胞再生時優(yōu)良微環(huán)境，作為細(xì)胞支架用于新生膀胱組織的生長替代重建，完成膀胱缺損的修復(fù)，執(zhí)行膀胱的儲尿和排尿功能〔3〕。 本實(shí)驗(yàn)之前制備了豬DAM和BAM這兩種基質(zhì)，利用病理切片，證實(shí)基質(zhì)中無細(xì)胞及細(xì)胞碎片，只留下細(xì)胞外基質(zhì)成分，成為異種生物支架。實(shí)驗(yàn)中支架植入實(shí)驗(yàn)兔的膀胱缺損處，觀察不同時期膀胱標(biāo)本，了解膀胱組織再生情況，檢驗(yàn)支架的植入效果。

1 材料和方法

1.1 異種支架的制備

1.1.1 豬DAM制備方法 小型實(shí)驗(yàn)豬真皮斷層皮片，約4 cm×6 cm，使用0.125%胰蛋白酶溶液，在4℃，經(jīng)過24 h脫去真皮細(xì)胞，0.5% SDS振蕩洗滌3 h清除細(xì)胞碎片。儲存在0.1%疊氮鈉-PBS溶液中，加入雙抗溶液，密封，4℃保存。

1.1.2 豬BAM制備方法 小型實(shí)驗(yàn)豬膀胱刮去粘膜后保留粘膜下層組織，切成3 cm×3 cm片斷，放在含有2000 kU DNAse及2000 kU RNAse的1 M NaCl 200 mL溶液中，37℃，攪動10 h，PBS溶液反復(fù)沖洗后放在 100 mL 4%脫氧膽酸鈉溶液清除細(xì)胞碎片，37℃，攪動10 h，共進(jìn)行兩次。儲存在0.1%疊氮鈉-PBS溶液中, 加入雙抗溶液，密封，4℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

正常健康經(jīng)嚴(yán)格檢疫的大耳白兔48只，雄性，體重(2.5±0.5)kg，由天津醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3 移植手術(shù)過程

手術(shù)在天津市泌尿外科研究所動物手術(shù)室進(jìn)行。48只白兔采用隨機(jī)分組為3組并編號，每組16只。實(shí)驗(yàn)組1為DAM支架組；實(shí)驗(yàn)組2為BAM支架組；其余為對照組。 實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，兔子禁食、禁水，放入兔盒中，使用氯胺酮注射液和安定注射液1∶1混合液靜脈麻醉，按照1 mL/kg劑量從兔耳靜脈注射。麻醉后的兔子放在手術(shù)臺上，仰臥位，四肢用綁帶固定，調(diào)整好手術(shù)燈光，剪去兔子下腹部正中區(qū)域的兔毛。按外科手術(shù)的要求，術(shù)者穿上手術(shù)衣，戴上無菌手套，以2%碘酊和75%的酒精消毒，鋪無菌巾。取下腹部正中切口，切開毛皮，皮下組織及腹直肌，出血用細(xì)絲線結(jié)扎，徹底止血。從兩側(cè)拉開腹直肌，提起下方的腹膜，尖刀切一小口，進(jìn)入腹腔。剪開腹膜，分開腸管，在盆腔找到膀胱，用空針穿刺膀胱，抽出黃色較濃的液體，有兔尿氣味。選擇膀胱頂端血管分布較少的區(qū)域進(jìn)行，橫向剪一長約3 cm的切口，做成膀胱缺損模型。 實(shí)驗(yàn)組1用豬DAM基質(zhì)支架修補(bǔ)；實(shí)驗(yàn)組2用豬BAM基質(zhì)支架修補(bǔ)；對照組，直接縫合膀胱切口。使用3-0的羊腸可吸收線縫合膀胱切口。實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2的支架邊緣與膀胱切緣間斷縫合，基質(zhì)大小約2.5 cm×2.5 cm。四周縫合完畢后，用細(xì)針從膀胱下方穿入，注射生理鹽水充盈膀胱，漏水處給予加固縫合，并且在縫合處上下方縫合黑色絲線作為標(biāo)記。檢查腹腔內(nèi)的臟器無受損后，關(guān)閉腹腔，逐層縫合切口，手術(shù)結(jié)束。手術(shù)時間大約1 h。兔子麻醉蘇醒后，放回動物房飼養(yǎng)，手術(shù)在2周內(nèi)完成。手術(shù)步驟見圖1.1～圖1.6。

圖1.1 麻醉

圖1.2 穿刺抽尿

圖1.3 選取移植部位

圖1.4 準(zhǔn)備移植

圖1.5 縫合

圖1.6 縫合完畢

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

48只兔子完成手術(shù)，術(shù)后注射青霉素1周抗感染，當(dāng)有拉稀屎時，從口中灌注慶大霉素治療。每日觀察兔子的生長情況，精神狀態(tài)，飲食情況，排尿排便情況。 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：術(shù)后1、2、3周，1、2、3個月6個時間點(diǎn)使用氣栓法處死各組兔子，每組2只，共36只。處死后立即解剖，檢查腹腔內(nèi)臟器有無病變，觀察并取出膀胱，順黑色的標(biāo)記線找到縫合處，觀察形態(tài)、大小、顏色、瘢痕情況。切取縫合處膀胱組織作為標(biāo)本，行病理切片檢查。 死亡情況：實(shí)驗(yàn)組1：3只； 實(shí)驗(yàn)組2：3只；對照組：3只。因能完成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，死亡兔子不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。死亡原因主要是感染，其次為手術(shù)并發(fā)癥：膀胱破裂漏尿，出血等。

2.2 觀察膀胱標(biāo)本情況

1周的膀胱標(biāo)本支架與膀胱縫合處無特殊變化，縫線清晰可見。2周的標(biāo)本縫合處與周邊膀胱組織的界限模糊，支架開始收縮，面積減小。3周的標(biāo)本縫合處支架形成瘢痕組織，實(shí)驗(yàn)組2比實(shí)驗(yàn)組1要明顯。 1個月的標(biāo)本很難找到縫合處，縫合的羊腸線吸收，需借助黑色的標(biāo)記線尋找，縫合處抗張力強(qiáng)度較弱。 2個月的標(biāo)本可見支架逐漸被新生的膀胱組織取代，已修復(fù)如正常的膀胱外觀。同時2只支架內(nèi)腔面發(fā)現(xiàn)了結(jié)石顆粒。1只為實(shí)驗(yàn)組1，2只為實(shí)驗(yàn)組2。 3個月的標(biāo)本已經(jīng)找不到支架，支架已經(jīng)吸收的膀胱壁比較厚實(shí)。支架內(nèi)表面光滑，有肉眼可見的血管網(wǎng)，外表面觸之較粗糙。對照組的標(biāo)本觀察符合切口愈合修復(fù)過程。4只發(fā)現(xiàn)了結(jié)石顆粒，1只實(shí)驗(yàn)組1，2只實(shí)驗(yàn)組2，1只對照組。

2.3 膀胱標(biāo)本病理切片結(jié)果

1周時，基質(zhì)支架邊緣區(qū)域已有移行上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞長入基質(zhì)支架，其腔表面約有一半覆蓋泌尿上皮，支架的中心區(qū)域未見細(xì)胞，基質(zhì)支架與膀胱組織結(jié)合處出現(xiàn)紅細(xì)胞、白細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤。參見圖2.1～圖2.3。 2周時，支架邊緣區(qū)域已有大量移行上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞長入，移行上皮開始分層覆蓋在基質(zhì)支架上面，支架中心區(qū)域見少量細(xì)胞。參見圖2.4～圖2.6。 3周時，支架邊緣分層的移行上皮繼續(xù)分化，增殖，支架中心區(qū)域細(xì)胞增多。參見圖2.7～圖2.9。 1個月時，支架邊緣區(qū)域基本形成多層移行上皮細(xì)胞，與正常的泌尿上皮細(xì)胞差異不大，中心區(qū)域長滿移行上皮細(xì)胞，有少量白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤。參見圖2.10～圖2.12。 2個月時，植入的基質(zhì)支架已修復(fù)成正常的膀胱組織結(jié)構(gòu)，支架邊緣區(qū)域細(xì)胞密度最高，趨向中心減少。參見圖2.13～圖2.15。 3個月時，膀胱各層組織基本完全再生，基本完成膀胱組織的替代重建。參見圖2.16～圖2.18。

圖2.1 DAM組

圖2.2 BAM組

圖2.3 對照組

圖2.4 DAM組

圖2.5 BAM組

圖2.6對照組

圖2.7 DAM組

圖2.8 BAM組

圖2.9 對照組

圖2.10 DAM組

圖2.11 BAM組

圖2.12 對照組

圖2.13 DAM組

圖2.14 BAM組

圖2.15 對照組

圖2.16 DAM組

圖2.17 BAM組

圖2.18 對照組

3 討論

膀胱生物替代的研究可追溯到20世紀(jì)早期，Neuhof〔4〕首先在狗身上用游離筋膜作為移植物代替膀胱，進(jìn)行了膀胱擴(kuò)大成形術(shù)。此后，許多天然生物材料進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，所有這些移植物的應(yīng)用基于這樣一種概念移植物為膀胱組織生長提供支架，具有再生膀胱組織的能力。所應(yīng)用的材料包括皮膚、游離筋膜、冷凍膀胱、腹膜，大網(wǎng)膜、冷凍人腦膜、心包、胎盤、小腸粘膜下組織(SIS)和脫細(xì)胞基質(zhì)。由于尿液的復(fù)雜理化特性，將人工合成材料應(yīng)用于泌尿道特別困難。理想的膀胱擴(kuò)大材料應(yīng)具有生物可降解性，并且在一定的時間內(nèi)能被宿主自身組織取代吸收，能促進(jìn)正常泌尿移行上皮細(xì)胞和肌肉組織從其移植邊緣生長，能改善膀胱儲尿和排尿功能，而且材料本身要求制備方法簡單、植入手術(shù)容易、術(shù)后不易感染、不易形成結(jié)石、無致癌性，避免發(fā)生異物排斥反應(yīng)。

脫細(xì)胞基質(zhì)成為替代支架材料，最早起源于同種異體血管修補(bǔ)成形術(shù)。目前，脫細(xì)胞方法的設(shè)計(jì)思想主要是為了減少異種材料移植的免疫排斥反應(yīng)。制備過程需要有效地除去脂質(zhì)膜層和與之相關(guān)的抗原和可溶性蛋白，同時保留細(xì)胞外基質(zhì)成分的原始排列結(jié)構(gòu)〔5〕。到目前為止僅有少數(shù)脫細(xì)胞基質(zhì)支架用于臨床，進(jìn)一步完善現(xiàn)有支架并開發(fā)新支架將有希望成功地完成臨床部分或全膀胱替代。Prost等〔1〕使用BAM移植物用于膀胱擴(kuò)大術(shù)，由于材料取材于膀胱組織，與宿主的膀胱機(jī)械性能、結(jié)構(gòu)和遺傳特點(diǎn)均相似，經(jīng)處理后又明顯降低了抗原性，移植效果相當(dāng)滿意。

本實(shí)驗(yàn)中，使用了兩種源于豬的脫細(xì)胞基質(zhì)支架—DAM支架和BAM支架。通過動物實(shí)驗(yàn)來證明植入的異種支架可以為兔膀胱組織的替代重建提供適合細(xì)胞再生、分化、增殖的體內(nèi)環(huán)境和空間結(jié)構(gòu)，不僅可以擴(kuò)大、修復(fù)、重建膀胱組織，并且成功地完成了膀胱功能的替代。通過預(yù)先實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的不同時間取得的膀胱標(biāo)本進(jìn)行病理切片HE染色觀察，從中獲得了膀胱組織再生、重建的組織學(xué)變化過程的信息。在對照組，膀胱組織的再生僅表現(xiàn)為一般的傷口愈合和修復(fù)過程。在兩實(shí)驗(yàn)組之間組織學(xué)表現(xiàn)沒有明顯的差異性，說明DAM和BAM支架具有相同的性能。術(shù)后1周時，我們觀察到基質(zhì)支架邊緣有上皮細(xì)胞長入支架，其腔表面約有一半覆蓋泌尿移行上皮，支架中心區(qū)域未見細(xì)胞，支架與膀胱結(jié)合處出現(xiàn)紅細(xì)胞、白細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤，類似于創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)，僅有個別區(qū)域的平滑肌細(xì)胞浸潤到基質(zhì)支架，但無壞死區(qū)域，平滑肌細(xì)胞雜亂無方向，血管開始生成。這個現(xiàn)象與Sievert等〔6〕報(bào)道一致。Sutherland等〔7〕觀察到術(shù)后24 h內(nèi)，移植的支架就出現(xiàn)粒細(xì)胞浸潤。這些細(xì)胞可以清除細(xì)胞碎片，吞噬細(xì)菌，它們進(jìn)入移植邊緣吻合區(qū)域的過程與正常傷口愈合過程相一致。組織中巨噬細(xì)胞擴(kuò)增，分泌生長因子，刺激纖維母細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖。伴隨粒細(xì)胞浸潤，泌尿上皮細(xì)胞也顯著增殖，促進(jìn)血管生成。同時，Deboer等〔8〕在鼠膀胱移植中，觀察到術(shù)后4 h之內(nèi)開始出現(xiàn)上皮去分化，去分化過程和單核炎癥細(xì)胞浸潤同時發(fā)生。24 h形成附著的單層細(xì)胞，在3～5 d出現(xiàn)上皮分層。Wefer等〔9〕還報(bào)道，在2～3 d伴隨著成纖維細(xì)胞出現(xiàn)，支架中就出現(xiàn)大量的紅細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，同期還出現(xiàn)中心體，表明支架與宿主膀胱組織的開始融合，新生的細(xì)胞進(jìn)入支架。術(shù)后2周時，我們觀察到的支架邊緣區(qū)域已有大量移行上皮和平滑肌細(xì)胞長入，移行上皮細(xì)胞分層覆蓋在基質(zhì)支架上面，支架中心區(qū)域僅見少量細(xì)胞。我們觀察到3周時管腔表面排列多層泌尿上皮細(xì)胞，基質(zhì)支架再生的平滑肌仍缺乏組織化。直到1個月時，基質(zhì)支架邊緣的泌尿上皮繼續(xù)分化增殖，基本形成多層移行細(xì)胞結(jié)構(gòu)，覆蓋在基質(zhì)支架上面，與正常泌尿上皮細(xì)胞鏡下觀察差異不大，僅有少量白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，支架中心區(qū)域長滿移行上皮細(xì)胞，開始分層。在支架邊緣區(qū)域細(xì)胞密度最高，趨向中心逐漸減少。平滑肌細(xì)胞開始組織起來，成組排列，肌纖維穩(wěn)定，血管數(shù)量增加、增粗，血管壁逐漸分布平衡。Elbahnasy等〔10〕認(rèn)為，BAM與宿主膀胱組織的結(jié)合連接再生有兩種途經(jīng)，一種從支架邊緣細(xì)胞開始，一種從支架中心的細(xì)胞開始。術(shù)后2～3個月時，我們的結(jié)果顯示膀胱內(nèi)腔泌尿上皮完全分化、膀胱各層組織再生逐漸完成，再生的平滑肌立體排列重建，血管穩(wěn)定，血管數(shù)減少，但內(nèi)徑增大，有膀胱平滑肌的立體重建，基本完成膀胱組織的替代重建，膀胱功能基本恢復(fù)。

通過我們的組織學(xué)檢查表明，移植物中心區(qū)域缺乏很好的成熟泌尿上皮，形成的平滑肌纖維束比鄰近宿主組織的平滑肌纖維束要稀疏。這個發(fā)現(xiàn)與Li等研究〔11〕基本一致，表明新生平滑肌的形成和表現(xiàn)不同于宿主平滑肌，原因在于是隨機(jī)排列的，內(nèi)外層沒有明顯的進(jìn)行過排列組織過程。在正常逼尿肌組織中，平滑肌層沿著膀胱壁漿膜面很好的排列組織。造成這些差異可能與泌尿上皮有限的覆蓋范圍有關(guān)，說明了基質(zhì)—上皮相互作用影響對正常膀胱組織的形成是必需的〔12〕。

成功的膀胱替代擴(kuò)大術(shù)，重建必須限定在膀胱壁組織的各種成分在三維空間生長增殖和形成組織化。這就會引起自身組織的生物和機(jī)械功能變化。因此，支架必須要求提供最佳的結(jié)構(gòu)，滿足體內(nèi)細(xì)胞生長的需要，產(chǎn)生適當(dāng)?shù)募?xì)胞調(diào)控功能，并且要求有利于細(xì)胞附著，有利于肽和生長因子等生物反應(yīng)因子的分布傳遞〔13〕。Wu等〔14〕在大鼠體內(nèi)進(jìn)行了同種異體和異種(倉鼠、兔、狗和豬)的脫細(xì)胞材料的膀胱擴(kuò)大成形術(shù)，結(jié)果顯示越接近宿主膀胱壁結(jié)構(gòu)移植效果越好。

實(shí)驗(yàn)動物死亡原因進(jìn)行分析，感染致死是主要原因，因此感染問題是一個決定替代材料優(yōu)劣的重要因素。例如，Gleeson等〔15〕就定義了理想的泌尿器官的替代材料應(yīng)該具有良好的生物相容性和機(jī)械穩(wěn)定性，能夠抵御泌尿腔外感染和耐受腔內(nèi)尿液的感染。另一個致死原因是手術(shù)并發(fā)癥，如膀胱破裂漏尿，術(shù)后出血等。另外，基質(zhì)支架與膀胱組織的縫合方式也是需要探討的問題，本研究使用了間斷縫合方式，因?yàn)榛|(zhì)支架面積較小，四周與受體膀胱壁吻合后，術(shù)后不易脫落，不易漏尿，比較可靠，不足之處在于造成線結(jié)較多，以后形成較多瘢痕組織，也易成為結(jié)石核心。如果使用連續(xù)縫合方式，我們考慮到雖然手術(shù)時間短，線結(jié)少，對膀胱影響較小，瘢痕組織較少，但腸線斷開、脫落的可能性增加，造成嚴(yán)重的并發(fā)癥。我們解剖兔子的膀胱標(biāo)本時，觀察到有7只兔子不同程度的出現(xiàn)結(jié)石顆粒，雖然近期不影響到排尿，但長期會破壞支架，造成尿路梗阻、感染，影響到腎功能。Deboer等〔8〕認(rèn)為結(jié)石形成后，主要在尿液中漂浮，很少粘附到支架表面或與支架結(jié)合，在脫細(xì)胞基質(zhì)支架制備的開始前刮去了粘膜層，當(dāng)支架與尿液接觸后會釋放一些纖維成為結(jié)石形成的基本核心。此外，即使沒有感染，基質(zhì)支架粗糙表面在泌尿上皮覆蓋前也有利于結(jié)石形成。因此，制備脫細(xì)胞基質(zhì)支架時，避免形成結(jié)石也是我們今后要進(jìn)一步完善的內(nèi)容。

4 結(jié)論

雖然本實(shí)驗(yàn)的樣本數(shù)量有限，檢測的指標(biāo)較少，但通過移植手術(shù)，術(shù)后實(shí)驗(yàn)觀察，顯示出脫細(xì)胞基質(zhì)的生物替代效果是值得肯定的。本實(shí)驗(yàn)證明豬DAM和豬BAM支架都可作為異種支架進(jìn)行植入膀胱修復(fù)缺損，進(jìn)行膀胱擴(kuò)大成形，再生膀胱組織，重建有功能的膀胱，可成為膀胱組織再生替代的支架。豬DAM支架來源廣泛，費(fèi)用低廉，制備方法簡單，脫細(xì)胞效果確實(shí)，可以作為一種廣泛使用的生物替代材料，具有廣闊的應(yīng)用前景。