高溫加速陳化貯藏模型中工夫紅茶揮發(fā)性成分的變化規(guī)律

劉亞文，王凱茜，于飛，陳聰，陳淑娜，呂楊俊，朱躍進(jìn)，孔俊豪，楊秀芳，吳媛媛，何普明，屠幼英，李博

（1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院茶學(xué)系，浙江杭州310058；2.中華全國(guó)供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州310016）

紅茶是世界消費(fèi)量最大的茶類。工夫紅茶作為我國(guó)的傳統(tǒng)紅茶， 香氣是其重要的品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)。目前紅茶中已知香氣成分超過400 種，香型有薯香、花香、果香、甜香等多種類型[1]。和其他茶類一樣，紅茶在貯藏過程中，其內(nèi)含成分和感官風(fēng)味受外界因素（溫度、濕度、氧氣、光照、時(shí)間等）影響而改變，若貯藏不當(dāng)會(huì)加速降低紅茶品質(zhì)，造成湯色渾濁，香氣和滋味寡淡[2]。茶葉中的風(fēng)味化學(xué)物質(zhì)多是熱敏物質(zhì)， 在貯藏過程中溫度的影響尤為顯著[3]。

生產(chǎn)中多通過人工審評(píng)對(duì)茶葉香氣進(jìn)行定性分析，但存在主觀性大、容易受外部因素干擾等問題。通過定量分析借助統(tǒng)計(jì)模型能夠?qū)Σ枞~香氣進(jìn)行更加全面的描述和評(píng)價(jià)[4]。如通過對(duì)蘭花香及板栗香綠茶香氣及工夫紅茶香氣的定量描述分析模型， 能對(duì)茶葉香型進(jìn)行更為準(zhǔn)確的定義和評(píng)價(jià)[5]。李俊等[6]采用固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)， 對(duì)貴州各產(chǎn)區(qū)紅茶的主要呈香物質(zhì)和關(guān)鍵差異香氣成分進(jìn)行定量分析， 結(jié)果與感官審評(píng)所得的甜香、花香和高香結(jié)論基本一致。

目前與綠茶、白茶、黑茶相比，對(duì)紅茶品質(zhì)劣變的研究相對(duì)較少， 特別是對(duì)其揮發(fā)性成分貯藏變化規(guī)律的研究更為缺乏[7]。研究以祁紅和滇紅兩種典型工夫紅茶為研究對(duì)象， 采用高溫加速陳化貯藏模型， 研究工夫紅茶貯藏過程中揮發(fā)性成分的變化；利用多元變量分析尋找關(guān)鍵香氣化合物，以期為了解紅茶香氣品質(zhì)在貯藏中的變化規(guī)律提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

祁門紅茶，購(gòu)自祁門縣雙輝源茶廠，祁門櫧葉種，手工采摘，茶葉等級(jí)一級(jí)，生產(chǎn)日期為2018年4月19 日；云南大葉種紅茶，購(gòu)自云南鳳慶茶廠，茶葉等級(jí)一級(jí)，生產(chǎn)日期為2018年7月2 日。

1.2 儀器與設(shè)備

GCMS-QP2010SE 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本Shimadzu 公司），SH-Rxi-5Sil MS 氣相色譜柱（日本Shimadzu 公司），SPME 手動(dòng)進(jìn)樣手柄與50/30 μm DVB-CAR-PDMS 纖維萃取頭 （美國(guó)Supelco 公司），DK-S28 電熱恒溫水浴鍋 （上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司），AL104 電子天平 （瑞士Mettler toledo 公司），20 mL 精密螺紋玻璃瓶（德國(guó)CNW 科技公司），UV759S 紫外可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），5804R 離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司），Venticell 111 烘干機(jī) （德國(guó)MMM 公司），分光測(cè)色儀（美國(guó)HUNTERLAB 公司）， 智能光照培養(yǎng)箱 （寧波海曙萊福實(shí)驗(yàn)儀器廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品貯藏

將祁紅、滇紅兩種不同茶樣無(wú)包裝散放，分別置于40 ℃、50 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中（±0.1 ℃），避光貯存，培養(yǎng)箱相對(duì)濕度為30%～35%，分別于1、2、4、6、8、10 周取樣檢測(cè)。對(duì)照為室溫條件下無(wú)包裝散放的兩種茶樣，避光貯存。

1.3.2 香氣檢測(cè)

茶樣從恒溫培養(yǎng)箱中取出后立即處理檢測(cè)。將2 g 未經(jīng)研磨茶樣，以茶水比1∶3 向萃取瓶中注入沸水，密閉后放入60 ℃水浴中平衡5 min，插入已老化的萃取頭， 在60 ℃水浴中頂空吸附60 min，之后立即進(jìn)行GC-MS 分析。

GC 條件：氣相色譜柱為HP-INNOWAX 毛細(xì)管柱 （30 m，0.25 mm，0.25 μm）， 進(jìn)樣口溫度為250 ℃，進(jìn)樣后在250 ℃下解吸附3 min，載氣為高純He（純度＞99.999%），柱流速1.0 mL/min，進(jìn)樣方式為手動(dòng)無(wú)分流進(jìn)樣。升溫程序：50 ℃保持5 min，以3 ℃/min 上升至210 ℃，保持5 min，再以15 ℃/min 上升至230 ℃，保持5 min，總時(shí)間為69.67 min。

MS 條件：電離方式為EI，離子源溫度為230℃，電子能量為70 eV，掃描范圍為20～500 amu。電子倍增管電壓為1500 V， 總離子流強(qiáng)度為100 Ma[8]。

香氣物質(zhì)分析： 將采集到的總離子色譜圖進(jìn)行積分，得到的各組分在NIST17 質(zhì)譜庫(kù)中進(jìn)行檢索，篩選出匹配度大于85%的化合物，經(jīng)鑒定后采用面積歸一法計(jì)算各香氣成分相對(duì)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的方式表示，采用SPSS 26.0 進(jìn)行方差分析，SIMCA-P 14.1 軟件進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis OPLS -DA），Origin pro 2017 制作折線圖和熱點(diǎn)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 祁紅和滇紅在高溫加速陳化貯藏模型中香氣物質(zhì)種類的變化

茶葉香氣表現(xiàn)是各種揮發(fā)性成分綜合作用的結(jié)果，是衡量茶葉品質(zhì)的重要因子之一。紅茶具有獨(dú)特香型特征，香氣組分種類較多，包括碳?xì)浠衔?、醇類、酮類、酸類、醛類、酯類、酚酸類、過氧化物類、含硫化合物類、吡啶類、吡嗪類等，其中醇類、醛類、酯類構(gòu)成了祁紅主要的香氣物質(zhì)來(lái)源[9]。醇類化合物主要有脂肪族醇、 芳香族醇和萜烯醇3 大類， 具有花果香的萜烯醇是紅茶香氣中的重要成分。醛類化合物主要呈現(xiàn)花香或清香，而紅茶清香的形成主要與發(fā)酵程度有關(guān)。酯類化合物在紅茶中含量也相對(duì)較高，多呈花香[10]。祁紅和滇紅貯藏10 周后，醇類、醛類、酯類相對(duì)含量整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且在50 ℃時(shí)下降速率大于40 ℃，表明相對(duì)高溫下貯藏不利于香氣的保持見表1。

表1 在高溫加速陳化貯藏模型中祁紅、滇紅香氣物質(zhì)種類的相對(duì)含量變化（單位：%）Table 1 Change of aroma types of Keemun Black Tea and Yunnan Black Tea under the high temperature accelerated storage model （Unit：%）

2.2 OPLS-DA 模型分析不同貯藏條件下與初始茶樣香氣的差異

為探究具體香氣成分在工夫紅茶貯藏過程中的變化，采用OPLS-DA 模型分別研究祁紅和滇紅在不同貯藏條件下與初始茶樣香氣的差異。用VIP 值評(píng)價(jià)香氣成分對(duì)模型的貢獻(xiàn)度，VIP 值越大說明貢獻(xiàn)越大，以VIP 大于1 為篩選閾值。

2.2.1 祁紅不同溫度貯藏10 周后的香氣成分分析

采用OPLS-DA 模型對(duì)初始、無(wú)包裝自然存放10 周后、40 ℃貯藏10 周后、50 ℃貯藏10 周后祁紅茶樣香氣進(jìn)行分析，得分圖如圖1A 所示。貯藏后，自然存放和初始茶樣的散點(diǎn)距離最近，代表其相較于初始茶樣香氣變化最小。40 ℃和50 ℃貯藏后的散點(diǎn)距離初始距離都較遠(yuǎn)， 說明高溫加速陳化會(huì)使香氣成分發(fā)生較大的改變，且50 ℃散點(diǎn)距離初始的距離更遠(yuǎn)一些， 說明貯藏溫度高對(duì)香氣成分改變更大。40 ℃和50 ℃散點(diǎn)分布在坐標(biāo)軸的不同象限， 表明它們的香氣成分種類區(qū)別較大，不同溫度下貯藏會(huì)產(chǎn)生不同的香氣物質(zhì)。

圖1B 顯示， 該OPLS-DA 模型中VIP 大于1的共有64 種成分，其中香葉醇、β-紫羅蘭酮、苯甲醛、正己醛、芳樟醇及其氧化物、苯乙醇等均屬于祁紅特征性香氣。進(jìn)而單獨(dú)比較了在40 ℃和50℃下貯藏10 周后，祁紅相對(duì)于初始茶樣的香氣化合物變化，見表2，40 ℃貯藏10 周后有37 種香氣化合物VIP 值大于1，27 種VIP 值小于-1；50 ℃貯藏10 周后有43 種化合物VIP 值大于1，38 種VIP 值小于-1。芳樟醇、香葉醇、雪松醇、苯甲醇、苯乙醛、水楊酸甲酯、紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯等香氣特征物質(zhì)相對(duì)含量降低， 烷烴類物質(zhì)相對(duì)含量增加，但后者對(duì)香氣感官的貢獻(xiàn)度較低。

據(jù)報(bào)道，祁紅中相對(duì)含量較高（相對(duì)百分含量大于3%） 的香氣成分主要是香葉醇（閾值為3.2 ng/g）、苯乙醛（香氣閾值為4 μg/kg）、芳樟醇及其氧化物（香氣閾值為6 ng/g）、苯甲醇（香氣閾值為0.62 mg/ kg）和水楊酸甲酯[11]。香葉醇具有溫和、甜的玫瑰花氣息，是甜香的主要物質(zhì)基礎(chǔ)；氧化芳樟醇具有清甜的玫瑰花氣息；芳樟醇既有紫丁香、鈴蘭與玫瑰的花香，又有木香、果香氣息，是玫瑰香、果香的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[12]。苯乙醛具有濃郁的玉蘭花香氣，是構(gòu)成祁紅清鮮、果香的特質(zhì)基礎(chǔ)，也是祁紅的特征香氣成分[13]。水楊酸甲酯具有特殊的冬青葉味和薄荷味， 是促進(jìn)茶葉形成果香氣味的重要物質(zhì)。橙花醇是香葉醇的異構(gòu)體，具有令人愉快的玫瑰和橙花的香氣，較平和、微帶檸檬樣的果香，橙花醇香氣比香葉醇柔和優(yōu)美[14]。研究通過OPLS-DA 模型篩選，進(jìn)一步重點(diǎn)分析了變化顯著的祁紅典型香氣成分在整個(gè)貯藏過程中的變化趨勢(shì)，包括苯甲醛、2-己烯醛、苯乙醛、橙花叔醇、苯乙醇、苯甲醇、水楊酸甲酯、香葉醇、芳樟醇等9 種特征性香氣物質(zhì)。通過熱點(diǎn)圖圖1C 記錄貯藏1、2、4、6、8、10 周上述香氣含量可直觀發(fā)現(xiàn)， 苯甲醛、苯乙醛、苯甲醇、芳樟醇在不同貯藏溫度下均出現(xiàn)了先升高后降低的情況， 這可能也是貯藏初期感官品質(zhì)上升的部分原因。

2.2.2 滇紅不同溫度貯藏10 周后的香氣成分分析

OPLS-DA 模型得分圖圖2A 顯示，對(duì)初始、無(wú)包裝自然存放10 周后、40 ℃貯藏10 周后、50 ℃貯藏10 周后滇紅茶樣香氣進(jìn)行分析，和祁紅的實(shí)驗(yàn)結(jié)果大致一致， 自然存放的香氣變化最小，40 ℃和50 ℃貯藏下香氣成分變化較大，其中50 ℃貯藏變化更大。40 ℃和50 ℃貯藏產(chǎn)生的香氣成分差異較大。從得分圖散點(diǎn)的分布區(qū)域來(lái)看，祁紅和滇紅在高溫貯藏后產(chǎn)生變化的香氣成分種類較一致。在滇紅OPLS-DA 模型的香氣模型中 （圖2B），VIP 大于1 的共有70 種成分， 其中香葉醇、水楊酸甲酯、苯乙腈、苯甲醛、檸檬醛、芳樟醇及其氧化物、α-紫羅蘭酮、苯乙醇等均屬于滇紅特征性香氣成分，對(duì)滇紅品質(zhì)具有較大貢獻(xiàn)。進(jìn)而單獨(dú)比較了在40 ℃和50 ℃貯藏10 周后相對(duì)于初始滇紅茶樣的香氣化合物變化， 如表3 所示，40 ℃貯藏10 周后有30 種香氣化合物VIP 值大于1，24種VIP 值小于-1；50 ℃貯藏10 周后有31 種化合物VIP 值大于1，28 種VIP 小于-1；香葉醇、芳樟醇及其氧化物、水楊酸甲酯、α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、苯乙醇、橙花醇這些特征性香氣物質(zhì)相對(duì)含量明顯減少， 與香氣品質(zhì)負(fù)相關(guān)的1-甲基萘、烷烴類物質(zhì)相對(duì)含量增加。

云南工夫紅茶主要香氣物質(zhì)的組成包括醛類如正己醛、糠醛、青葉醛、（E，E）-2，4-庚二烯醛、苯甲醛、苯乙醛等，芳香族醇類如苯甲醇、苯乙醇類，萜醇類如芳樟醇、芳樟醇氧化物、α-松油醇、香葉醇等，酯類如β-紫羅蘭酮、內(nèi)酯類如二氫獼猴桃內(nèi)酯等， 這些香氣化合物是構(gòu)成云南紅茶香氣特征的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[15]。鳳慶紅茶產(chǎn)于云南鳳慶縣，其芳樟醇含量較高[16]。通過OPLS-DA 模型篩選， 進(jìn)一步分析變化顯著的滇紅典型香氣成分在整個(gè)貯藏過程中的變化趨勢(shì)，包括水楊酸甲酯、β-紫羅蘭酮、香葉醇、α-松油醇、芳樟醇、苯乙醇、苯甲醇、苯甲醛、正己醛9 種特征性香氣物質(zhì)。通過熱點(diǎn)圖（圖2C）記錄貯藏1、2、4、6、8、10 周上述香氣含量發(fā)現(xiàn)除β-紫羅蘭酮外，其他8 種香氣成分在不同貯藏溫度下均出現(xiàn)了先升高后降低的趨勢(shì)， 表明這些化合物可能都對(duì)滇紅貯藏前期感官品質(zhì)的提高有一定貢獻(xiàn)。

3 結(jié)論

香氣作為工夫紅茶品質(zhì)特征的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，已受到越來(lái)越多的關(guān)注[17-18]。以祁紅和滇紅作為工夫紅茶的代表研究對(duì)象， 通過高溫加速陳化模型， 研究40 ℃和50 ℃高溫貯藏條件下香氣的變化。結(jié)果表明在貯藏過程中工夫紅茶香氣成分發(fā)生顯著變化，貯藏10 周后醇類、醛類、酯類相對(duì)含量整體呈下降趨勢(shì)。但在貯藏過程中，苯甲醛、苯乙醛、苯甲醇、苯乙醇、芳樟醇、水楊酸甲酯、香葉醇、α-松油醇、正己醛等和品質(zhì)正相關(guān)的香氣成分的相對(duì)含量都有先升高后降低的趨勢(shì)。這可能可以部分解釋工夫紅茶的香氣品質(zhì)在貯藏初期有所上升，之后又下降的現(xiàn)象。研究為今后探討工夫紅茶在不同貯藏條件下香氣成分的變化規(guī)律提供參考。

圖1 貯藏后祁紅的香氣成分OPLS 分析Fig. 1 Aroma OPLS analysis of the Keemun Black Tea after storage

表2 貯藏后祁紅和初始茶樣比較的香氣貢獻(xiàn)VIP 表Table 2 VIP plot for the volatile compound contribution of the initial and storaged Keemun Black Tea

圖2 貯藏后滇紅的香氣成分OPLS 分析Fig. 2 Aroma OPLS analysis of the Yunnan Black Tea after storage

表3 貯藏后滇紅和初始茶樣比較的香氣貢獻(xiàn)VIP 表Table 3 VIP plot for the volatile compound contribution of the initial and storaged Yunnan Black Tea