CRISPR-Cas13a抑制RNA病毒的多靶標基因編輯技術(shù)構(gòu)建

解屹 徐翔 葛明 張萬紅 黃坤 江連強 趙世民 王玉潔 彭子忠 廖成 楊金廣 王鳳龍

摘 要：CRISPR-Cas適應(yīng)性免疫系統(tǒng)為細菌和古細菌免受外來核酸和噬菌體的侵害提供了保護。其中2類VI-A型CRISPR-Cas效應(yīng)子Cas13a（之前稱為C2c2），可受CRISPR RNA的引導(dǎo)，靶向切割與原始間隔區(qū)反向互補的單鏈RNA。本研究利用CRISPR-Lsh-Cas13a系統(tǒng)，多靶標編輯煙草花葉病毒（TMV）RdRP、MP和CP基因，以抑制病毒在寄主煙草體內(nèi)的侵染與擴散，從而達到保護寄主的作用。該系統(tǒng)在瞬時表達測定中表現(xiàn)出對野生型TMV-U1和表達綠色熒光蛋白的TMV-30b的干擾以及對病毒累積和病毒病癥狀的抑制。靶向TMV RdRP基因的CRISPR RNA表現(xiàn)出比靶向MP和CP基因更好的編輯效能。經(jīng)過適當設(shè)計的CRISPR-Lsh-Cas13a系統(tǒng)被賦予了廣譜抗性，可以特異性編輯多種TMV菌株。研究表明，CRISPR-Cas13a系統(tǒng)可以用于針對RNA病毒的抑制干擾。

關(guān)鍵詞：基因編輯;CRISPR-Cas13a;煙草花葉病毒;病毒防控;多靶標編輯

Abstract： The CRISPR-Cas adaptive immune system provides protection for bacteria and archaea from foreign nucleic acids and bacteriophages. In the CRISPR-Cas adaptive immune system， two classes of the VI-A CRISPR-Cas effector Cas13a （previously called C2c2） can be guided by CRISPR RNA to target and then cut the single-stranded RNA that is reversely complementary to the protospacers. In this study， the CRISPR-Lsh-Cas13a system was used for the multi-target editing of RdRP， MP， and CP genes of Tobacco mosaic virus （TMV） to protect the host from infection and spread of the virus. This system showed interference with wild-type TMV-U1 and TMV-30b expressing green fluorescent proteins in transient expression assays， as well as suppression of virus accumulation and viral disease symptoms. The CRISPR RNA targeting TMV RdRP gene showed better editing efficiency than that targeting MP and CP genes. The appropriately designed CRISPR-Lsh-Cas13a system was endowed with broad-spectrum resistance and can specifically edit a variety of TMV strains. This study showed that the CRISPR-Cas13a system can be used for the suppression and interference against RNA viruses.

Keywords： gene editing; CRISPR-Cas13a; tobacco mosaic virus; virus prevention and control; multi-target editing

植物RNA病毒種類繁多，其中最具代表性的煙草花葉病毒TMV（Tobacco mosaic virus）富有極強的侵染性、抗逆性和危害性，寄主范圍十分廣泛，可侵染150余屬350余種植物[1]，包括煙草、番茄、馬鈴薯、菠菜等多種作物。一旦發(fā)病會造成大規(guī)模擴散感染，導(dǎo)致作物產(chǎn)量、品質(zhì)嚴重下降，從而造成嚴重的經(jīng)濟損失[2]。據(jù)報道，世界各地每年因TMV侵染作物造成的經(jīng)濟損失超過1億美元[3]。TMV可從微傷口處侵染寄主。發(fā)病初期，寄主新葉葉脈及周圍葉肉組織出現(xiàn)半透明明脈癥狀;進而病毒持續(xù)復(fù)制增殖，嚴重干擾寄主自身細胞分裂，導(dǎo)致葉片厚薄不均、畸形、皺縮，并呈現(xiàn)典型的花葉癥狀，植株也隨之生長遲緩，呈現(xiàn)矮化、節(jié)間縮短等癥狀，侵染嚴重的植株逐漸壞死凋亡。TMV基因組為一條線性正義ssRNA，全長約6395個核苷酸，病毒質(zhì)粒為大小約300 nm×18 nm的桿狀體，擁有4個開放式閱讀框（ORF）[4]，分別編碼相對分子質(zhì)量為126、183 kDa的復(fù)制酶，17.5 kDa的外殼蛋白以及30 kDa的運動蛋白[5]。

針對TMV的常規(guī)防治措施常存在見效慢、防治效果低、經(jīng)濟成本高、不具廣譜抗性等弊端，且化學藥劑的使用極易引起農(nóng)殘超標、病毒變異加速等問題。因此，亟需開發(fā)高效、環(huán)保、具備廣譜抗性的病毒防治技術(shù)以應(yīng)對這一世界農(nóng)業(yè)難題。近年來隨著基因編輯技術(shù)的興起與發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)利用基因編輯技術(shù)可以針對植物病毒基因組特定基因進行高效修飾與改造，抑制植物病毒在寄主體內(nèi)的擴繁與侵害，從而達到高效、經(jīng)濟、環(huán)保防控病毒病的目的。隨著對于各項基因編輯技術(shù)的篩選與淘汰，CRISPR-Cas系統(tǒng)逐漸被人們熟知與接受。

簇狀規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列與相關(guān)聯(lián)的Cas蛋白組成的CRISPR-Cas適應(yīng)性免疫系統(tǒng)可在分子水平上為細菌和古細菌抵抗核酸和噬菌體等外來遺傳因素的侵害，提供自身免疫保護能力。建立這種適應(yīng)性免疫反應(yīng)需要3個步驟：1.適應(yīng)，CRISPR陣列會攝取入侵遺傳因素基因組并整合至自身，形成間隔區(qū);2. CRISPR RNA（crRNA）的加工和生物發(fā)生，在轉(zhuǎn)錄CRISPR陣列后生成的前crRNA可被Cas核酸內(nèi)切酶加工形成成熟的crRNA，成熟crRNA可與Cas蛋白結(jié)合形成“效應(yīng)子”復(fù)合物，組成完整的CRISPR-Cas適應(yīng)性免疫系統(tǒng);3.對入侵遺傳因素的干擾，入侵者基因組一旦與crRNA間隔區(qū)存在足夠的堿基對互補性，互補區(qū)域就被視為靶標區(qū)域，crRNA牽引Cas蛋白至靶標區(qū)域，利用Cas蛋白的核酸酶性質(zhì)，對目的核酸進行裂解，從而完成對細菌或古細菌的免疫保護工作。已有大量研究發(fā)現(xiàn)，通過人為適當?shù)卦O(shè)計crRNA，CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以切割病毒基因組的雙鏈DNA，并賦予植物對該病毒的高效抗性。關(guān)于CRISPR-Cas系統(tǒng)新領(lǐng)域開發(fā)方向更多地轉(zhuǎn)向RNA編輯，以期為植物RNA病毒的防治研究提供更多的實驗依據(jù)。二類VI型CRISPR-Cas13系統(tǒng)是迄今為止于CRISPR家族中發(fā)現(xiàn)的僅靶向于ssRNA的系統(tǒng)[6]，根據(jù)自身結(jié)構(gòu)差異可分為Type VI-A、Type VI-B、Type VI-C和Type VI-D 4個亞型，其中以A亞型CRISPR-Cas13a研究居多。

CRISPR-Cas13a系統(tǒng)自發(fā)現(xiàn)、提出至今，已在植物分子抗病蟲害領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但在煙草防控植物病毒方面，關(guān)于該系統(tǒng)定向降解侵染病毒基因組以抑制病毒侵染危害的研究尚且較少。AMAN[7]和SHARMA[8]等分別于2018年和2021年，通過在本氏煙中表達CRISPR-Cas13a系統(tǒng)以驗證其對外侵蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）的干擾效果。兩項試驗結(jié)果均表明，CRISPR-Cas13a系統(tǒng)可以通過靶向降解病毒基因組，抑制病毒在寄主體內(nèi)的侵染與繁殖，一定程度實現(xiàn)對病毒積累的負調(diào)控作用。本研究基于明確CRISPR-Cas13a系統(tǒng)定向編輯RNA機制，構(gòu)建了可用于多靶標編輯TMV基因組的新型CRISPR-Lsh-Cas13a表達載體，驗證該系統(tǒng)針對TMV的基因編輯效能與抑制成效，以期為植物RNA病毒的防治提供科學、可靠的科學理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙草品種為本氏煙草（Nicotiana benthamiana）和枯斑三生煙（Nicotiana tabacum var. Samsun NN）。播種發(fā)芽后移栽至盛有營養(yǎng)基質(zhì)土的一次性塑料杯中，培養(yǎng)于晝夜周期為16 h/8 h、相對濕度60%、光合有效輻射為100 μmol/（m2·s）的人工氣候室中。TMV-U1、TMV 30b毒源由本實驗室保存并提供，Lsh-Cas13a表達載體由湖北大學生命科學學院提供[9]。

1.2 CRISPR-Cas13a新型表達載體構(gòu)建

NCBI Genbank搜集38種不同株系TMV RdRP、MP、CP基因，利用DNAMAN軟件篩選各基因保守序列，結(jié)合原始間隔區(qū)核苷酸識別偏好性原則（sgRNA對于靶位點3'相鄰的首個核苷酸表現(xiàn)出對A，U或C的嚴格偏好而不是G，靶位點側(cè)翼存在G核苷酸時會顯著降低HEPN核酸酶活性，而A，U和C會導(dǎo)致HEPN核酸酶發(fā)揮最大活性），于篩選的保守序列區(qū)域選取28 nt靶基因序列，將其反向互補得到sgRNA。crRNA DR區(qū)域莖環(huán)結(jié)構(gòu)，選擇9-nt為其環(huán)，序列設(shè)計為AATATCGAA;5個Watson-Crick堿基對為其莖，序列設(shè)計為ACCCC/GGGGU。莖上的2-nt凸起選擇AC，插于莖的3'核苷酸GU之間;莖環(huán)結(jié)構(gòu)上游5'單鏈區(qū)只設(shè)置一個胞嘧啶（C），下游設(shè)置5 nt 3'單鏈區(qū)，序列設(shè)計為AAAAC;在間隔區(qū)3'添加oligo （A） rich tails作為核出口的信號，以及RNA pol III終止子TTTTTT。綜上，將序列按照莖環(huán)5'側(cè)翼單鏈、莖環(huán)結(jié)構(gòu)、莖環(huán)3'側(cè)翼單鏈、sgRNA的先后順序依次組裝成完整的crRNA，選用U6啟動子啟動轉(zhuǎn)錄。將3個“U6+crRNA”序列串聯(lián)，基于Cas13a表達載體pLsh-Cas13a酶切位點Sac II于串聯(lián)序列兩端添加相應(yīng)“同源臂”序列，送往山東賽恩斯科技有限公司合成。合成序列采用一步克隆法連接至pLsh-Cas13a載體，得到基因編輯重組載體pLsh-Cas13a-TMV。重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α（TransGen Biotech）。挑取單克隆，測序，陽性克隆轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞 LBA4404（TransGen Biotech）。本試驗引物合成及測序均由派森諾生物科技有限公司完成。陽性對照試驗所用載體pLsh-Cas13a-PDS（針對編輯本氏煙PDS基因）構(gòu)建方法同上。本方法所用引物詳見表1。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 本氏煙、枯斑三生煙重組載體瞬時表達 挑取農(nóng)桿菌單克隆接種至含有kana、利福平的液體LB培養(yǎng)基，28 ℃ 200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～72 h。農(nóng)桿菌菌液1500 g離心5 min，棄去上清。重懸沉淀菌體至OD600=0.8，黑暗靜置3 h。利用無菌注射器將pLsh-Cas13a-TMV重懸菌液緩慢注入4周齡的本氏煙、枯斑三生煙背面，作為處理組葉片，并設(shè)置4個技術(shù)重復(fù);將pLsh-Cas13a（質(zhì)粒載體上無crRNA）重懸菌液緩慢注入本氏煙、枯斑三生煙處理組葉片下方第一片葉片中，作為陰性對照組葉片，并設(shè)置4個技術(shù)重復(fù);將pLsh-Cas13a-PDS、pLsh-Cas13a重懸菌液緩慢注入4周齡本氏煙葉片，作為陽性對照組葉片，設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)。試驗組所有材料均培養(yǎng)于人工氣候室中。

1.3.2 機械摩擦接毒 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后第3天，取1 g野生型TMV-U1毒源葉片，1 g TMV-30b毒源葉片，置于滅菌的研缽中，加入80 mL PBS緩沖液（pH 6.8）研磨成漿，紗布過濾除去葉片殘渣獲得懸浮液進行病毒機械摩擦接種。利用棉棒將TMV-30b懸浮液輕輕涂抹于撒有石英砂的本氏煙處理組、陰性對照組葉片正面，將野生型TMV-U1懸浮液輕輕涂抹于撒有石英砂的枯斑三生煙正面，接毒植株置于人工氣候室光照培養(yǎng)。

1.3.3 病毒生物學測定 本氏煙試驗組機械摩擦接毒后第5天，紫外（UV）光下統(tǒng)計處理組、陰性對照組接毒葉片中綠色熒光蛋白信號強度（點數(shù)或面積），對比數(shù)據(jù)估測CRISPR-Lsh-Cas13a系統(tǒng)基因編輯效能?？莅呷鸁煓C械摩擦接毒后第3天，統(tǒng)計處理組、陰性對照組接毒葉片枯斑數(shù)量，對比數(shù)據(jù)估測CRISPR-Lsh-Cas13a系統(tǒng)基因編輯效能。

1.3.4 相對熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測分析 采用TRIzol法提取處理組、陰性對照組葉片總RNA，HiScriptII Q Select RT SuperMix for qPCR（Vazyme）反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以各樣品cDNA為模板，本氏煙actin為內(nèi)參基因，參照AceQ qPCR SYBR? Green Master Mix（Vazyme）試劑盒說明配置反應(yīng)體系，置于Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system進行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán);95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量，獨立樣本T檢驗法進行數(shù)據(jù)差異性檢驗分析。本方法所用定量檢測引物詳見表1。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）分析 采集枯斑三生煙處理組、陰性對照組葉片，液氮速凍后置于液氮預(yù)冷的研缽研磨至粉末。取1 g研磨物裝于液氮預(yù)冷的潔凈離心管中，加入1 mL事先預(yù)冷的蛋白裂解液（北京康為世紀生物科技有限公司），上下翻轉(zhuǎn)混勻，冰面靜置30 min，低溫離心15 min，吸取上清液至另一液氮預(yù)冷離心管，得到植物總蛋白。通過SDS-PAGE電泳和100 V濕法轉(zhuǎn)膜90 min，將聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）先置于含5%牛血清蛋白的TBST中封閉1 h，再置于含有TMV抗體和actin抗體緩沖液中，4 ℃孵育過夜。次日將PVDF膜置于二抗緩沖液中室溫孵育1 h，放入凝膠成像儀載物臺，加入化學發(fā)光液，發(fā)光成像。

2 結(jié) 果

2.1 CRISPR-Cas13a表達載體構(gòu)建與功能驗證

2.1.1 靶序列選取、串聯(lián)序列及重組載體獲得 本研究選取TMV基因組序列第941位至968位堿基（28個）、第5227位至5254位堿基（28個）、第5991至6018位堿基（28個）分別作為編輯TMV RdRp、MP、CP的靶序列，選取本氏煙PDS表達基因序列第356位至383位堿基（28個）、第557位至第584位堿基（28個）作為編輯PDS的靶序列。按照設(shè)計方案完成crRNA組裝與crRNA序列串聯(lián)（圖1 a-c），pLsh-Cas13a-TMV和pLsh-Cas13a-PDS質(zhì)粒圖譜（圖2 a-b）如下。本載體選用可以加強基因表達的pUBQ 10啟動子高效表達Lsh-Cas13a蛋白，載體抗性基因為卡那霉素抗性基因。

2.1.2 重組載體構(gòu)建驗證與分析 對兩個重組載體crRNA進行PCR測序分析。結(jié)果如下圖（圖3 a-e），5個crRNA堿基測序結(jié)果與設(shè)計一致，峰圖未出現(xiàn)雙峰情況，證明兩段串聯(lián)序列準確連接至pLsh-Cas13a，pLsh-Cas13a-TMV與pLsh-Cas13a-PDS構(gòu)建成功。對將pLsh-Cas13a-TMV、pLsh-Cas13a-PDS、pLsh-Cas13a導(dǎo)入的大腸桿菌菌液進行菌液PCR測試，瓊脂糖凝膠電泳條帶（圖3 f）與預(yù)期大小一致，分別為1320、1037和4953 bp，表明3種質(zhì)粒均已成功導(dǎo)入，可用于后續(xù)試驗。

2.1.3 重組載體功能驗證與分析 本試驗設(shè)置陽性對照組，選擇本氏煙基因組中PDS表達基因作為CRISPR-Lsh-Cas13a基因編輯系統(tǒng)的目的基因進行編輯，觀察是否有白化或類白化現(xiàn)象發(fā)生，作為載體功能正常性依據(jù)。陽性對照組葉片瞬時表達pLsh-Cas13a-PDS、pLsh-Cas13a后第7天觀察處理葉片的形態(tài)變化，如圖4所示，瞬時表達pLsh-Cas13a-PDS的處理葉片不同程度出現(xiàn)類白化現(xiàn)象，而瞬時表達pLsh-Cas13a的對照葉片未出現(xiàn)白化或類白化現(xiàn)象。上述試驗結(jié)果證明重組載體功能正常。

2.2 本氏煙、枯斑三生煙試驗組病毒生物學測定

如圖5 a-b所示，本氏煙處理組樣品接毒葉片中的綠色熒光蛋白信號強度遠遠小于陰性對照組樣品接毒葉片。據(jù)統(tǒng)計，處理組4個接毒葉片與陰性對照組4個接毒葉片的綠色熒光蛋白信號比值約為1：10.44，差異顯著（p<0.05）。如圖5 c-f所示，枯斑三生煙處理組樣品接毒葉片正、背兩面枯斑數(shù)量遠遠小于陰性對照組樣品接毒葉片正、背兩面的枯斑數(shù)量。據(jù)統(tǒng)計，處理組4個接毒葉片與陰性對照組4個接毒葉片的枯斑數(shù)量比值約為1∶11，差異顯著（p<0.05）。

上述結(jié)果表明，在葉片中瞬時表達CRISPR-Lsh-Cas13a基因編輯系統(tǒng)的處理組樣品對于TMV的抑制效率遠遠高于僅表達Lsh-Cas13a蛋白的陰性對照組樣品，證明CRISPR-Lsh-Cas13a基因編輯系統(tǒng)能夠起到良好的TMV抑制效率，也說明Cas13a蛋白只有依賴于crRNA才能發(fā)揮其核酸內(nèi)切酶活性。

2.3 qRT-PCR病毒基因水平檢測及分析

為進一步證實CRISPR-Lsh-Cas13a基因編輯系統(tǒng)可以有效抑制TMV在寄主體內(nèi)的侵染，利用qRT-PCR對本氏煙、枯斑三生煙兩試驗組接毒葉片中的病毒基因相對表達量進行測定。結(jié)果如圖6-7所示。本氏煙試驗組，相比于陰性對照組4個接毒葉片中TMV-30b CP基因的表達量（陰性對照值設(shè)為1），處理組4個接毒葉片中TMV-30b CP相對表達量約為0.134 4，差異極顯著（p<0.01），可見CRISPR-Lsh-Cas13a系統(tǒng)針對TMV-30b抑制效率為86.56%?？莅呷鸁熢囼灲M，相比于陰性對照組4個接毒葉片中TMV-U1 RdRp基因、MP基因和CP基因的表達量（陰性對照值均設(shè)為1），處理組4個接毒葉片中TMV-U1 RdRp、MP和CP基因的相對表達量分別約為0.049 6、0.097 1和0.136 2，差異分別為極顯著（p<0.01）、顯著（p<0.05）和顯著（p<0.05），可見CRISPR-Lsh-Cas13a系統(tǒng)針對TMV-U1抑制效率為86.38%。

上述數(shù)據(jù)可明顯體現(xiàn)CRISPR-Lsh-Cas13a系統(tǒng)對于病毒的抑制趨勢，在葉片中瞬時表達CRISPR-Lsh-Cas13a系統(tǒng)的處理組樣品可對TMV產(chǎn)生高效抑制作用，對TMV基因組的積累起到了顯著負調(diào)控作用，從而實現(xiàn)自身針對TMV侵染與復(fù)制的抑制，保護自身免受病毒侵害。

2.4 Western Bolt蛋白水平驗證與分析

Western Blot檢測結(jié)果（圖8）顯示，接毒3 d后，枯斑三生煙處理組葉片與陰性對照組葉片中均檢測到TMV，但處理組葉片TMV蛋白含量明顯少于陰性對照組葉片。此數(shù)據(jù)可輔證2.2、2.3結(jié)果。

3 討 論

自適應(yīng)免疫CRISPR-Cas系統(tǒng)已被用作包括植物在內(nèi)各種系統(tǒng)的強大基因組編程工具[10]。其中，CRISPR-Cas13系統(tǒng)初步應(yīng)用于針對RNA病毒基因組的編輯工作。CRISPR-Cas13系統(tǒng)可以利用其sgRNA與病毒基因組目的基因具有同源性的特點與其特異性結(jié)合成為雙鏈，crRNA引導(dǎo)具有核酸酶屬性的Cas13蛋白移動至目的基因處，進行特異性切割、降解，從而達到針對病毒基因組進行編輯的目的，抑制其對于寄主的復(fù)制與侵染。與傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)（如ZFNs、TALENs等）相比，CRISPR-Cas13基因編輯技術(shù)操作性更簡便，對于目的基因的編輯更為精準高效，脫靶率低，試驗周期短且無物種限制，因此備受科學界的關(guān)注與認可。

本研究利用CRISPR-Lsh-Cas13a基因編輯系統(tǒng)針對TMV基因組的編輯效能及病毒抑制效果進行驗證試驗，結(jié)果表明，CRISPR-Lsh-Cas13a可以介導(dǎo)對TMV的分子干擾。靶向編輯、降解侵染本氏煙的TMV 30 b（攜帶GFP標簽） CP基因可以導(dǎo)致GFP水平降低，從而在受侵葉片中檢測到GFP信號減少;靶向編輯、降解侵染枯斑三生煙的野生型TMV不同基因組區(qū)域可以有效減少病毒含量，從而降低形成的枯斑數(shù)量。病毒生物學測定試驗表明CRISPR-Lsh-Cas13a基因編輯系統(tǒng)具有編輯、降解和抑制植物寄主植物中TMV的作用。

在基因水平和蛋白水平上進一步驗證了該系統(tǒng)對于TMV的編輯效能及抑制作用。兩試驗組中，處理組相較于陰性對照組，TMV各蛋白基因相對表達量均減少86%以上。Western Blot TMV蛋白檢測結(jié)果顯示，處理組葉片TMV蛋白含量明顯少于陰性對照組葉片?；蛳鄬Χ考安《镜鞍缀繙y定數(shù)據(jù)表明，CRISPR-Lsh-Cas13a基因編輯系統(tǒng)可以高效編輯TMV基因組不同蛋白表達基因，有效抑制TMV在寄主中的復(fù)制與傳播，這為工程化創(chuàng)制天然抗TMV轉(zhuǎn)基因植株和抗性發(fā)揮提供了實驗依據(jù)。

在驗證試驗中發(fā)現(xiàn)，靶向TMV RdRp基因的編輯效能最好，MP基因的編輯效能次之，對于CP基因的編輯效能相對最差。這表明，排除其他未被研究發(fā)現(xiàn)的因素外，靶標RNA內(nèi)的二級結(jié)構(gòu)或者RNA結(jié)合蛋白的存在或許會影響編輯系統(tǒng)的可及性，從而影響Lsh-Cas13a在靶標RNA上的活性，降低編輯效能。這一觀察結(jié)果與Abudayyeh等[11]的研究結(jié)果相一致，他們在天然環(huán)境中表征了Lsh-Cas13a的活性，并發(fā)現(xiàn)最有效的crRNA位于強干擾區(qū)域，成簇狀存在，且最靠近靶標RNA，這表明crRNA接近靶標RNA的難易程度確實會對Lsh-Cas13a的活性產(chǎn)生影響。此外，來自Cas13a家族的其他Cas13a同系物，例如Lwa-Cas13a，也表現(xiàn)出相同的現(xiàn)象[12]。這些研究表明，RNA靶位點的篩選和crRNA效率的研究探索可能對于Cas13a活性最大化以及CRISPR-Cas13a系統(tǒng)的編輯效能至關(guān)重要。此外，或存在其他機制制約CRISPR-Cas13a系統(tǒng)接近靶標及其效率發(fā)揮，仍需更多研究揭示這些潛在機制。目前可以通過不同方法來提升CRISPR-Cas13a系統(tǒng)對于植物病毒基因組的編輯效能，從而實現(xiàn)更高效的病毒防控力。例如本研究創(chuàng)新的病毒基因組多重靶標聯(lián)合編輯方法，在更多區(qū)域內(nèi)對植物病毒基因組實施干擾編輯，更大程度上抑制病毒在寄主體內(nèi)的復(fù)制與傳播;再者可以使用某些蛋白質(zhì)穩(wěn)定性融合物（例如msfGFP），其可與Cas13蛋白融合以增強穩(wěn)定性和催化活性;也可以使用具有更強大的RNA引導(dǎo)核糖核酸酶活性的Cas13變體，降低靶標可及性帶來的負面影響。

4 結(jié) 論

本研究利用CRISPR-Lsh-Cas13a基因編輯系統(tǒng)的作用機制，構(gòu)建了可在煙草中穩(wěn)定表達的CRISPR-Lsh-Cas13a功能載體，并于本氏煙和枯斑三生煙中實現(xiàn)了針對TMV的高水平抗性。其次利用多靶標編輯的概念，強化植物病毒的基因組編輯效能和抑制作用。此結(jié)果為更好地防控植物RNA病毒提供了理論支撐和科學依據(jù)。

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