煙草青枯病發(fā)病土壤理化性狀及細菌群落結(jié)構(gòu)分析

樊俊 譚軍 王瑞 鄧建強 張繼光 徐大兵 施河麗 向必坤

摘 要：為了解土壤理化性狀及細菌群落結(jié)構(gòu)與青枯病發(fā)生的關(guān)系，在湖北恩施典型煙區(qū)采集了160個植煙土壤（82個未發(fā)病土壤，78個發(fā)病土壤），檢測了土壤理化指標，并采用16S rRNA基因測序技術(shù)分析了煙株發(fā)病與未發(fā)病根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的差異。結(jié)果表明：（1）與未發(fā)病土壤相比，發(fā)病土壤細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性更高。（2）發(fā)病土壤勞爾氏菌屬（Ralstonia solanacearum）相對豐度顯著高于未發(fā)病土壤，而鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）相對豐度則相反。（3）青枯病的發(fā)生使土壤微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更復(fù)雜而穩(wěn)定性降低，并改變了部分核心點位細菌種類。（4）典范對應(yīng)分析（CCA）表明，土壤pH和速效磷（AP）可能是影響煙草青枯病發(fā)生的重要土壤因子。綜上所述，土壤pH、AP與細菌Sphingomonas、Arthrobacter、Pseudomonas相對豐度的增加和Ralstonia相對豐度的降低可能是減少煙田青枯病發(fā)病的關(guān)鍵因素。

關(guān)鍵詞：土壤;煙草;青枯病;細菌;群落結(jié)構(gòu);網(wǎng)絡(luò)分析

Abstract： In order to understand the relationship between soil physical and chemical properties， bacterial community structure and bacterial wilt， the physical and chemical indexes of 160 tobacco growing soils （82 rhizosphere soils of non-infected and 78 rhizosphere soils infected by bacterial wilt） were tested， and 16S rRNA gene sequencing technology was used to analyze the differences of bacterial community structure of the soils. The results showed that： （1） Compared with non-infected soils， the diversity of soil bacterial increased with the infection of tobacco bacterial wilt. （2） The relative abundance of Ralstonia was significantly improved in the rhizosphere soils infected by bacterial wilt， while Sphingomonas， Arthrobacter and Pseudomonas were of the opposite?effects. （3） The complexity of microbial network structure was enhanced， while the stability decreased and the type of bacteria at the core point changed in rhizosphere soils with the infection of tobacco bacterial wilt. （4） CCA analysis indicated that soil pH and available phosphorus （AP） were the important factors affecting the occurrence of bacterial wilt. In conclusion， the increase of soil pH， AP and relative abundance of Sphingomonas， Arthrobacter， Pseudomonas and the decrease of Ralstonia might be the key factors to reduce the incidence of bacterial wilt in tobacco field.

Keywords： soil; tobacco; bacterial wilt; bacterial; community?structure; network analysis

勞爾氏菌（Ralstonia solanacearum）是一種土傳細菌，具有廣泛的寄主范圍，可侵染50多科450余種植物[1]，其引起的煙草青枯?。═obacco bacterial wilt）是危害我國煙草生產(chǎn)的主要病害之一。青枯勞爾氏菌通過根部傷口、根尖或次生根侵染煙株，最終定殖于木質(zhì)部，繼而產(chǎn)生大量的胞外多糖堵塞維管束組織，造成葉片萎蔫、發(fā)黃壞死，最終導(dǎo)致煙株死亡[2]。我國煙區(qū)青枯病發(fā)病率呈逐年升高趨勢，據(jù)統(tǒng)計全國2015年青枯病發(fā)病面積達到8.67萬hm2左右，造成了巨大的經(jīng)濟損失[3]。

近年來，隨著16S rRNA基因測序等分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的學者開始關(guān)注青枯病害與土壤細菌之間的關(guān)系[4]。有研究表明，勞爾氏菌在侵染植株過程中，能夠引起感病部位土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性變化[5]，這可能是影響煙草根莖部病害發(fā)生的關(guān)鍵因子之一[6-7]。土壤中的微生物之間也存在著各種相互作用，如寄生、共生、拮抗等。有許多學者運用模擬生態(tài)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的方法來探究微生物間的相互關(guān)系[8-9]，這不僅有利于了解原位狀況下土壤微生物間的相互作用，也為維持土壤健康提供了理論支撐[10]。而采集大數(shù)量樣本，分析土壤養(yǎng)分、物理結(jié)構(gòu)及根際細菌群落多樣性在青枯病發(fā)病與未發(fā)病土壤之間差異的研究卻鮮有報道。因此，本文采用16S rRNA基因測序技術(shù)，對青枯病發(fā)病與未發(fā)病煙株根際土壤的細菌群落結(jié)構(gòu)、多樣性、網(wǎng)絡(luò)特性進行系統(tǒng)性分析，并探討影響青枯病發(fā)生的主要土壤理化指標和細菌種類，以期為當?shù)責煵萸嗫莶〉姆揽靥峁┘夹g(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與制備

取樣地點在湖北省恩施州青枯病發(fā)病的區(qū)域，包括恩施市盛家壩鄉(xiāng)，宣恩縣曉關(guān)鄉(xiāng)、椒園鎮(zhèn)，咸豐縣朝陽寺鎮(zhèn)、坪壩營鎮(zhèn)、唐崖鎮(zhèn)、黃金洞鄉(xiāng)、忠堡鄉(xiāng)，鶴峰縣燕子鄉(xiāng)和中營鄉(xiāng)。土壤類型均為黃棕壤。在2019年9—10月煙葉采收結(jié)束后，選取相臨的青枯病發(fā)病區(qū)域和未發(fā)病區(qū)域，拔出煙株莖稈及根系，采用抖動法進行根際土壤樣品采集，去除雜物，一部分土樣過1 mm篩，裝入5 mL的小試管中，標記好迅速放入冰盒，帶回實驗室放入液氮中，進行16S rRNA測序分析;另一部分土壤裝入透氣棉質(zhì)袋，帶回實驗室風干，過20目和100目篩，測定常規(guī)化學指標。同時選擇煙株中間壟體完整的區(qū)域開展環(huán)刀取樣，測定土壤物理指標。煙株發(fā)病與未發(fā)病按照YC/T 39—1996的標準進行確定。共采集青枯病未發(fā)病土壤樣品82個，用H表示;發(fā)病土壤樣品78個，用UH表示。

1.2 土壤理化性狀測定項目與方法

用pH計（賽多利斯PB-10）測定土壤pH;用重鉻酸鉀容量法測定有機質(zhì)含量;用硫酸鉬銻抗比色法測定有效磷含量（UV-1500型紫外可見分光光度計）;用火焰光度法測定速效鉀含量（FP6400火焰光度計）;用凱氏定氮法測定土壤總氮含量[11]。土壤容重、含水量、總孔隙度、毛管持水量、通氣孔隙度采用環(huán)刀烘干法測定[12]。

1.3 土壤微生物的檢測

利用Fast DNA? Spin Kit（Qbiogene，Inc.USA）試劑盒提取土壤總DNA，采用正向引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'），反向引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對細菌16S rRNA的V3～V4可變區(qū)進行PCR擴增;PCR擴增體系為：土壤微生物DNA模板（10 ng/μL）2.5 μL，F(xiàn)orward引物和Reverse引物（1 μmol/L）各5 μL，KAPA HiFi HotStart Ready Mix 12.5 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25個循環(huán);72 ℃延伸5 min。擴增后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物品質(zhì)，再經(jīng)純化、質(zhì)檢后建立測序文庫，采用 Illumina Miseq PE250 平臺由北京諾禾致源科技股份有限公司測序。采用Uparse軟件對所有相應(yīng)的Effective Tags進行聚類，以97%的一致性將序列聚類為OTUs。對OTUs代表的序列進行物種注釋，用Mothur方法與SILVA數(shù)據(jù)庫進行細菌物種注釋分析，獲得各分類水平上的群落組成[13]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007、SPSS 22.0軟件和https：//magic. novogene.com/平臺進行數(shù)據(jù)分析和制圖。

2 結(jié) 果

2.1 多樣性分析

由圖1可知，青枯病發(fā)病土壤的Shannon-Wiener、Simpson、Chao1和Ace指數(shù)高于未發(fā)病土壤，Shannon-Wiener和Simpson指數(shù)增加達極顯著水平，說明煙草青枯病的發(fā)病提高了根際土壤微生物數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)的多樣性。

2.2 屬水平相對豐度分析

OTUs豐度前50的細菌屬水平差異見圖2，其中鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、Chujaibacter和節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）是煙草根際土壤中的優(yōu)勢菌屬。Sphingomonas、Arthrobacter、馬賽菌屬（Massilla）、慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）和unidentified_Acidobacteria在青枯病未發(fā)病土壤中相對豐度較高，而Chujaibacter、羅思河小桿菌屬（Rhodanobacter）、unidentified_Gammaproteobacteria、unidentified_Gemmatimonadaceae、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、Bryobacter、酸桿菌屬（Acidibacter）則在發(fā)病土壤中相對豐度較高，表明煙草青枯病發(fā)病明顯改變了根際土壤中屬水平細菌的組成。

對根際土壤中青枯病相關(guān)功能菌屬（圖3）的分析表明，發(fā)病土壤中，勞爾氏菌屬（Ralstonia）相對豐度為0.292%，較未發(fā)病土壤增加了0.117%，達顯著水平;而具有拮抗青枯病功能的假單胞菌屬（Pseudomonas）和鏈霉菌屬（Streptomyces）的相對豐度為0.228%和0.427%，較未發(fā)病土壤降低了0.356%和0.006%，其中Pseudomonas相對豐度降低達極顯著水平，說明減少土壤中的Ralstonia和提高Pseudomonas相對豐度具有抑制青枯病發(fā)生的效果。

2.3 屬水平網(wǎng)絡(luò)分析

選取相對豐度前100的屬水平細菌，采用spearman相關(guān)性分析法，r>0.6的保留，構(gòu)建生態(tài)網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)，過濾后采用Cytoscape軟件進行網(wǎng)絡(luò)作圖（圖4），比較煙草青枯病發(fā)病與未發(fā)病根際土壤細菌網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)上的差異，研究它們之間的網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系（表1）。青枯病發(fā)病土壤的細菌網(wǎng)絡(luò)節(jié)點數(shù)、網(wǎng)絡(luò)直徑和平均路徑距離低于未發(fā)病土壤，而連接數(shù)、平均連接度和圖密度則相反。說明煙草感染青枯病后，根際土壤微生物網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，各微生物間緊密程度更高。比較兩種土壤微生物網(wǎng)絡(luò)的核心點位細菌，發(fā)病土壤核心細菌屬主要為Sphingosinicella、戴氏菌屬（Dyella）、酸桿菌門屬（unidentified_Acidobacteria）等，而未發(fā)病土壤核心細菌屬主要為Sphingosinicella、溶桿菌屬（Lysobacter）、酸桿菌門屬（unidentified_ Acidobacteria）等，表明煙株感染青枯病，改變了根際土壤微生物網(wǎng)絡(luò)中的部分核心細菌種類。

2.4 土壤因子分析

由表2可知，青枯病發(fā)病土壤的pH、速效磷（AP）、有機質(zhì)（SOC）、總氮（TN）、容重（SBD）、毛管孔隙度（SCM）、毛管持水量（SCC）低于未發(fā)病土壤，其中pH、AP、SCM降低達顯著水平（p<0.05）;而速效鉀（AK）、含水量（SAWC）、總孔隙度（STP）、通氣孔隙度（SAP）高于未發(fā)病土壤，其中SAWC、SAP增加達顯著水平（p<0.05）。選擇6個差異較大的土壤理化指標（pH、AP、AK、SCC、SBD、SCM），并結(jié)合OTUs數(shù)據(jù)矩陣來構(gòu)建典范對應(yīng)分析（CCA）模型（圖5）。兩個排序軸總共解釋了66.41%的細菌群落變化，發(fā)病土壤主要分布在縱坐標的左側(cè)，未發(fā)病土壤主要分布在縱坐標的右側(cè)。其中pH、SCM、SBD與CCA1軸夾角較小，有較高的負相關(guān)性（?0.879、?0.691、?0.616），而SCC、AP和AK與CCA2軸夾角較小，有較高的正相關(guān)性（0.996、0.986、0.901）。根據(jù)圖中箭頭長度可以看出，與微生物群落結(jié)構(gòu)有較大影響的土壤因子主要為pH，其次為AP，主要表現(xiàn)為對未發(fā)病根際土壤細菌的影響。

3 討 論

煙草青枯病是一種危害極大的細菌性病害，其發(fā)生與根際土壤微生物的數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)等關(guān)系密切[14-15]。有學者認為土壤微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富、多樣性越高，對抗病原菌的綜合能力越強[16-17]。施河麗等[13]、陳乾錦等[18]研究表明健康煙株根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性高于發(fā)病煙株。本文中青枯病未發(fā)病根際土壤細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性和復(fù)雜性低于發(fā)病土壤，與上述研究結(jié)論不一致。可能本研究的土壤采樣時間為煙葉收獲后的9—10月，青枯病已經(jīng)嚴重發(fā)生，這導(dǎo)致勞爾氏菌在侵入煙株過程中或侵入后，對植株的正常代謝產(chǎn)生了干擾，而煙株為了抵抗這種變化，通過改變根系分泌物或內(nèi)生細菌來進行調(diào)節(jié)[19]，從而造成煙株根際土壤微生物種類增加;另外，煙株感染青枯病后，根系及莖稈開始腐爛，大量有機物質(zhì)進入根際土壤，微生物獲得了更多的碳氮養(yǎng)分而使其數(shù)量增多、群落結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜[20]。根據(jù)以上結(jié)果，可推測青枯病發(fā)病前的土壤細菌群落多樣性高有助于提高煙株對青枯病的抗性;而青枯病發(fā)病后，土壤細菌群落多樣性趨向于更加豐富，但可能提高了有害菌群數(shù)量和豐度，反而不利于抵抗青枯病的發(fā)生。

在植物生長過程中土壤微生物群落結(jié)構(gòu)起著重要作用，因為它們可以從不同的微生物群落中獲益[21]。同時，植株感染青枯病后，根際土壤微生物群落會發(fā)生改變[22]。本研究表明Sphingomonas和Arthrobacter在未發(fā)病土壤中明顯高于發(fā)病土壤，可能土壤中相對豐度較高的Sphingomonas和Arthrobacter等中性微生物可降低煙草青枯病的發(fā)病水平。其原因，一方面中性微生物通過競爭生態(tài)位的方式降低了有害菌群（如Ralstonia等）相對豐度（圖3）;另一方面它們有效改善了土壤生態(tài)環(huán)境和養(yǎng)分供應(yīng)狀況[23-24]，促進了煙株的生長發(fā)育，進而通過增強植株抗性的方法減少了煙草青枯病的發(fā)生，具體影響機制還有待進一步研究。

生態(tài)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系是自然界物種間的重要屬性，能直觀表達物種之間的復(fù)雜關(guān)系，還可以表征微生物群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[25-26]。有研究認為，模塊度較低的網(wǎng)絡(luò)，因其較短的網(wǎng)絡(luò)距離將增加對外界干擾的傳遞速度，從而降低整個網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[27-28]。本研究中，煙草青枯病的發(fā)生，降低了煙株根際土壤微生物網(wǎng)絡(luò)直徑、平均路徑距離和網(wǎng)絡(luò)模塊性（表1）。說明煙株感染青枯病后，根際土壤微生物群落的多樣性和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性增加，而穩(wěn)定性降低，這可能與青枯病的發(fā)生改變了核心網(wǎng)絡(luò)物種有關(guān)系。YANG等[29]認為一些潛在的有益于植物的細菌作為微生物網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵類群，如芽孢桿菌和放線桿菌等，可減少土傳病原菌的入侵。本文中，煙株青枯病的發(fā)生使未發(fā)病根際土壤生態(tài)網(wǎng)絡(luò)部分核心微生物由溶桿菌屬（Lysobacter）變?yōu)榇魇暇鷮伲―yella），而Dyella與西瓜的土傳枯萎病發(fā)病率呈顯著正相關(guān)[30]，是一種對植物生長不利的微生物，說明有益微生物（如Lysobacter等）作為生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵類群可以降低植物土傳病原菌的入侵機會，抑制青枯病的發(fā)生，而有害微生物（如Dyella等）則相反，這與前人的研究結(jié)論相似[29]。

煙草青枯病的致病力受多種因素影響。汪漢成等[31]研究表明影響勞爾氏菌致病力的關(guān)鍵土壤因子為溫度和pH。有研究認為土壤板結(jié)、酸堿度不平衡、理化性狀惡化等可能是煙草青枯病發(fā)病嚴重的主要原因[32-33]。本文中，未發(fā)病根際土壤pH和AP含量顯著高于發(fā)病土壤，說明提高土壤pH和AP含量對降低青枯病的發(fā)病率有重要作用。

4 結(jié) 論

青枯病的發(fā)生增加了煙株根際土壤微生物群落的多樣性和復(fù)雜程度，而網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低。根際土壤中Sphingomonas、Arthrobacter、Pseudomonas相對豐度的降低和Ralstonia相對豐度的增加是煙草青枯病發(fā)病的重要微生物因素，土壤pH和AP是影響煙草青枯病發(fā)病的關(guān)鍵因子。在恩施煙區(qū)，可綜合應(yīng)用石灰調(diào)酸、合理增施磷肥、施用農(nóng)家肥和生物有機肥、灌施生防菌劑等措施，提高土壤酸堿度，改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)（增加有益及中性微生物相對豐度），防控煙草青枯病的發(fā)生。

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