肝細胞癌早期復發(fā)灶的免疫微生態(tài)系統(tǒng)

樊 嘉

全世界每年新發(fā)肝細胞癌(簡稱肝癌)的病例中約一半發(fā)生在我國，因此，我國是“肝癌大國”。手術切除是目前最主要的肝癌根治性治療方式，也是最有效的治療方法。肝癌切除術后5年復發(fā)率高達70%，其中多數(shù)發(fā)生于手術后2年內(nèi)(即早期復發(fā))，嚴重影響了肝癌患者的長期生存和生活質(zhì)量[1]。早期復發(fā)肝癌多由原發(fā)灶的腫瘤細胞在肝內(nèi)播散形成，晚期復發(fā)肝癌則常起源于殘余肝臟的新發(fā)病灶。相較于晚期復發(fā)，早期復發(fā)的肝癌進展更快，治療效果不佳，患者預后更差。因此，揭示肝癌早期復發(fā)的機制，以此為基礎探索早期復發(fā)肝癌綜合防治的新策略，是進一步提高肝癌療效和改善我國肝癌患者總體預后的關鍵課題。

越來越多的研究結果提示，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展不是一個孤立事件，在腫瘤演進過程中，始終伴隨著實質(zhì)細胞與免疫微環(huán)境的相互作用。免疫系統(tǒng)識別并殺傷腫瘤細胞，而腫瘤通過各種方式逃脫免疫監(jiān)視，如降低免疫原性、誘導免疫耐受、促進免疫抑制、形成物理屏障。免疫治療通過阻斷腫瘤的免疫逃逸機制，恢復免疫細胞的殺傷功能，為治療甚至治愈腫瘤提供了新思路。原發(fā)肝癌中的效應性CD8+胸腺依賴淋巴細胞(T細胞)較少，耗竭性CD8+T細胞占多數(shù)[2]。兩項Ⅲ期臨床試驗的結果已表明，免疫檢查點抑制劑單用(KEYNOTE-240臨床試驗)[3]或者聯(lián)合使用抗血管生成藥物(IMbrave150臨床試驗)[4]，均能使晚期肝癌患者獲益，延長其生存時間。然而，從腫瘤最初形成到發(fā)生復發(fā)轉移，免疫細胞與腫瘤細胞之間的相互作用是動態(tài)變化的，不同時期腫瘤免疫逃逸機制可能并不相同[5]。早期復發(fā)肝癌與原發(fā)肝癌免疫微環(huán)境的差異，將會影響免疫治療方式的選擇。以下通過介紹早期復發(fā)肝癌的微環(huán)境特征，以及免疫細胞與腫瘤細胞相互作用的機制，以期為制訂早期復發(fā)肝癌的免疫治療新策略提供理論依據(jù)。

1 原發(fā)肝癌的非主要克隆更具復發(fā)優(yōu)勢

早期復發(fā)肝癌與原發(fā)肝癌同源，全外顯子測序提示兩者共有突變的比例為27%～49%，高于非同源腫瘤；單細胞DNA數(shù)據(jù)進一步揭示，早期復發(fā)灶的腫瘤細胞來源于原發(fā)灶的非主要克隆[6]。絕大多數(shù)患者的原發(fā)肝癌中至少有1個主要克隆，在配對復發(fā)灶中幾近消失[7]。復發(fā)肝癌丟失原發(fā)肝癌的主要克隆是普遍現(xiàn)象。由于復發(fā)灶中的多數(shù)CD8+T細胞與原發(fā)灶中CD8+T細胞識別相同的抗原[6]，原發(fā)灶的非主要克隆可能因新抗原暴露少，不被CD8+T細胞識別而逃脫免疫清除，進一歩形成復發(fā)灶。因此，使用靶向新抗原的方法治療早期復發(fā)肝癌時，不應遺漏更具復發(fā)優(yōu)勢的非主要克隆。

2 早期復發(fā)灶的腫瘤細胞逃逸免疫

原發(fā)灶腫瘤細胞增殖相關的信號通路呈活化狀態(tài)，而復發(fā)灶腫瘤細胞則激活免疫監(jiān)視和逃逸相關信號通路。在復發(fā)灶的腫瘤細胞中，免疫逃逸相關基因CD47基因的表達量增高，可能抑制樹突狀細胞(dendritic cell，DC)的成熟和抗原呈遞，抵抗巨噬細胞的識別和吞噬，減少新抗原的釋放；人類淋巴細胞抗原A、B、C的表達量增高，表明其對自然殺傷細胞介導細胞死亡的抵抗力增加。在免疫檢查點配體基因中，原發(fā)灶和復發(fā)灶的腫瘤細胞低表達重組人半乳糖凝集素9[LGALS9，T細胞免疫球蛋白黏蛋白3(TIM-3)的配體]、TNF受體超家族成員14[TNFRSF14，B和T細胞相關蛋白(BTLA)的配體]、程序性細胞死亡受體1配體2[PDCD1LG2，程序性細胞死亡受體1(PD-1)的配體]和含有V-Set結構域的T細胞激活抑制劑1[VTCN1，程序性細胞死亡1配體1(B7-H1)的配體]，高表達纖維蛋白原樣蛋白1[FGL1，淋巴細胞激活基因3(LAG3)的配體]。此外，復發(fā)灶的腫瘤細胞中細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA4)、CD274[程序性細胞死亡受體1配體1(PD-L1)]表達量和CD274陽性細胞比例均高于原發(fā)灶?？笴D47的療法或者多種免疫檢查點抑制劑聯(lián)合的療法，可能有助于防治早期復發(fā)肝癌。

3 早期復發(fā)灶的CD8+T細胞多而失能

就浸潤T細胞的所占比例而言，早期復發(fā)肝癌呈獨特的免疫微環(huán)境特征，如CD8+T細胞比例增高，調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)減少。此外，復發(fā)灶中增殖性和克隆擴增T細胞的比例降低亦提示免疫狀態(tài)相對靜止。

從免疫狀態(tài)和細胞轉變方面來看，原發(fā)灶與復發(fā)灶的CD8+T細胞的分化軌跡相同，但免疫狀態(tài)和轉錄狀態(tài)明顯不同。相同的分化軌跡是指腫瘤內(nèi)的浸潤CD8+T細胞呈現(xiàn)出順序變化的連貫狀態(tài)，均存在早期狀態(tài)、中間細胞毒性狀態(tài)和終末耗竭性狀態(tài)。不同的是，原發(fā)灶的CD8+T細胞多數(shù)處于中間細胞毒性狀態(tài)和終末耗竭性狀態(tài)，而復發(fā)灶的CD8+T細胞以早期狀態(tài)為主，處于終末耗竭性狀態(tài)者很少。復發(fā)灶中，早期狀態(tài)CD8+T細胞的代謝依賴于脂肪酸氧化和有氧糖酵解，而不是氧化磷酸化，表明其能量代謝過程類似于記憶細胞，而不同于經(jīng)典的幼稚細胞[8-9]。早期狀態(tài)CD8+T細胞的CD45可變剪接更傾向于CD45RO而非CD45RA，也表明其并非幼稚狀態(tài)，而是在先前已被激活。早期狀態(tài)CD8+T細胞中上調(diào)的表達轉錄因子叉頭蛋白1(FoxP1)，可使CD8+T細胞表現(xiàn)出無反應性特征，可介導TGF-β誘導的c-JUN蛋白轉錄抑制，維持記憶性T細胞的生存[10-11]。因此，復發(fā)肝癌中富集的CD8+T細胞呈記憶性和非殺傷狀態(tài)。

相較于原發(fā)灶，早期復發(fā)灶中CD8+T細胞的組織駐留基因水平升高，抑制性和細胞毒性信號減弱，表明其處于低活化狀態(tài)而非耗竭狀態(tài)。復發(fā)灶中CD8+T細胞上調(diào)KLRB1(CD161)和IL受體(7IL7R)，表現(xiàn)出固有免疫樣和記憶性T細胞表型[12]。殺傷細胞凝集素樣受體G1(KLRG1)、自然細胞毒性觸發(fā)受體3(NCR3)和RAR相關孤兒受體(RORA)的表達量增高，亦表明存在2型固有免疫樣淋巴樣細胞(ILC2)表型[13]。免疫組織化學檢查證實，復發(fā)灶中CD161+CD8+T細胞富集，且與二次復發(fā)顯著相關。細胞實驗證實，CD161+CD8+T細胞的細胞毒性弱于CD8+CD161-T細胞。在KLRB1高表達CD8+T細胞中富集的基因集，能夠提示肝癌患者預后不良。

與原發(fā)灶CD8+T細胞的衰竭狀態(tài)不同，復發(fā)灶中以KLRB1過表達為特征的CD8+T細胞表現(xiàn)出固有免疫樣、低細胞毒性和非耗竭表型。對于原發(fā)肝癌和復發(fā)肝癌，應考慮采用不同的免疫療法。CD161+CD8+T細胞無法識別并攻擊復發(fā)腫瘤，通過化學治療或靶向治療誘導復發(fā)肝癌釋放新抗原，可能會激活未成熟的CD8+T細胞，引起復發(fā)肝癌特異性CD8+T細胞的克隆擴增。

4 早期復發(fā)灶DC抗原遞呈受抑制

復發(fā)灶中DC的富集程度高于原發(fā)灶和復發(fā)灶癌旁組織，可以聚類為DC1[高表達包含9A的C型凝集素結構域(CLEC9A)]、DC2[高表達分化簇1C(CD1C)、含有10A的C型凝集素結構域(CLEC10A)]和DC3[高表達C-C基序趨化因子配體(CCL19)、溶酶體關聯(lián)膜蛋白3(LAMP3)、C-C基序趨化因子受體(CCR7)]。DC2可向CD4+T細胞遞呈特異性抗原，但無法向CD8+T細胞遞呈。DC3細胞具有遷移至淋巴結的能力，可能是腫瘤特異性的DC亞群。在3個DC細胞亞群中，僅DC2在復發(fā)灶中顯著富集。

DC細胞原本應發(fā)揮抗原遞呈作用，增強適應性免疫。然而在復發(fā)灶中，腫瘤細胞可能通過PD-L1-CD80和CTLA4-CD80與DC(DC2或DC3)相互作用，競爭性抑制DC與T細胞CD80-CD28的相互作用(CD80對PD-L1和CTLA4的親和力高于對CD28的親和力[14])，進而抑制DC的抗原呈遞作用，降低T細胞的活化效率，促進腫瘤細胞免疫逃逸。多重免疫熒光實驗也證實，CD80+CD1c+DC位于PD-L1陽性復發(fā)肝癌細胞附近。除了直接作用，肝癌細胞還可釋放PD-L1外泌體，進一步削弱抗腫瘤免疫[15]?；謴虳C抗原遞呈功能可能是治療早期復發(fā)肝癌潛在有效的策略。

5 結 論

早期復發(fā)肝癌較原發(fā)肝癌有其獨特的免疫微環(huán)境，其特征為免疫抑制細胞Treg的比例降低，DC細胞和固有免疫樣CD161+CD8+T細胞的比例增高，T細胞的細胞毒性降低和功能失調(diào)。復發(fā)肝癌細胞與浸潤免疫細胞間相互作用，促進了腫瘤細胞的免疫逃逸。多種免疫治療聯(lián)合使用是治療早期復發(fā)肝癌最有效的策略，促進新抗原釋放，阻斷腫瘤細胞所致的免疫抑制，恢復CD8+T細胞的抗腫瘤作用，實現(xiàn)“1+1>2”治療效果。合適的聯(lián)合治療策略、提示治療效果的標志物，以及輔助治療預防復發(fā)的價值，是肝癌免疫治療領域需要關注的問題。