豬圓環(huán)病毒1型和2型核酸定性標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制

董浩，原霖，畢一鳴，劉洋，劉穎昳，劉玉良，陳亞娜，顧小雪，王傳彬

(中國(guó)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102618)

豬圓環(huán)病毒(PCV)為無(wú)囊膜的單股負(fù)鏈DNA病毒，是目前發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒，大小約為17 nm。PCV根據(jù)抗原性及基因組的不同分為豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)、2型(PCV2)以及2016年新出現(xiàn)的3型(PCV3)。PCV1分離自豬腎細(xì)胞系PK15，它不致病，能夠在PK15中穩(wěn)定存在而不形成細(xì)胞病變；PCV2對(duì)豬有致病性，可引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(PDNS)、斷奶豬和育肥豬的呼吸道疾病、豬的繁殖障礙等疾?。籔CV3感染可引起母豬厭食、PDNS及繁殖障礙等，對(duì)其研究尚處起步階段。

PCV2引起的疾病近年來(lái)已成為嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一[1]。1991年P(guān)CV2首次在加拿大被發(fā)現(xiàn)后，迅速在各個(gè)養(yǎng)豬國(guó)家蔓延，嚴(yán)重威脅著全球養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。2000年，郎洪武等[2]首次報(bào)道了我國(guó)豬群感染PCV2的相關(guān)情況。2018年，何長(zhǎng)生等[3]采用熒光定量PCR方法對(duì)來(lái)自安徽省3個(gè)地區(qū)12個(gè)豬場(chǎng)健康豬群進(jìn)行PCV2檢測(cè)，PCV2個(gè)體陽(yáng)性率和群體陽(yáng)性率分別是67.4%和91.7%。孫圣福等[4]對(duì)山東省生豬養(yǎng)殖、流通、屠宰加工等環(huán)節(jié)中PCV2污染狀況的檢測(cè)表明，養(yǎng)殖場(chǎng)、屠宰場(chǎng)、運(yùn)輸車(chē)輛、洗消中心的場(chǎng)點(diǎn)陽(yáng)性率分別為5.88%、5.26%、5.88%和20.00%，樣品陽(yáng)性率分別為2.01%、1.68%、0.75%和2.90%。吳明臻等[5]對(duì)近幾年浙江金華地區(qū)PCV2流行情況的研究表明，2012—2018年P(guān)CV2個(gè)體陽(yáng)性率分別為10.16%、11.95%、8.50%、9.94%、6.19%、5.94%和8.28%。上述研究表明，我國(guó)當(dāng)前PCV2的流行情況依然不容樂(lè)觀，需要引起足夠重視。

國(guó)內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范中都規(guī)定了PCV的核酸檢測(cè)方法[6-9]，但是目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)機(jī)構(gòu)或公司生產(chǎn)PCV相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)樣品，無(wú)法評(píng)價(jià)檢測(cè)試劑、驗(yàn)證檢測(cè)能力和控制檢測(cè)質(zhì)量?；诖?，本研究針對(duì)PCV1和PCV2開(kāi)展了PCV分型鑒定核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品研制工作，獲得了該病毒核酸檢測(cè)定性標(biāo)準(zhǔn)樣品，有望解決PCV在檢測(cè)中存在的實(shí)際問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

E.Z.N.A.? Plasmid Mini Kit試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；QuantStudioTM3D Digital PCR 20K Chip Kitv2 and Master Mix購(gòu)自Thermo公司；One-Step RT-ddPCR Kit for Probes購(gòu)自伯樂(lè)公司；豬瘟病毒通用型實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR檢測(cè)試劑盒、豬偽狂犬病毒實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒、豬圓環(huán)病毒 2 型實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒、豬細(xì)小病毒實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒、支原體檢測(cè)試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒美洲經(jīng)典株實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自世紀(jì)元亨公司；引物探針由英濰捷基有限公司合成。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)樣品原料的制備

對(duì)PCV1序列(GenBank 登錄號(hào)：JN133303)和PCV2序列(GenBank 登錄號(hào)：HQ395021)全基因組序列進(jìn)行分析，檢查序列內(nèi)部有無(wú)特別復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)序列后，發(fā)送給英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。將合成好的序列裝入pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞。

將分別含有PCV1和PCV2全序列的陽(yáng)性克隆在含有氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，使用E.Z.N.A.? Plasmid Mini Kit試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒提取。采用紫外分光光度法對(duì)質(zhì)粒的純度進(jìn)行測(cè)定。對(duì)2個(gè)提取好的質(zhì)粒分別進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)和無(wú)其他病毒(豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬細(xì)小病毒)檢驗(yàn)。

對(duì)上述2個(gè)提取的質(zhì)粒分別用陰性稀釋液進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)稀釋后，采用數(shù)字PCR方法進(jìn)行質(zhì)粒濃度的初步測(cè)定。對(duì)稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)樣品原料按照0.5 mL每管進(jìn)行分裝，2種質(zhì)粒溶液各分裝1 000管，置于-20 ℃儲(chǔ)存。

1.3 均勻性評(píng)估

從分裝好的標(biāo)準(zhǔn)樣品原料中隨機(jī)抽取30管標(biāo)準(zhǔn)樣品，每管樣本使用數(shù)字PCR方法進(jìn)行檢測(cè)3次。試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)使用單因素方差分析方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行均勻性評(píng)估。

1.4 穩(wěn)定性評(píng)估

為了評(píng)估制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性，分別進(jìn)行了長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估和短期穩(wěn)定性評(píng)估。

1.4.1 長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估

分別在第1、6、12、18和24個(gè)月抽取5管PCV1、PCV2核酸定性標(biāo)準(zhǔn)樣品使用數(shù)字PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品檢測(cè)2次，計(jì)算平均值。使用回歸方法對(duì)PCV1、PCV2核酸定性標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估。

1.4.2 短期穩(wěn)定性評(píng)估

分別將制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品在4 ℃、25 ℃和37 ℃環(huán)境下存放60、21和6 d。抽取3瓶的PCV1、PCV2核酸定性標(biāo)準(zhǔn)樣品使用數(shù)字PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品檢測(cè)1次。使用t檢驗(yàn)方法對(duì)PCV1、PCV2核酸定性標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行短期穩(wěn)定性評(píng)估。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值

1.5.1 特性值的測(cè)定

將分別含有PCV1和PCV2全序列的質(zhì)粒使用M13F和M13R通用引物，分別送至生工生物工程(上海)有限公司、深圳華大基因科技有限公司、中美泰和生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。將3家測(cè)序的結(jié)果分別進(jìn)行Blast分析。

1.5.2 參考值的測(cè)定

通過(guò)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室合作定值方式對(duì)PCV1、PCV2核酸定性標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行參考值的定值。在本研究中，委托了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)診斷中心、北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室、上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室、山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心實(shí)驗(yàn)室、河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室、遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室、吉林省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室和浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室共8家實(shí)驗(yàn)室使用數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的參考值進(jìn)行測(cè)定。匯總各家測(cè)定的定值數(shù)據(jù)后，先進(jìn)行測(cè)定數(shù)據(jù)的處理[10]。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了組內(nèi)可疑值檢驗(yàn)、組間數(shù)據(jù)等精度檢驗(yàn)剔除可疑值。在各組數(shù)據(jù)等精度的情況下，用t檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)平均值是否存在顯著性差異。如平均值無(wú)顯著性差異，先合并數(shù)據(jù)，檢驗(yàn)數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性，在符合正態(tài)分布的情況下，可將多個(gè)平均值再次計(jì)算平均值，求出總平均值，即為參考值。

1.6 臨床試用

上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、山東省動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心和遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心3家試用單位在檢測(cè)日常臨床樣本時(shí)，將試用的PCV1、PCV2核酸定性標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，一次檢測(cè)2管標(biāo)準(zhǔn)樣品，每管重復(fù)檢測(cè)3次。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備

分別含有PCV1和PCV2基因組全長(zhǎng)序列質(zhì)粒的構(gòu)建由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成。對(duì)構(gòu)建完成的質(zhì)粒采用M13F和M13R通用引物進(jìn)行雙向測(cè)序。將獲得的序列信息分別進(jìn)行Blast序列分析，結(jié)果顯示PCV1基因序列與已發(fā)表的PCV1 CCL33-UGent的復(fù)制相關(guān)蛋白和衣殼蛋白的基因序列(GenBank登錄號(hào)：JN133303)相似度100%；PCV2基因序列與已發(fā)表的PCV2 08TJ株(GenBank登錄號(hào)：HQ395021)相似度100%。

制備的核酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的物理性狀呈無(wú)色均一液體，無(wú)絮狀沉淀物或大塊沉淀。無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果顯示制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品原料涂布在無(wú)抗性的LB固體培養(yǎng)基上無(wú)細(xì)菌菌落生長(zhǎng)；使用豬瘟病毒通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒、豬偽狂犬病毒實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒、豬細(xì)小病毒實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)均為陰性；采用文獻(xiàn)[6]方法和PCV2實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)含有PCV1和PCV2全序列的質(zhì)粒溶液均為陽(yáng)性。

2.2 均勻性檢測(cè)

從分裝好的標(biāo)準(zhǔn)樣品原料中隨機(jī)抽取30管樣品，共進(jìn)行了90次檢測(cè)。根據(jù)自由度(v1,v2)及給定的顯著性水平α，可由表查臨界值的F值，算得F

表1 PCV1均勻性檢測(cè)結(jié)果

表2 PCV2均勻性檢測(cè)結(jié)果

2.3 穩(wěn)定性檢測(cè)

2.3.1 長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估

長(zhǎng)期穩(wěn)定性評(píng)估則是測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)樣品在長(zhǎng)期儲(chǔ)存條件下(-20 ℃)的穩(wěn)定性。分別在第1、6、12、18和24個(gè)月抽取5管標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行穩(wěn)定性評(píng)估，結(jié)果均小于對(duì)應(yīng)的t0.05,n-2因子的分位數(shù)，未觀測(cè)到不穩(wěn)定性，能滿(mǎn)足實(shí)際測(cè)量的需要。上述結(jié)果說(shuō)明本標(biāo)準(zhǔn)樣品在-20 ℃環(huán)境下可穩(wěn)定至少24個(gè)月?？紤]到實(shí)際運(yùn)輸條件等因素對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品穩(wěn)定性的影響，因此確定本標(biāo)準(zhǔn)樣品可在-20 ℃下穩(wěn)定保存24個(gè)月(表3和表4)。

表3 PCV1的長(zhǎng)期穩(wěn)定性結(jié)果

表4 PCV2的長(zhǎng)期穩(wěn)定性結(jié)果

2.3.2 短期穩(wěn)定性評(píng)估

將標(biāo)準(zhǔn)樣品分別在4 ℃、25 ℃、37 ℃環(huán)境下存放60、21和6 d與存放在-80 ℃環(huán)境中的檢測(cè)結(jié)果分別進(jìn)行短期穩(wěn)定性分析，結(jié)果均小于對(duì)應(yīng)的t0.05,n-2因子的分位數(shù)，故認(rèn)為未觀測(cè)到不穩(wěn)定性，說(shuō)明本標(biāo)準(zhǔn)樣品能滿(mǎn)足實(shí)際測(cè)量的需要(表5和表6)。因此，標(biāo)準(zhǔn)樣品可在4 ℃環(huán)境穩(wěn)定60 d，25 ℃環(huán)境穩(wěn)定21 d，37 ℃環(huán)境可穩(wěn)定6 d。

表5 PCV1短期穩(wěn)定性結(jié)果

表6 PCV2短期穩(wěn)定性結(jié)果

2.4 標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值

委托8家實(shí)驗(yàn)室采用數(shù)字PCR方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的參考值進(jìn)行測(cè)量，最終測(cè)定PCV1、PCV2核酸定性標(biāo)準(zhǔn)樣品的參考值分別為1.33×104copies/μL和1.11×104copies/μL 。

將PCV1、PCV2核酸定性標(biāo)準(zhǔn)樣品分別送3家公司使用M13F和M13R通用引物進(jìn)行測(cè)序。3家公司均獲得了PCV1和PCV2全序列，通過(guò)Blast序列相似度比較，PCV1可溯源至GenBank登錄號(hào)為JN133303的CCL33株，核苷酸序列相似度為100%；PCV2可溯源至GenBank登錄號(hào)為HQ395021的08TJ株，核苷酸序列相似度為100%。

2.5 試用情況

委托的3家實(shí)驗(yàn)室采用現(xiàn)行的豬圓環(huán)病毒核酸檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)PCV1、PCV2核酸定性標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行了試用，試驗(yàn)結(jié)果表明該標(biāo)準(zhǔn)樣品質(zhì)量穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，能夠與我國(guó)現(xiàn)行的PCV檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)相匹配。

2.6 評(píng)審結(jié)論

制備的PCV1、PCV2核酸定性標(biāo)準(zhǔn)樣品滿(mǎn)足了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品的要求，通過(guò)了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)組織的專(zhuān)家評(píng)審。

3 討論

檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠對(duì)于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)至關(guān)重要，這不僅要監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)過(guò)程中的人、機(jī)、料、法、環(huán)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，還需要采取有效的質(zhì)量控制方式，從而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期有效的質(zhì)量保證[11]。標(biāo)準(zhǔn)樣品由于具有均勻性和穩(wěn)定性，并且經(jīng)過(guò)溯源，量值和不確定度是確定的，因此可以作為參照物或質(zhì)控樣品對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性進(jìn)行核查，從而幫助排查實(shí)驗(yàn)室人、機(jī)、料、法、環(huán)等影響因素的偏差，以便實(shí)驗(yàn)室采取有效的糾正和預(yù)防措施[12]。

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)是PCV檢測(cè)的重要手段，包括病毒分離、免疫熒光、免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和分子生物學(xué)試驗(yàn)等方法。其中，分子生物學(xué)檢測(cè)方法主要有常規(guī)PCR、套式PCR、多重PCR、熒光定量PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增等方法[13]。雖然目前我國(guó)已經(jīng)有多項(xiàng)現(xiàn)行的PCV檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但是缺乏與之配套的豬圓環(huán)病毒檢測(cè)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)樣品，無(wú)法評(píng)價(jià)檢測(cè)試劑、驗(yàn)證檢測(cè)能力和控制檢測(cè)質(zhì)量。在早期的相關(guān)研究中，高志強(qiáng)等[14]針對(duì)PCV2 QD/2014株ORF2片段構(gòu)建了重組腺病毒核酸擴(kuò)增檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品，該種標(biāo)準(zhǔn)樣品的優(yōu)點(diǎn)是可以對(duì)DNA的提取過(guò)程進(jìn)行質(zhì)控，同時(shí)還能避免造成氣溶膠污染。和上述研究相比，本研究研制的PCV1、PCV2核酸定性標(biāo)準(zhǔn)樣品，一方面是提供了PCV1和PCV2兩管標(biāo)準(zhǔn)樣品適用于各種標(biāo)準(zhǔn)中的分型方法；另一方面本研究中的標(biāo)準(zhǔn)樣品是基于PCV1和PCV2的全基因序列研制的，適用于所有類(lèi)型的PCV核酸檢測(cè)方法；除此之外，還通過(guò)數(shù)字PCR技術(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確定量，將標(biāo)準(zhǔn)樣品中的質(zhì)?？截悢?shù)控制在104左右，最大限度地降低了氣溶膠污染的發(fā)生。

綜上所述，本研究研制的PCV1、PCV2核酸定性標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性和穩(wěn)定性均比較理想，經(jīng)過(guò)多家實(shí)驗(yàn)室的臨床試用為合格，通過(guò)了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)組織的專(zhuān)家評(píng)審，能夠促進(jìn)PCV實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。