微小核糖核酸在乳腺癌中的研究進展

張娜娜,沈 濱,陳 晰,梁文龍,張建國

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 乳腺外科,黑龍江 哈爾濱,150086)

全球超過226萬女性患乳腺癌，約占所有新確診癌癥人數(shù)的11.7%,占女性新確診癌癥人數(shù)的24.5%,發(fā)病率居女性癌癥首位。目前已有腫瘤相關(guān)蛋白如CEA、CA153等用于腫瘤輔助診斷，但敏感性和特異性較低。早期診斷乳腺癌并及時治療是提高患者生存率的關(guān)鍵所在，因此需要找到敏感性和特異性較高的檢測方法。微小核糖核酸(miRNAs) 是一類高度保守、長18～25個核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼小分子RNA[1-2]。miRNAs由DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，但不翻譯成蛋白質(zhì)，而是調(diào)節(jié)其他基因的蛋白質(zhì)合成，因此miRNAs 可調(diào)控其他蛋白質(zhì)編碼基因。其參與生物體細胞分化、增殖、衰老、代謝、病毒防御、器官形成、胚胎發(fā)育以及免疫應答等生命活動[3-7],與腫瘤、心腦血管疾病、代謝性疾病及免疫性疾病等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。在腫瘤中,miRNAs通常以癌基因或抑癌基因的角色參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。抑癌性 miRNAs(suppressor-miRNAs)與腫瘤發(fā)生呈負相關(guān)，其表達下調(diào)或失活將直接導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展;致癌性miRNAs(onco-miRNAs)與腫瘤發(fā)生呈正相關(guān)，其過表達或持續(xù)活化將直接導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展[9]。miRNAs通過其靶基因、上游轉(zhuǎn)錄因子及各種反饋調(diào)控回路相互交織組成了復雜的生物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制。存在于外周血和體液中的游離miRNAs (循環(huán)miRNAs),具有出現(xiàn)早、穩(wěn)定性高、組織和腫瘤特異性等優(yōu)點，是最具潛力的腫瘤分子標志之一，有望應用于乳腺癌的早期診斷、分子分型、療效監(jiān)測與預后預測等各個階段。

1 miRNAs的形成

核基因組中的miRNA首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄為具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(stem-loop struc-ture)的初級miRNA(pri-miRNA),后者被RNA聚合酶Ⅲ-Drosha-DGCR8 復合體切割，形成仍保留莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA(pre-miRNA)。轉(zhuǎn)運蛋白輸出蛋白5 (Exportin-5)將識別其突出于3′端的標志并與之結(jié)合，借助G蛋白(Ran-GTP)轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)。在胞質(zhì)中，一種叫Dicer的核酶將在雙鏈RNA結(jié)合蛋白(TRBP)和AGO蛋白質(zhì)2(AGO2) 的協(xié)助下識別前體miRNA雙鏈的5′末端磷酸及3′末端突出，在RNA聚合酶III的參與下，于莖干的兩個螺旋轉(zhuǎn)彎處切割復式結(jié)構(gòu)的兩條鏈，形成miRNA:miRNA*復式結(jié)構(gòu)。后者在解旋酶(helicase)的作用下，最終形成成熟的單鏈miRNA(多數(shù)為miRNA,miRNA*通常被降解)，進入核蛋白復合體參與形成RNA誘導的沉默復合體(miRISC),進而發(fā)揮生物學作用[10-12]。

2 miRNAs在乳腺癌中的功能

miRNAs不僅可調(diào)控乳腺相關(guān)癌基因、抑癌基因編碼蛋白的表達，也可調(diào)控乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)信號途徑中蛋白、微環(huán)境中血管上皮細胞、免疫細胞的重要蛋白，并可通過調(diào)控藥物靶分子、藥物轉(zhuǎn)運蛋白、甲基化或組蛋白修飾酶、細胞周期調(diào)控蛋白，影響藥物敏感性和繼發(fā)耐藥等。miRNAs調(diào)控細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯，還以微囊或外泌體為載體，通過“細胞間信息傳遞”調(diào)控其他細胞。研究[13]發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞分泌含有miR-200的外泌體，被低轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞內(nèi)吞后，轉(zhuǎn)化為高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞。血清外泌體mir-373可作為侵襲性、三陰性和激素受體陰性乳腺癌的生物標志物。血清外泌體miR-105可能具有預測或早期診斷發(fā)展或已經(jīng)發(fā)展為乳腺癌轉(zhuǎn)移的潛力[14]。

2.1 miRNAs與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移

miRNAs 在正常組織及腫瘤中表達存在著顯著差異，這種miRNAs表達的多態(tài)現(xiàn)象與腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的風險存在正相關(guān)或負相關(guān)。研究[15]發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性乳腺癌血清中miRNA-21、miRNA-29b、miRNA-29c、miRNA-98、miRNA-181b、miRNA-181d、miRNA-155、miRNA-365表達上調(diào)，miRNA-30a-3p、miRNA-31、miRNA-127、miRNA-140、miRNA-320、miRNA-355和miRNA-497表達下調(diào)，其中miRNA-21上調(diào)最為顯著，與腫瘤進展、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、生存時間有關(guān)。數(shù)據(jù)表明,miR-182-5p和miR-409-3p降低了Ras抑制蛋白1(RSU1)、PINCH蛋白1(PINCH1),抑制了PTEN(一新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因)表達的ATF2激活[16]。TINCR(長非編碼lncRNA命名的組織分化誘導非蛋白編碼RNA)在乳腺癌組織中的表達水平顯著高于癌旁組織(P<0.001),在癌組織中miR-589-3P表達水平顯著低于正常組織(P<0.001)。TINCR和miR-589-3p表達水平呈負相關(guān)(r=-0.331;P=0.006)。Kaplan-Meier總體生存曲線結(jié)果表明,TINCR表達高水平的患者在5年內(nèi)生存率較低(P<0.05)。miR-589-3p可能靶向下調(diào)乳腺癌細胞TINCR的表達，抑制乳腺癌細胞增殖，促進其凋亡[17]。miRNA-205在三陰性乳腺癌中表達下調(diào)，通過靶向控制ZEB1、ZEB2來減少MET(上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化)的過程[18]。miR-183/-96/182簇在乳腺癌中表達也上調(diào)[19]，其異位表達促使乳腺癌和其他癌細胞[20-21]的細胞增殖、遷移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)。在乳腺癌中，大約75%的晚期乳腺癌患者檢測到骨骼轉(zhuǎn)移[22],盡管乳腺癌的治療有所改善，但在骨轉(zhuǎn)移的發(fā)展階段，乳腺癌目前是無法治愈的，因此骨轉(zhuǎn)移診斷后的中位生存時間在12～53個月[22]。骨轉(zhuǎn)移降低了患者的生活質(zhì)量，縮短了患者的預期壽命。在一項關(guān)于乳腺癌分子亞型的研究[23]中,Ki67的免疫組織化學染色與人表皮生長因子2(HER2)和雌激素受體(ER)的分析相結(jié)合，結(jié)果顯示ER陽性HER2陰性腫瘤的骨轉(zhuǎn)移率較其他亞型高，Ki67評分大于13。研究[24]表明,miR-30家族成員在骨轉(zhuǎn)移中的作用是通過調(diào)控miR-30的過度表達來抑制骨中腫瘤的生長，減少骨破壞，抑制癌細胞侵襲。miR-30水平與ER/PR狀態(tài)相關(guān),ER/PR陰性細胞表達的miR-30家族成員水平低于ER/PR陽性細胞[24]。乳腺癌腦轉(zhuǎn)移同樣是治療的一大難點，血腦屏障限制藥物進入和引起腫瘤細胞死亡，使大腦成為“避難所”。miR-101-3p的表達在腦轉(zhuǎn)移性乳腺癌細胞中丟失，而miR-101-3p的異位表達通過減少環(huán)氧化酶(COX-2)/基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP1)表達來減少癌細胞通過腦內(nèi)皮細胞的遷移，從而干擾內(nèi)皮間連接，即BCBM(乳腺癌腦轉(zhuǎn)移)級聯(lián)由miRNAs調(diào)控[25]。miRNAs通過各種調(diào)節(jié)通路控制著乳腺癌的發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移。

2.2 miRNAs與乳腺癌的診斷

一些miRNAs在乳腺癌早期表達異常，循環(huán)miRNAs由壞死腫瘤細胞釋放或活腫瘤細胞主動分泌，直接來源于腫瘤細胞[26],可能與腫瘤細胞存在一致性。相關(guān)研究[27]選擇5種分子亞型中顯著差異表達的miRNAs和mRNAs,選擇有效的miRNAs和mRNAs子集，用于乳腺癌亞型的分層。6個miRNAs (miR-190b、miR-18a、miR-301a、miR-34c-5p、miR-18b和miR-129-5p),6個mRNAs (HAUS6、LAMA2、TSPAN33、PLEKHM3、GFRA3和DCBLD2),結(jié)果表明，所選擇的miRNAs和mRNAs對乳腺癌亞型分層具有重要意義，這12個miRNAs和mRNAs可作為乳腺癌亞型分層的診斷生物標志物。ROTH C等[28]對59例原發(fā)乳腺癌患者、30例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者和29例健康對照者的血清miRNAs比較分析，發(fā)現(xiàn)miR-155、miR-10b和miR-34a水平不僅可區(qū)分乳腺癌與健康對照，而且可鑒別原發(fā)和轉(zhuǎn)移性乳腺癌。SCHWARZENBACH H等[29]研究了102例術(shù)前和34例術(shù)后乳腺癌患者、32例良性腫瘤患者和53例健康人血漿miRNAs水平，發(fā)現(xiàn)miR-20a和miR-21在良、惡性腫瘤患者均高于健康對照，而乳腺癌患者血漿miR-214顯著高于良性腫瘤患者。可見循環(huán)miRNAs具有組織和腫瘤特異性，其含量和組成變化直接反映腫瘤來源和發(fā)生，并且有些miRNAs在腫瘤發(fā)生的早期出現(xiàn)，具備腫瘤診斷生物標志的潛力。

循環(huán)miRNAs對早期乳腺癌檢測敏感性和特異性優(yōu)于目前臨床常用的腫瘤標志物檢測,LIU L等[30]研究分析表明miRNAs對乳腺癌診斷的總敏感性為77%,特異性為88%。GAO J等[31]對89例早期乳腺癌患者和55例健康對照者分別采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)測定循環(huán)miR-21,用化學熒光法檢測CEA和CA-153,循環(huán)miR-21檢測敏感性為87.6%,特異性為87.3%,CEA和CA-153的敏感性分別為22.4%和15.7%。新一代測序和PCR芯片等高通量技術(shù)分析循環(huán)miRNAs表達譜，可提高檢測的靈敏度。CUK K等[32]篩選出1組miRNAs (miR-127-3p、miR-376a、miR-652、miR-148b、miR-409-3p、miR-801、miR-376c)可鑒別乳腺癌和良性腫瘤(AUC=0.81),且對年輕女性(<50歲)的準確性更高(AUC=0.86)。

血清miRNAs主要檢測方法有克隆測序、RNA印跡雜交、基因芯片、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)等技術(shù)。血清miRNAs穩(wěn)定，可以抵抗核糖核酸酶 (RNAse)、加熱、pH值變化，并能長期保存和反復凍融，可以實現(xiàn)無創(chuàng)檢測[33]。血清miRNAs能夠作為腫瘤的生物標志物，并可提供一種非損傷性的腫瘤診斷手段。

2.3 miRNAs與乳腺癌的治療

miRNAs的表達失調(diào)可以引起多種疾病，因此調(diào)控miRNAs的表達也可以作為一種疾病的治療手段。目前應用miRNAs治療腫瘤的策略主要有:① 基因治療，針對在腫瘤組織中下調(diào)的miRNA,轉(zhuǎn)染pre-miRNA糾正miRNAs的表達，抑制腫瘤細胞的增殖或誘導其凋亡;利用反義RNA或小干擾RNA技術(shù)，有效抑制某個原癌基因miRNAs的表達。② 藥物治療，利用藥物調(diào)控相關(guān)miRNA的表達，進而達到治療目的。

KIM S J等[34]發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞系及乳腺癌癌組織中,miR-145與其靶基因(fascin-1、c-myc,SMAD2/3、IGF-1R等)存在負相關(guān)關(guān)系，研究者將腺病毒構(gòu)建的miR-145用于乳腺癌細胞系的體外試驗以及乳腺癌小鼠的體內(nèi)試驗，發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)及體外試驗中腺病毒構(gòu)建的miR-145均能抑制腫瘤細胞的生長和活力，且miR-145與5-氟尿嘧啶聯(lián)合應用抑癌作用更佳，因此miR-145對治療乳腺癌具有價值。KRüTZFELDT J等[35]將與膽固醇偶聯(lián)的反義寡聚脫氧核苷酸 (AMO) 注射小鼠靜脈后，體內(nèi)多種器官的miRNAs表達水平降低，且注射后第3日小鼠體內(nèi)檢測不到靶向miRNAs，并在數(shù)周內(nèi)都未檢測到，證明修飾AMO能較長時間內(nèi)有效降低靶miRNAs的水平，因此這種修飾的AMO有可能成為新型治療藥物。丹麥SantarisPharma公司研發(fā)的miravirsen (一種靶向抑制miR-122的RNA候選藥物)于2008年進入Ⅰ期臨床試驗治療丙型肝炎病毒感染患者，并于2010年9月進行Ⅱ期臨床試驗，展示了miRNAs藥物用于臨床的可能性。白藜蘆醇上調(diào)miR-141和miR-200c在MDA-MB231乳腺癌中的表達。上調(diào)miR-141和miR-200c可降低侵襲性和EMT[36]。姜黃素誘導mir-181b,抑制細胞增殖和轉(zhuǎn)移，促進癌細胞凋亡[37]。在綠茶中發(fā)現(xiàn)的表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯可通過上調(diào)mir-16和阻礙Bcl2和mir-21抗癌[38]。因此乳腺癌miRNAs藥物有望在臨床上使用。

2.4 miRNAs與乳腺癌的療效監(jiān)測及預后

miRNAs可調(diào)控激素受體、藥物代謝、細胞周期、凋亡、組蛋白修飾和DNA損傷修復等相關(guān)蛋白的表達[39],影響腫瘤細胞生長繁殖、侵襲轉(zhuǎn)移，與乳腺癌的療效及預后密切相關(guān)。

HENEGHAN H M等[40]對乳腺癌組和對照組血液中7種候選miRNAs比較分析，確認miR-195和let-7a在乳腺癌中高表達，手術(shù)切除腫瘤后分別降低11倍和19倍，因此miR-195和let-7a不僅可診斷乳腺癌，還可作為治療效果評價指標。研究報道m(xù)iR-10b、miR-21、miR-155表達水平高的TNBC(三陰性乳腺癌)患者預后較差，總生存期和無復發(fā)生存期均較短。MADHAVAN D等[41]采用miRNA芯片篩選與循環(huán)腫瘤細胞(CTC)狀態(tài)相關(guān)的miRNAs,在61例陽性(CTC+)、60例低水平和72例陰性(CTC-)轉(zhuǎn)移性乳腺癌(MBC)患者中驗證，發(fā)現(xiàn)血漿miRNAs (miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-203、miR-210、miR-375、miR-801)在CTC+的MBC患者血漿中水平高于CTC-的MBC患者，其中miR-200b表達差異最為顯著。單獨miR-200b和上述miRNAs表達譜均與總生存期(OS)和無進展生存期(PFS)相關(guān)。MADHAVAN D等[41]發(fā)現(xiàn)在CTC陽性乳腺癌患者中循環(huán)miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-203和miR-210表達水平升高,miR-375和miR-768-3p表達水平降低，循環(huán)miRNAs表達譜與患者總生存期的相關(guān)性高于CTC狀態(tài)。EICHELSER C等[42]研究顯示血漿中外泌體miRNA-373表達水平在TNBC和激素受體陰性(ER-/PR-)乳腺癌患者中高于激素受體陽性(ER+/PR+)乳腺癌患者,miR-373水平與侵襲表型相關(guān)。其他研究也相繼發(fā)現(xiàn)血漿/血清miR-210、miR-21、miR-155、miR-214、miR-19a等表達水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠處轉(zhuǎn)移相關(guān)[43-45]。

3 miRNAs在乳腺癌中的應用前景及存在問題

循環(huán)miRNAs具備作為腫瘤生物標志的特征和臨床應用潛力，但在成功應用于臨床之前尚有一些理論和技術(shù)問題有待解決:① 乳腺癌與其他腫瘤一樣存在高度異質(zhì)性，發(fā)生和發(fā)展過程涉及多個基因的改變，相關(guān)miRNAs數(shù)量和種類眾多，循環(huán)miRNAs既可由壞死腫瘤細胞被動釋放，又可由活細胞主動分泌，因而循環(huán)miRNAs的組成和含量可能呈現(xiàn)隨機性和動態(tài)波動性;② 研究對象的特征(年齡、種族、病理分期、腫瘤組織學分型和分子亞型)不同，患者的miRNAs表達譜可存在差異;③ 循環(huán)miRNAs的研究采用了全血、血漿和血清樣本，全血標本因受到淋巴細胞內(nèi)miRNAs的干擾，對結(jié)果的影響較大;血清和血漿相對更為穩(wěn)定，但也存在細微差別，因在凝血過程中少量淋巴細胞裂解釋放miRNAs，通常血清中miRNAs濃度略高于血漿;④ qRT-PCR是最常用檢測方法之一,PCR結(jié)果的校正方法和參照不同也會產(chǎn)生偏差。在miRNAs的基因治療中也存在需要解決的諸多問題，例如miRNAs與靶mRNA之間的作用依靠序列間的堿基互補配對，且miRNAs可以調(diào)控與之不完全配對的靶基因的表達。因此，一個miRNA可以調(diào)控多個靶基因的表達，可能產(chǎn)生脫靶效應。如何開發(fā)高效的miRNAs傳遞系統(tǒng)是研究的另一個重點，針對不同類型的腫瘤應采用不同的傳遞系統(tǒng)，更合適的傳遞系統(tǒng)仍需進一步研究。

隨著循環(huán)miRNAs臨床研究和方法的成熟，可以預期將來miRNAs可應用于臨床腫瘤的早期診斷、用藥指導和預后預測等。