響應面法優(yōu)化黑牛肝菌多酚提取工藝及其抗氧化活性研究

胡棟寶，鄭付聰，楊 猛，張濟祥

(玉溪師范學院 化學生物與環(huán)境學院, 云南 玉溪 653100)

植物多酚是多羥基化合物總稱，具有抗氧化性、抗衰老、抗腫瘤等多種生物活性[1]，近年來多酚類物質的活性研究已越來越多地引起學者們的廣泛關注[2]。 黑牛肝菌(Boletusaereus)是一種可食用菌，口感香脆，味道鮮美，藥用價值頗高，含有多糖、多酚等多種活性成分，其多糖對小鼠酒精性肝損傷具有明顯保護作用[3-4]，其提取物對大鼠具有明顯的降血脂及抗氧化作用[5]。響應面分析法是采用多元二次回歸方程作為函數(shù)來優(yōu)化提取工藝過程的一種高效實用的方法，可信度高，被廣泛應用于各種化工過程的提取工藝優(yōu)化研究中。目前有關黑牛肝菌多糖的藥理活性報道較多[3-5]，但關于其響應面法多酚提取及抗氧化活性的研究尚未見文獻報道。為了充分利用該食用菌資源，本研究利用超聲波輔助提取響應面優(yōu)化法獲取黑牛肝菌多酚提取的最佳工藝條件，并利用DPPH自由基清除等試驗研究黑牛肝菌多酚提取物的抗氧化活性，為該食用菌功效成分的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑牛肝菌(云南省玉溪市新平縣)；福林酚試劑(分析純,上海金穗生物科技有限公司)；沒食子酸標準品(分析純，武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司)； 1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(分析純，Sigma公司)；抗壞血酸(分析純，天津市雙船化學試劑廠)；2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)(分析純，成都艾科達化學試劑有限公司)；磷酸氫二鈉、過硫酸鉀(分析純，天津市鳳船化學試劑科技有限公司)；三氯乙酸(分析純，天津市大茂化學試劑廠)；無水碳酸鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯化鐵、無水乙醇(分析純，西隴科學股份有限公司)。

1.2 主要儀器

分析天平(上海奧豪斯儀器有限公司)；超聲清洗儀(上海聲源超聲波儀器設備有限公司)；UV-2700紫外分光光度計(日本島津公司)； SHZ -DS-III型循環(huán)水真空泵(河南鞏義市予華儀器有限責任公司)；RE2000A 型旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準液的配制

取0.005 g沒食子酸標準品蒸餾水溶解，置于50 mL容量瓶,定容至刻度線, 即得濃度為0.1 mg/mL的標準溶液。

1.3.2 標準曲線的建立

準確量取上述標準液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于50 mL比色管中，依次加入30 mL蒸餾水、2.5 mL福林酚試劑、7.5 mL質量百分數(shù)10%的碳酸鈉溶液，于61℃水浴反應10 min，全波長掃描，于770 nm測定吸光值，以標準液為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線[6]，標準曲線為Y=149.93x+0.0182,R2=0.9985。

1.3.3 樣品中多酚的測定

準確吸取樣品溶液0.5 mL于50 mL比色管，分別加入30 mL蒸餾水、 2.5 mL福林酚試劑、7.5 mL質量百分數(shù)10%的碳酸鈉溶液,于61℃水浴反應10 min，冷卻后在770 nm處測定其吸光度。

1.4 單因素試驗

1.4.1 乙醇體積分數(shù)對多酚提取量的影響

將黑牛肝菌子實體于60℃烘箱中烘3 h后,溫度調至80℃，烘干至恒重, 粉碎, 混勻,置于干燥器中待測。準確稱取0.5000 g黑牛肝菌粉末，超聲提取20 min，在液料比為40∶1 (mL/g)，乙醇濃度設置為6個水平(30%、40%、50%、60%、70%、80%)，探究不同乙醇體積分數(shù)對多酚提取量的影響。

1.4.2 液料比對多酚提取量的影響

0.5000 g黑牛肝菌粉末,超聲提取20 min,乙醇濃度70%條件下，液料比設置6個水平(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1 mL/g)，探究不同液料比對多酚提取量的影響。

1.4.3 超聲時間對多酚提取量的影響

0.5000 g黑牛肝菌粉末，超聲提取20 min，液料比為40∶1 (mL/g)，乙醇濃度70%，提取時間因素設置5個水平(10、15、20、25、30 min)，探究超聲時間對多酚提取量的影響。

1.4.4 提取次數(shù)對多酚提取量的影響

在超聲提取20 min，液料比為40∶1(mL/g)，乙醇濃度70%，提取次數(shù)因素設置5個水平(1、2、3、4、5次)，探究提取次數(shù)對多酚提取量的影響。

1.5 響應面法試驗

利用Design- Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Behnken設計四因素三水平試驗。按照單因素試驗結果，響應面試驗選用乙醇體積分數(shù)(A)、液料比(B)、提取時間(C)和提取次數(shù)(D)四個因素作為試驗因素，以多酚提取量為考察指標，對黑牛肝菌中多酚提取工藝進行優(yōu)化，進而找出其最佳工藝條件[7-11]，試驗因素水平見表1。

表1 試驗因素水平設計

1.6 抗氧化實驗

1.6.1 清除DPPH自由基能力的測定

取1.00 mL DPPH溶液于比色管中，分別加入1.00 mL不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL)的樣品溶液或Vc溶液，室溫避光反應30 min，無水乙醇調零[10]，517 nm處測定其吸光值A2。

A1:反應時間t=0時的空白吸光度；A2:樣品液或Vc溶液在室溫避光反應30 min時的吸光度。

1.6.2 清除ABTS+自由基能力的測定

取4.00 mL ABTS+溶液于10 mL比色管中，分別加入1.00 mL不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL)的樣品液或Vc溶液，反應10 min，734 nm測吸光度A2[11]。

A1:空白對照的吸光度；A2:樣品液或Vc溶液的吸光度。

1.6.3 還原Fe3+能力的測定

取2.50 mL不同濃度(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL)的樣品液或Vc溶液于比色管中,依次吸取2.50 mL 濃度為 0.20 mol/L的磷酸緩沖溶液(pH 6.6)、2.50 mL質量分數(shù)1%的鐵氰化鉀溶液，在50℃水浴20 min后快速冷卻，加入2.50 mL質量分數(shù)10%的三氯乙酸溶液，靜置10 min，取上層清液2.50 mL，加入0.50 mL質量分數(shù)0.1%三氯化鐵溶液室溫下放置10 min,700 nm下測定吸光度A[12]。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1 乙醇濃度對黑牛肝菌多酚提取量的影響

由圖1可知, 黑牛肝菌中多酚的提取量隨乙醇濃度的增大先增大后減小，濃度為60%時達到最大，之后乙醇濃度增大多酚提取量降低，原因可能是高濃度乙醇溶液會增大整個提取體系的粘度，不僅降低多酚的析出，還會增大一些醇溶型雜質和多糖等一些大極性成分的溶出[13]。

圖1 乙醇濃度對黑牛肝菌多酚提取量的影響Fig. 1 Effects of ethanol concentration on the yield of polyphenols

2.1.2 液料比對黑牛肝菌多酚提取量的影響

如圖2所示，在液料比低于40∶1 mL/g時，其提取量隨著液料比的增大而漸漸升高，在液料比達到40∶1 mL/g時多酚提取量最大，之后則提取量逐漸降低，原因可能是在液料比40∶1 mL/g時多酚析出趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增加溶劑會提高多糖或其他雜質的析出，從而使多酚的溶出受到抑制[14]。

圖2 液料比對黑牛肝菌多酚提取量的影響Fig.2 Effects of liquid-solid ratio on the yield ofpolyphenols

2.1.3 超聲提取時間對黑牛肝菌多酚提取量的影響

如圖3所示，黑牛肝菌中多酚的提取量隨超聲時間的增加先升后降， 在20 min時提取量最大，之后隨著超聲時間的增長提取量漸漸降低，原因可能是在20 min后由于提取時間過長有部分多酚發(fā)生了氧化反應，從而降低了多酚的含量[15]。

圖3 超聲時間對黑牛肝菌多酚提取量的影響Fig.3 Effects of ultrasonic time on the yield of polyphenols

2.1.4 提取次數(shù)對黑牛肝菌多酚提取量的影響

如圖4所示，多酚提取量隨提取次數(shù)的增加而緩慢增大，提取次數(shù)為2次時多酚得率最高，繼續(xù)增加提取次數(shù)，長時間的超聲波作用會使原料細胞破裂程度加大，增加雜質溶出，甚至破壞多酚物質的化學結構，此結論與茹月蓉等[13]對青岡櫟果殼多酚的研究結果以及蘇適等[16]對無花果黃酮的研究結果一致。因此，選擇提取次數(shù)2次為較優(yōu)條件。

圖4 提取次數(shù)對黑牛肝菌多酚提取量的影響Fig.4 Effects of extraction times on the yield of polyphenols

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 響應面試驗設計結果

根據(jù)Design-Expert軟件設計試驗方案，如表2所示。選取乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)和提取次數(shù)(D)為變量，選定響應值(提取量)，進行擬合分析，得到黑牛肝菌多酚提取量回歸方程。

表2 響應面試驗設計結果

2.2.2 響應面方差分析結果

由表3可知，黑牛肝菌提取多酚的響應曲面回歸模型的系數(shù)顯著性與方差分析結果，模型項F值為68.48,P<0.000 1極顯著性(P<0. 01),失擬項P=0.050 7不顯著(P>0.05),故利用此模型找到黑牛肝菌多酚提取量的最優(yōu)提取條件。 A、B和D三個因素對黑牛肝菌中多酚影響極顯著(P<0.01)。四個二次項曲面效應也同樣明顯，AC、BC和CD交互項效應影響極顯著，影響大小順序為:A乙醇濃度>D提取次數(shù)>B料液比>C超聲提取時間。

表3 響應面方差分析結果

2.2.3 響應面分析

利用Design-Expert 軟件對黑牛肝菌中多酚含量開展二次多元回歸擬合，固定四個變量中的三個為不變值，把變量與另三個因素擬合為三維曲面圖，擬合目標函數(shù)為數(shù)學模型，進而繪制因變量曲面圖，3D響應曲面見圖5。通過響應面分析，最終確定黑牛肝菌中多酚最佳提取條件，即乙醇濃度60%，液料比40∶1(mL/g)，超聲提取時間20 min，提取次數(shù)2次。

圖5 多酚含量與提取各因素間的交互作用Fig. 5 Response surface plots for the effects of cross-interactions among different factors on the extraction rate of polyphenol

2.3 結果與分析

2.3.1 清除DPPH自由基能力

如圖6所示，黑牛肝菌中多酚提取液和抗壞血酸溶液清除DPPH自由基的能力隨濃度增加效果也逐步增強，且在相同濃度條件下黑牛肝菌中多酚的清除率強于抗壞血酸溶液。當濃度為0.1 mg/mL時，黑牛肝菌中多酚提取液的DPPH自由基清除率最高可達到95.45%。黑牛肝菌中提取的多酚具有強的體外抗氧化活性可能與其富含對苯二酚、對聯(lián)三苯酚類物質有關[18]。

圖6 清除DPPH自由基能力Fig. 6 Result of DPPH scavenging activities

2.3.2 清除ABTS+自由基能力

如圖7所示，隨濃度增加，黑牛肝菌多酚提取液和抗壞血酸溶液對ABTS+自由基清除率逐漸增強。在濃度為0.04 mg/mL時，黑牛肝菌多酚提取液的清除率接近90%，對ABTS+自由基具有強的清除活性。

圖7 清除ABTS+自由基能力Fig. 7 Result of ABTS+ scavenging activities

2.3.3 還原Fe3+能力

如圖8所示，隨著黑牛肝菌提取液和抗壞血酸溶液濃度的增加，吸光度值呈遞增趨勢，對Fe3+還原能力增強，黑牛肝菌多酚提取液對Fe3+的還原能力在相同濃度下強于抗壞血酸溶液。

圖8 還原Fe3+能力Fig. 8 Result of reducing Fe3+ activities

3 結 論

利用響應面法對黑牛肝菌中多酚提取工藝進行優(yōu)化，采用DPPH自由基清除、ABTS+自由基清除及還原Fe3+三種實驗方法測定了其抗氧化活性。在單因素試驗基礎上，通過響應面試驗得到黑牛肝菌中多酚最優(yōu)提取工藝：乙醇濃度60%，液料比40∶1(mL/g)，提取時間20 min，提取次數(shù)2次。黑牛肝菌多酚抗氧化活性實驗表明，黑牛肝菌多酚提取液具有強的清除DPPH自由基、ABTS+自由基及Fe3+還原能力，為黑牛肝菌資源的開發(fā)和利用提供科學依據(jù)。