丹參葛根藥對治療2型糖尿病的藥效學(xué)研究

張娜，李雪嘉,2，江曉紅，吳佳萍，吳立蓉

(1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣東藥科大學(xué)廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006； 3.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院, 廣東 廣州 510006)

糖尿病 (diabetes mellitus,DM) 是一類由于遺傳和環(huán)境作用，導(dǎo)致胰島素分泌缺陷以及靶細(xì)胞對胰島素敏感性降低，從而引起的以血糖增高為特征的代謝性疾病。近幾十年來，全世界2型糖尿病(T2DM)的患病率逐漸升高。我國糖尿病患病率從2010年的9.3%上升到10.9%，是全球糖尿病人數(shù)最多的國家[1]。糖尿病患者的典型癥狀表現(xiàn)為三多一少、口干等。目前認(rèn)為，T2DM發(fā)病的重要誘因是血脂代謝的紊亂，因此，T2DM治療過程中及時(shí)控制血糖、調(diào)節(jié)血脂尤為重要。目前主要通過口服降糖西藥治療，雖然能夠有效控制血糖升高,但常出現(xiàn)低血糖癥和胃腸道不適等不良反應(yīng)[2]，降低患者生活質(zhì)量。糖尿病屬于中醫(yī)“消渴病”范疇,中醫(yī)治療糖尿病主要方法是清熱潤燥、養(yǎng)陰生津。中醫(yī)根據(jù)上述治則辨證組方治療之后,可以發(fā)揮出中藥的整體調(diào)節(jié)優(yōu)勢,起到標(biāo)本兼治的作用,且中藥較西藥藥性溫和持久、副作用小[3-5]。

中藥葛根性涼，具有生津止渴、升陽止瀉、解肌退熱、通經(jīng)活絡(luò)等作用。丹參,苦,性涼,具有活血祛瘀、涼血消癰、通經(jīng)止痛之功。丹參葛根配伍具有升陽化瘀、通脈止痛的作用，二者作為藥對配伍使用治療2型糖尿病，出自《施今墨對藥》，現(xiàn)代醫(yī)家祝諶予認(rèn)為葛根丹參藥對可治療消渴兼血瘀以及長期應(yīng)用胰島素伴有血管病變的并發(fā)癥,對改善血液循環(huán),降低血糖、血脂均有較好的療效[6]；陳澈[7]從369篇中醫(yī)治療T2DM的相關(guān)文獻(xiàn)中分析了444個(gè)方劑，發(fā)現(xiàn)丹參、葛根分別位于治療T2DM常用中藥的第4位和第5位，而丹參葛根藥對是中醫(yī)治療瘀血阻絡(luò)、陰虛熱盛類T2DM常用藥對，二者協(xié)同更有利血液運(yùn)行，常針對瘀血阻滯的病機(jī)環(huán)境[8]。但丹參葛根藥對治療糖尿病的作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)通過建立鏈脲佐菌素(STZ)和高脂飼料結(jié)合誘發(fā)的2型糖尿病大鼠模型，以評價(jià)丹參葛根藥對對2型糖尿病大鼠血糖和血脂的藥效作用，為丹參葛根的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級35～38 d齡雄性大鼠40只，生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2018-0002，體質(zhì)量110～130 g,廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

STZ(美國Sigma公司，批號B05911)；二甲雙胍片(北京京豐制藥集團(tuán)有限公司,批號：180951)；檸檬酸、枸櫞酸鈉(分析純)；高脂飼料(廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,批號：20190618)；丹參(批號：20160086，產(chǎn)地：山東)、葛根(批號：181101，產(chǎn)地：江西)均購于廣州市誠濟(jì)藥業(yè)有限公司,分別由廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院馬鴻雁副教授鑒定為唇形科鼠尾草屬植物丹參的干燥根及豆科植物葛屬植物野葛的干燥根；堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(美康生物科技股份有限公司,批號：190919201)；低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?批號：H921)；三酰甘油(TG)試劑盒(羅氏診斷有限公司,批號：191051)；肌酐(Cr)試劑盒(伊川生物科技有限公司,批號：1951)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒(邁克生物股份有限公司,批號：1019041)；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(邁克生物股份有限公司,批號：0719031)

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

GA-3型安淮血糖儀(三諾生物傳感股份有限公司)；低溫高速離心機(jī)(上海赫田，中國)；BSA3202S型電子天平(Sarterius，德國)；-80 ℃超低溫冷凍冰箱(Therno公司，中國)；CCA-1112A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司制造)；Arcadia型組織包埋機(jī)(Leica公司)；RM2235型石蠟切片機(jī)(Leica公司)。

2 方法

2.1 丹參葛根水煎液的制備

分別稱取丹參和葛根，按質(zhì)量比1∶1比例混合，以2倍水煎煮2次，每次煎煮1 h，2次煎煮后的藥液混合過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至每毫升含生藥1 g和2 g，分別作為丹參葛根藥對的低、高劑量組，藥液放置于4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 2型糖尿病大鼠模型的建立

高糖高脂飼料加STZ誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性2型糖尿病大鼠模型[9-10]，具體方法：雄性SD大鼠，適應(yīng)性7 d,體質(zhì)量(200±20) g。將大鼠隨機(jī)分為正常組(Z)7只，糖尿病組(M)33只，正常組(Z)組喂以普通飼料，模型組(M)組喂以高脂飼料，持續(xù)喂養(yǎng)4周，于喂養(yǎng)的第28天晚禁食過夜，在第29天上午給予模型組大鼠一次性 ip STZ 35 mg/kg，正常組僅注射等體積的檸檬酸-枸櫞酸鈉緩沖溶液。3 d后全部大鼠禁食不禁水過夜，測量其空腹血糖，2 d后復(fù)測空腹血糖值，選擇平均空腹血糖值低的再次 ip STZ 15 mg/kg以提高成模率，成模率：96.97 %。

2.3 分組及給藥

造模成功后，將大鼠隨機(jī)分為模型組(M)8只，丹參葛根組高劑量組(H)7只，丹參葛根組低劑量組(L)9只，二甲雙胍組(Y)8只。丹參葛根高劑量組和丹參葛根低劑量組分別 ig 給予高、低劑量丹參葛根藥對3 mL 。模型組(M)和正常組(Z) ig 等量的蒸餾水，二甲雙胍組 ig 二甲雙胍200 mg/kg，持續(xù)給藥8周。

2.4 樣品采集

大鼠經(jīng)末次給藥后禁食12 h，10%(φ)水合氯醛麻醉后將大鼠仰臥固定于固鼠板上，腹主動(dòng)脈取血，置于采血管，4 ℃，14 500 r/min離心10 min后，取上清液于EP管中，并在-80 ℃冷凍保存?zhèn)溆?。同時(shí)快速取出大鼠腎臟及胰腺置于PBS溶液中，沖洗干凈后用4%(φ) 多聚甲醛溶液固定24 h，流水沖洗6 h 后石蠟包埋，切片。

2.5 藥效學(xué)研究

觀察造模前后及給藥后各組大鼠神態(tài)、毛色、攝食、飲水、體質(zhì)量及活動(dòng)等變化，稱量并記錄每周大鼠的體質(zhì)量、攝食量和平均飲水量，造模后每隔1周所有大鼠禁食不禁水12 h測空腹血糖值。

HE染色后觀察胰腺及肝臟組織學(xué)變化。按照相關(guān)試劑盒步驟分別測定血清TC、TG、LDL-C、ALP、Cr、ALT、AST 7項(xiàng)指標(biāo)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 丹參葛根藥對對2型糖尿病大鼠體質(zhì)量的影響

造模成功后正常組大鼠體質(zhì)量明顯高于模型組，且正常組大鼠毛色白，亮，有光澤，活潑，模型組和給藥組大鼠毛色發(fā)黃，無光澤感，精神狀態(tài)不佳。

在實(shí)驗(yàn)期間，給藥初期模型組大鼠體質(zhì)量與正常組相比，體質(zhì)量明顯下降(P<0.01),多飲多尿癥狀顯著。隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，給藥組較模型組相比，體質(zhì)量有明顯升高，其中，丹參葛根高劑量組體質(zhì)量與模型組體質(zhì)量差異更明顯。給藥末，給藥組大鼠多尿、多飲、多食癥狀有所減輕，丹參葛根低劑量組、丹參葛根高劑量組及二甲雙胍組體質(zhì)量較模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。結(jié)果見圖1。

與正常組比較:##P<0.01； 與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

3.2 丹參葛根藥對對2型糖尿病大鼠空腹血糖的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，造模后，除正常組以外，其余各組血糖均明顯升高，模型組與正常組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。二甲雙胍組和丹參葛根高、低劑量組均與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：丹參葛根藥對能有效降低2型糖尿病大鼠空腹血糖值。見表1。

表1 丹參葛根藥對對2型糖尿病大鼠血糖的影響

3.3 丹參葛根藥對對2型糖尿病大鼠血脂指標(biāo)的影響

如表2，與正常組相比,模型組大鼠血清中TG、TC及LDL的含量極顯著升高(P<0.01)，說明糖尿病大鼠體內(nèi)發(fā)生了明顯的脂代謝紊亂，而丹參葛根高、低劑量組血脂水平明顯下降，接近正常組，說明丹參葛根具有改善糖尿病脂代謝紊亂的作用。

3.4 丹參葛根藥對對2型糖尿病大鼠肝、腎功能指標(biāo)的影響

如表3所示，模型組大鼠血液中AST、ALT及ALP、Cr的含量顯著高于正常組(P<0.05或P<0.01)。丹參葛根藥對組AST、ALT及ALP、Cr含量極顯著下降(P<0.01)，說明丹參葛根對肝腎功能有一定的保護(hù)及修復(fù)作用。

表2 丹參葛根藥對對2型糖尿病大鼠血脂指標(biāo)的影響

表3 丹參葛根藥對對2型糖尿病大鼠肝腎功能指標(biāo)的影響

3.5 生化指標(biāo)熱圖分析

數(shù)據(jù)聚類然后展示聚類熱圖是近年來數(shù)據(jù)分析常用的方法之一，以漸進(jìn)的藍(lán)色和紅色展現(xiàn)出數(shù)據(jù)的疏密以及頻率的高低。本文用組間的血脂指標(biāo)構(gòu)建熱圖，直觀地展現(xiàn)出各指標(biāo)在樣本間的變化趨勢，更清晰地表示組間血脂指標(biāo)的差異性。見圖2。

熱圖是以顏色梯度來代表數(shù)據(jù)矩陣中數(shù)值的大小并根據(jù)樣品豐度相似性進(jìn)行聚類的一種圖形展示方式。將高豐度和低豐度的組別分塊聚集，通過顏色梯度及相似程度來反映多個(gè)樣品群落組成的相似性和差異性。熱圖聚類結(jié)果中，顏色代表代謝物豐度；縱向聚類表示不同生化指標(biāo)在各樣品間豐度的相似情況,兩組間距離越近，枝長越短，說明這兩組在各樣品間的豐度越相似；橫向聚類表示不同樣品的各生化指標(biāo)豐度的相似情況，與縱向聚類一樣，兩樣品間距離越近，枝長越短，說明這兩個(gè)樣品的各生化指標(biāo)豐度越相似。熱圖對應(yīng)的值為每一行樣品的相對豐度經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理后得到的值，顏色梯度由藍(lán)色到紅色表示相對豐度由低到高。圖2中正常組與丹參葛根低劑量組兩組間距離較近，枝長較短，且指標(biāo)含量顏色接近，說明兩組之間生化指標(biāo)豐度相似,進(jìn)一步說明了經(jīng)過丹參葛根治療后的大鼠與正常組大鼠各生化指標(biāo)接近。圖像中每一行代表一個(gè)樣本，每一列代表一個(gè)血脂指標(biāo)，圖像右邊對樣本進(jìn)行聚類分析，下面對血脂指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，顏色越紅表示指標(biāo)含量越高。圖中可以看出與對照組相比，模型組血脂與肝腎功能指標(biāo)顏色顯著不同，丹參葛根高、低劑量組指標(biāo)相對于模型組均下調(diào)，說明丹參葛根能有效調(diào)節(jié)脂代謝紊亂及肝臟和腎臟的損傷。

3.6 各組大鼠腎臟以及胰腺石蠟切片HE染色結(jié)果

結(jié)果見圖3。正常組大鼠腎臟未見異常，腎小管排列整齊。模型組大鼠腎小球萎縮，數(shù)量減少，系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)增生，并伴有局灶性的炎性細(xì)胞浸潤，丹參葛根藥對組腎臟病變明顯輕于模型組，腎小球基底膜厚度減小，增生明顯改善。正常組大鼠胰腺組織排列緊密，胰島為規(guī)則的橢圓狀細(xì)胞團(tuán)，胰島β細(xì)胞大小基本一致，界限明顯。模型組大鼠可見胰腺組織排列疏松，細(xì)胞形態(tài)不一，胰島體積縮小且有空虛區(qū)域，腺泡間間質(zhì)增多。丹參葛根藥對組大鼠胰島細(xì)胞排列疏松得到改善，結(jié)構(gòu)損傷較輕，胞質(zhì)略不均勻，胰島細(xì)胞分布較規(guī)則。表明丹參葛根藥對對2型糖尿病大鼠伴發(fā)的腎臟和胰腺損傷具有改善作用。

圖2 血脂指標(biāo)的熱成像分析

圖3 SD大鼠腎臟以及胰腺石蠟切片HE染色觀察結(jié)果(100×)

4 討論

糖尿病是一種以高血糖為主要臨床特征的代謝性疾病，已成為繼心血管疾病及腫瘤之后又一嚴(yán)重威脅人體生命健康的非傳染性疾病[11-12]。常伴有腎臟損傷、視網(wǎng)膜病變、動(dòng)脈粥樣硬化等多種嚴(yán)重并發(fā)癥。臨床研究表明[13-14],機(jī)體長時(shí)間處于高糖狀態(tài)時(shí)，會引發(fā)血脂代謝異常，產(chǎn)生過多活性氧自由基、糖基化終產(chǎn)物，使血管或臟器長期處于炎癥狀態(tài)，引起血管壁增厚，管腔狹窄等為主要表現(xiàn)的血管重構(gòu)及器質(zhì)性或功能性的臟器損害。

研究表明，糖尿病患者血脂異常時(shí)TC、TG的含量顯著升高[15]。糖尿病患者普遍胰島素水平降低或胰島素抵抗，使依賴于胰島素功能的脂蛋白脂肪酶的活性降低，水解TG的能力下降，導(dǎo)致患者體內(nèi)TG含量顯著增高[16]。另外2型糖尿病發(fā)生時(shí)，機(jī)體對葡萄糖的利用失調(diào)，脂肪分解增加，大量多余的脂肪酸被釋放入血，引起β細(xì)胞脂性凋亡、胰島素分泌減少，同時(shí)血中TC、TG含量增多，血管彈性降低，動(dòng)脈內(nèi)膜增厚，進(jìn)一步加重2型糖尿病。LDL-C是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病發(fā)生和發(fā)展中最主要的危險(xiǎn)因素。研究表明B型LDL(sd-LDL)對LDL受體的親和力較低，血漿清除延遲，同時(shí)與蛋白聚糖結(jié)合力較強(qiáng)，增加了其在動(dòng)脈壁中的滯留時(shí)間而更易被氧化，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生[17]。本研究中經(jīng)丹參葛根治療的糖尿病大鼠TC、TG及LDL水平低于模型組，有效調(diào)節(jié)2型糖尿病引起的血糖及血脂的紊亂。

肝臟作為胰島素作用的靶器官，肝臟受損直接影響葡萄糖的攝取和利用，使機(jī)體代謝紊亂加重，易導(dǎo)致2型糖尿病患者體內(nèi)發(fā)生胰島素抵抗[18]。ALT、AST、ALP是反映肝功能損傷的重要指標(biāo)，有研究表明，當(dāng)肝臟發(fā)生嚴(yán)重?fù)p壞或壞死時(shí)，AST水平同樣也會顯著升高，且升高程度與肝細(xì)胞受損程度一致[19]。本實(shí)驗(yàn)用藥組AST和ALT較模型組含量顯著下降(P<0.05)，說明丹參葛根對肝臟有一定的保護(hù)作用。血清Cr是臨床常用評估腎功能的指標(biāo)，血清內(nèi)Cr含量過高意味著腎小球?yàn)V過功能受損。血Cr水平升高與糖尿病、脂質(zhì)代謝紊亂、心血管疾病等的發(fā)生有關(guān)[20]，Cr降低有助于調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。本研究結(jié)果證實(shí)丹參葛根能有效降低Cr水平，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

綜上所述，2型糖尿病體內(nèi)血糖血脂紊亂并出現(xiàn)一定程度的肝腎損傷，丹參葛根的干預(yù)有助于減輕2型糖尿病大鼠糖脂代謝紊亂從而減少腎臟及肝臟損傷的發(fā)生。但是糖尿病及其并發(fā)癥的機(jī)制十分復(fù)雜，因此丹參葛根藥對對治療2型糖尿病的具體作用機(jī)制仍需后期進(jìn)一步研究。