PI3K信號通路的關(guān)鍵信號分子AKT和mTOR在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及意義*

吳國敏, 史珂蔓, 劉娟, 馮玲, 楊宇石, 李珀, 徐澍**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院 口腔組織病理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004)

膠質(zhì)瘤是源自神經(jīng)上皮的最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，由于其在空間的“占位”效應(yīng)及對局部腦組織功能的影響，手術(shù)切除常作為治療膠質(zhì)瘤的首選方法，然而因?yàn)槟[瘤呈浸潤性生長，且與正常腦組織無明顯分界，手術(shù)切除常不能完全做到病理切除，因此，患者容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)或向高級別轉(zhuǎn)化。目前，膠質(zhì)瘤仍高居顱內(nèi)腫瘤死亡率第一位，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，治療腦內(nèi)膠質(zhì)瘤的手段除了手術(shù)切除以外還加入了術(shù)后輔助放療和(或)化療，在化療藥物方面，替莫唑胺是目前治療膠質(zhì)瘤惟一有明確療效的[1]，因此，迫切需要在膠質(zhì)瘤中發(fā)現(xiàn)新的功能靶點(diǎn)，以研制出更有效的藥物。近年來，磷脂酰肌醇3′-激酶信號通路(the phosphatidylinositol 3′-kinase signaling pathway，PI3K)已逐漸成為了研究腫瘤發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)[2-3]，但該通路與人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系尚少見報(bào)道。因此，本研究擬采用免疫組織化學(xué)方法檢測PI3K信號通路的關(guān)鍵蛋白激酶B(AKT)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)，同時(shí)觀察這些指標(biāo)在不同性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位及分級患者的表達(dá)水平，以期為研究膠質(zhì)瘤的發(fā)生機(jī)制提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2009年1—12月腦外科收治的患者臨床資料，隨機(jī)選取45例患者的存檔蠟塊及25例其它非腫瘤病變的腦血管疾病患者的腦組織蠟塊，所有患者均為首次診斷，有完整的臨床資料，包括性別、年齡、家族史、腫瘤部位等。由2位有10年以上工作經(jīng)歷的副主任醫(yī)師采取雙盲法按照第4版《WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類》[4]對樣本分類和分級進(jìn)行確診。實(shí)驗(yàn)組納入膠質(zhì)瘤患者45例，男性23例、女性22例，<40歲29例、≥40歲16例，腫瘤發(fā)生于腦葉者34例、深部者11例，病理分級低級別(Ⅰ～Ⅱ級)30例、高級別(Ⅲ～Ⅳ級)15例；另取25例腦血管病患者的正常腦組織存檔蠟塊作為對照組，男性19例、女性6例，<40歲14例、≥40歲11例。實(shí)驗(yàn)組與對照組患者性別及年齡分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1主要試劑 免疫組化超敏反應(yīng)試劑盒、載玻片、乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt antigen retrieval solution，EDTA)、二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒(3,3-N-Diaminobenzidine tertrahydrochloride，DAB)及磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)均購于中國山東邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2.2主要儀器 高清顯微鏡(AxioLab.A1 Carl Zeiss)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(HM325 Thermo)、全自動(dòng)染色機(jī)(GeminiAS Thermo)、自動(dòng)封片機(jī)(ClearVue Thermo)、病理組織漂烘儀(RHY-Ⅲ 中威)、超純水機(jī)(ZYTEST-Ⅰ-40L卓越)、電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱(101-1AB 泰斯特)。

1.2.3抗體 免抗人AKT(A444)單克隆抗體(稀釋濃度1 ∶150)、免抗人mTOR(S2442) 單克隆抗體(稀釋濃度1 ∶200)及免疫組化二抗均購于中國南京沃爾森生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶法(SP)法，按試劑盒說明書操作，所有抗體試劑均現(xiàn)配現(xiàn)用。判讀標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《免疫組織化學(xué)反應(yīng)結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)》[5]，隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡(×400)視野，計(jì)數(shù)其中1 000個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，按著色強(qiáng)度計(jì)分，無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分及棕褐色為3分；計(jì)數(shù)隨機(jī)視野內(nèi)細(xì)胞核或(和)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒的細(xì)胞所占的比例，陰性為0分，≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分及≥75%為4分；將著色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)得分乘積>3分判定為陽性表達(dá)，≤3分判定為陰性表達(dá)；切片經(jīng)兩位副高以上病理診斷醫(yī)師雙盲法復(fù)查判讀，判讀達(dá)成一致后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用EXCEL、SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)(n)、率(%)表示，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)，2種蛋白表達(dá)的相關(guān)性應(yīng)用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分析，均以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AKT及mTOR的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組及對照組中的陽性表達(dá)見圖1A，AKT陽性著色定位主要在細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，而mTOR陽性著色定位主要在細(xì)胞核。AKT及mTOR在實(shí)驗(yàn)組及對照組中的陽性表達(dá)情況見圖1B。分析統(tǒng)計(jì)2種蛋白的表達(dá)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AKT表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組(29例/45例，64.4%)高于對照組(5例/45例，20%)，mTOR表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組(32例/45例，71.1%)高于對照組(7例/45例，28%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：A為SP法檢測各蛋白結(jié)果(箭頭表示陽性表達(dá)細(xì)胞)，B為各蛋白陽性表達(dá)率的條圖；(1)與對照組比較，P<0.05。圖1 兩組膠質(zhì)瘤患者腦組織中的AKT和mTOR蛋白表達(dá)(SP，×400) Fig.1 AKT and mTOR protein expression in brain tissue of glioma patients between the two groups (SP，×400)

2.2AKT及mTOR表達(dá)的相關(guān)性

統(tǒng)計(jì)分析AKT及mTOR表達(dá)的相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組AKT和mTOR的表達(dá)存在顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.448，P<0.01)；而對照組AKT和mTOR的表達(dá)無相關(guān)關(guān)系(r=-0.089，P>0.05)。見表1。

表1 兩組膠質(zhì)瘤患者腦組織細(xì)胞AKT和mTOR蛋白表達(dá)的相關(guān)性Tab.1 Relationship between AKT and mTOR protein expression in brain tissue of glioma patients between the two groups

2.3 實(shí)驗(yàn)組AKT及mTOR蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

實(shí)驗(yàn)組患者的腦組織在不同性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位、病理分級之間，AKT及mTOR的陽性表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)組AKT和mTOR蛋白的陽性表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系[n(%)]Tab.2 Relationship between positive expression of AKT and mTOR protein and clinicopathological parameters in experimental group[n(%)]

3 討論

膠質(zhì)瘤因其發(fā)生部位導(dǎo)致臨床上很難做到完全根治，即使是經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化療程治療后的一些患者，出現(xiàn)復(fù)發(fā)的機(jī)率并沒有明顯降低，以往的文獻(xiàn)中多將此歸咎于腫瘤異質(zhì)性方面。不論是膠質(zhì)瘤還是其他腫瘤，復(fù)發(fā)往往會(huì)導(dǎo)致患者生存期的陡然降低。隨著EGFR受體拮抗劑投入臨床使用，為膠質(zhì)瘤靶向治療提供可能。但是在肺癌等實(shí)體腫瘤中EGFR受體拮抗劑使用常在短期內(nèi)出現(xiàn)耐藥性[6-7]。因此，尋找新的腫瘤靶向治療藥物已成為目前腫瘤研究的熱點(diǎn)。近些年來，在腫瘤的研究中，越來越多的PI3K信號通路的關(guān)鍵信號分子被發(fā)現(xiàn)與腫瘤惡性生物學(xué)行為息息相關(guān)[2-3]。PI3K信號通路即磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號傳導(dǎo)通路，又稱PI3K/AKT/mTOR信號通路，主要參與細(xì)胞的生命活動(dòng)，包括細(xì)胞增殖、活化、凋亡及調(diào)節(jié)這些功能的作用，是細(xì)胞組織生命及生長的調(diào)控中樞及網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)[8]。簡單來說，PI3K信號通路的活化是由PI3K激活開始，PI3K活化后的結(jié)果是在質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3，PIP3與細(xì)胞內(nèi)含有PH結(jié)構(gòu)域的信號蛋白AKT和PDK1結(jié)合, 促使PDK1磷酸化AKT蛋白的Ser-308位點(diǎn)，活化的AKT通過磷酸化mTOR 的Ser-448位點(diǎn)激活mTOR，被激活后的mTOR將大大提高RNA的翻譯效率，從而具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的功能，此機(jī)制在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著及其重要的作用[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組AKT及mTOR的陽性表達(dá)率均明顯高于對照組，這與王衛(wèi)峰、張浩等[10-11]研究結(jié)果相似，他們在食管癌組織中發(fā)現(xiàn)AKT明顯高于對照組，與徐余超[12]的研究結(jié)果相似，他們在研究胃癌時(shí)發(fā)現(xiàn)，低分化胃癌組AKT及mTOR陽性表達(dá)顯著高于正常組。本組研究結(jié)果表明AKT及mTOR廣泛存在于膠質(zhì)瘤中，很可能是導(dǎo)致膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素。在分析AKT及mTOR之間的相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組AKT和mTOR之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，而對照組無明顯相關(guān)關(guān)系，說明當(dāng)PI3K活化后，通過激活A(yù)KT進(jìn)一步促進(jìn)PI3K信號通路活化，AKT活化后又進(jìn)一步激活了mTOR，mTOR活化后促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制廣泛存在于膠質(zhì)瘤組織中。這與楊滿等[13]研究相似。進(jìn)一步分析AKT及mTOR與臨床病理參數(shù)的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，AKT及mTOR表達(dá)在不同患者性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位及病理分級中無顯著差異(P>0.05)，這與董君等[14]研究結(jié)果相似，與劉東剛等[15]研究部分相似，他們在研究p-AKT、p-mTOR在胃癌組織中的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)與分化程度、TNM分期有關(guān)，與年齡、腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無顯著相關(guān)。

綜上，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PI3K信號通路中的關(guān)鍵蛋白AKT及mTOR在膠質(zhì)瘤中存在過表達(dá)現(xiàn)象，由此推測PI3K信號通路的激活參與了膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，檢測AKT及mTOR具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。但AKT及mTOR陽性表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的臨床病理特征(性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位及病理分級)無顯著相關(guān)，總結(jié)文獻(xiàn)分析，猜測可能存在其他因素與之相關(guān)，如復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等，將在接下來的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證，本實(shí)驗(yàn)為研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制和進(jìn)展機(jī)制提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。