吉祥草水提物對(duì)小鼠慢性阻塞性肺疾病的作用和機(jī)制*

陳劍波，張麗娟，邱念念，匡夢(mèng)嵐，田永昌，張觀學(xué)，羅桂林，崔燕，王濤，許鍵煒

(1.沿河土家族自治縣人民醫(yī)院，貴州 沿河 565300； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 & 組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心 & 貴州省再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 成體干細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽(yáng) 550004； 4.貴州醫(yī)科大學(xué) 護(hù)理學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004； 5.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，貴州 貴陽(yáng) 550001； 6.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004； 7.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)是一種以持續(xù)存在的氣流受限、慢性支氣管炎和(或)肺氣腫為特征的慢性疾病，全球40歲以上患者的發(fā)病率已高達(dá)9%～10%，嚴(yán)重威脅人群健康，成為位居常見(jiàn)病死亡原因第四位的疾病[1-2]。COPD發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，可能與肺部對(duì)香煙煙霧等有害氣體、或有害顆粒的異常刺激導(dǎo)致的慢性炎性反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)[3]。目前針對(duì)COPD的治療采取戒煙、脫離粉塵刺激性氣體的環(huán)境、避免致敏因素以及吸氧外，藥物治療主要給予支氣管擴(kuò)張劑、糖皮質(zhì)激素、祛痰止咳的藥物緩解癥狀[4]。藥物治療對(duì)COPD雖有一定的緩解作用，但難以根治。長(zhǎng)期使用支氣管擴(kuò)張劑、糖皮質(zhì)激素等藥物，不可避免地帶來(lái)較多的不良反應(yīng)，加之COPD患者普遍為中老年，對(duì)身體的影響較大。一些中藥、民族藥在治療COPD方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。吉祥草，又名紫衣草、小葉萬(wàn)年青、觀音草等，是百合科吉祥草屬多年生常綠草本植物，主要分布在長(zhǎng)江流域以南各省及西南地區(qū)[5]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，吉祥草具有清肺止咳、化痰、抗炎、涼血止血、解毒利咽、固腎以及接骨等功效，是我國(guó)西南地區(qū)土家族、苗族等少數(shù)民族常用的傳統(tǒng)草藥之一[6]。本研究采用煙熏法建立與臨床COPD類似的動(dòng)物疾病模型，并利用吉祥草水提物治療取得一定療效并探討治療機(jī)制，為臨床COPD的治療以及民族藥吉祥草的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

昆明種小鼠由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格號(hào)為SYXK(黔)2018-0001；吉祥草飲片由貴州省銅仁市沿河土家族自治縣人民醫(yī)院中藥房提供；水浴鍋、蒸餾水、95 %乙醇，黃果樹牌過(guò)濾嘴香煙購(gòu)于煙酒專賣店，灌胃針、FlexiVent肺功能檢測(cè)儀，戊巴比妥鈉購(gòu)自Merck，乙酰甲膽堿(methacholine，Mach)和脂多糖(1ipopolysaccharides，LPS)均購(gòu)自Sigma，其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1吉祥草提取物的制備 方法參照文獻(xiàn)[7]，取吉祥草干燥全草100 g，粉碎，以15倍量蒸餾水煎煮提取3次，每次2 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮得浸膏，干燥，稱重。得浸膏21.27 g，得率為21.27 %。得率(%)=[提取物重量(g)÷原藥重量(g)]×100 %。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組 取昆明種小鼠，體質(zhì)量(20±2)g，70只，雌雄各半，適應(yīng)性飼養(yǎng)2 d后，隨機(jī)數(shù)字表法將其分為正常對(duì)照組(n=20)、模型組(n=30)和吉祥草水提物治療組(n=20)共3組。

1.2.3小鼠COPD模型的建立 參照文獻(xiàn)[8]，并加以改進(jìn)，通過(guò)過(guò)濾嘴香煙煙熏法建立COPD模型。將模型組和吉祥草水提物治療組置于體積約為0.5 m3的自制密閉容器內(nèi)，每次點(diǎn)燃2只過(guò)濾嘴香煙，小鼠全身暴露于香煙中，香煙濃度控制在140 mg/m3，香煙熄滅后，繼續(xù)保持小鼠處于密閉容器2 h，2次/d，每周5 d，持續(xù)8周。第8周建模結(jié)束，在模型組中隨機(jī)抽取5只雄鼠和5只雌鼠，取肺組織行病理HE染色進(jìn)行模型鑒定。

1.2.4處理方法 根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[9]單位體表面積用藥量折算，小鼠用藥量約為人的9.1倍，成年人用藥量約每天300 mL劑量含30 g原藥，故小鼠用量按原藥量計(jì)算約為45 mg/g。根據(jù)得率計(jì)算，吉祥草水提物治療組小鼠給予吉祥草水提物稀釋液9.45 mg/g定容成1 mL灌胃。造模8周時(shí)，予治療組小鼠吉祥草水提物稀釋液灌胃，每天1次，連續(xù)治療15 d；模型組和正常對(duì)照組予以1 mL純水灌胃，方法同治療組。

1.2.5檢測(cè)小鼠肺功能、血清炎癥相關(guān)因子表達(dá)及肺組織病理學(xué)變化 觀察各組小鼠試驗(yàn)期間的活動(dòng)、進(jìn)食及毛發(fā)等一般情況。在治療后第15 d，參照文獻(xiàn)[10]，用FlexiVent肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)小鼠肺功能：小鼠按100 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉，待其達(dá)深度麻醉自主呼吸消失后，進(jìn)行氣管插管，將插管與FlexiVent肺功能檢測(cè)儀相連；在含氧21%、呼吸頻率150次/min、潮氣量10 mL、呼吸末正壓力2 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)狀態(tài)下進(jìn)行機(jī)械通氣，待呼吸平穩(wěn)后，霧化給予乙酰甲膽堿(thacholine，Mach)行支氣管激發(fā)試驗(yàn)。Mach濃度依次為0、1.5、3、6、12、25、50和100 g/L，間隔時(shí)間為2 min，霧化時(shí)間為20 s，誘發(fā)小鼠支氣管平滑肌痙攣；同時(shí)檢測(cè)氣道阻力(airway resistance,Rrs)、氣道彈性阻力(airway elastic resistance,Ers)、動(dòng)態(tài)順應(yīng)性(dynamic compliance，Crs)、主氣道阻力(main airway resistance,P-3Rn)。麻醉狀態(tài)下取血，ELISA法檢測(cè)血清中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)以及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase 9,MMP9)的含量。以上實(shí)驗(yàn)取材完成后，取肺組織行病理HE染色，觀察肺部組織學(xué)變化。

1.2.6不良反應(yīng)觀察 治療前后全程觀察各組小鼠毒副反應(yīng)的發(fā)生情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般狀況

各組小鼠無(wú)死亡，造模組小鼠活動(dòng)、食量較造模前以及正常對(duì)照組減少，毛色晦暗。治療組小鼠在治療后活動(dòng)、食量增加，毛色光亮，一般狀態(tài)好。

2.2 肺功能指標(biāo)Rrs、Ers、Crs以及P-3Rn的變化

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠呼吸系統(tǒng)Rrs增加、Ers增加、Crs降低以及P-3Rn增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，治療組小鼠呼吸系統(tǒng)Rrs降低、Ers降低、Crs升高以及P-3Rn降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)圖1。

注：和模型組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖1 各組小鼠肺功能指標(biāo)Rrs、Ers、Crs以及P-3Rn的變化Fig.1 The effects of herba euphorbiae-derived fluid extract on Rrs, Ers, Cr, and P-3Rn

2.3 血清IL-1β、IL-6、COX-2、PGE2和MMP9水平

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中IL-1β、IL-6、COX-2、PGE2和MMP9升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，治療組小鼠血清中IL-1β、IL-6、COX-2、PGE2和MMP9表達(dá)水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、COX-2、PGE2和MMP9比較Tab.1 Comparison of serum IL-1β, IL-6, COX-2, PGE2 , and MMP9 in each group

2.4 組織學(xué)觀察

HE染色結(jié)果顯示，模型組小鼠肺泡壁破損，形成較大的空腔，支氣管管腔變形，管周小氣道平滑肌增生肥大、管壁增厚，膠原蛋白沉積增加，形成纖維化，細(xì)胞的纖毛發(fā)生粘連、倒伏、脫失，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺血管和氣道重塑明顯、管腔狹窄，氣管及支氣管黏液腺增生、腺管擴(kuò)張，小氣道腔內(nèi)分泌物多，管周肺泡壁變薄、斷裂、融合，有的形成肺大泡。治療組小鼠氣道結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯異常，可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡結(jié)構(gòu)完整、大小正常。見(jiàn)圖2。

模型組 正常對(duì)照組 治療組圖2 各組小鼠肺組織觀察(HE，×40)Fig.2 Observation of lung tissues in each group(HE，×40)

2.5 不良反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)全程各組小鼠生命體征平穩(wěn)，造模后小鼠活動(dòng)、飲食略減少，其余一般情況無(wú)特殊。治療組在給予吉祥草水提物治療后毒副作用不明顯，肝、腎等各大臟器未見(jiàn)明顯損害和腫瘤發(fā)生。

3 討論

COPD的確切病因尚不十分清楚，目前認(rèn)為是環(huán)境因素(外因)和個(gè)體易患因素(內(nèi)因)共同作用的結(jié)果。外因包括吸煙、粉塵和化學(xué)物質(zhì)的吸入、空氣污染以及呼吸道感染等，內(nèi)因包括遺傳因素、氣道反應(yīng)性增高、各種原因?qū)е路伟l(fā)育不良等[11]。一般認(rèn)為與慢性支氣管炎和阻塞性肺氣腫發(fā)生有關(guān)的因素都可能參與COPD的發(fā)病[12]。研究表明，炎癥在COPD氣道重塑中發(fā)揮著重要作用。炎癥程度隨著疾病的嚴(yán)重程度增加而增加[13]。慢性炎癥可引起氣道損傷和修復(fù)的頻繁發(fā)生，引起氣道結(jié)構(gòu)改變和氣道重塑，導(dǎo)致小氣道狹窄和肺泡壁破壞(肺氣腫)?；罨难仔约?xì)胞釋放出多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，包括本研究中檢測(cè)的IL-1β、IL-6、COX-2、PGE2和MMP9等。作為主要促炎因子的 IL-1β在炎癥刺激下由單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等分泌，是早期炎癥反應(yīng)中的重要炎癥介質(zhì)。在趨化炎癥細(xì)胞聚集、活化中扮演重要角色，在體內(nèi)與炎癥細(xì)胞因子相互作用，加劇了COPD 的炎癥反應(yīng)，從而加重肺組織與氣道結(jié)構(gòu)的病理?yè)p害[14]。IL-1β、IL-6等可促進(jìn)COX-2 活化，充斥于炎癥組織，進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞[1]或其他細(xì)胞，并使血管舒張、通透性增強(qiáng)，引起支氣管黏膜水腫，增加腺體分泌，導(dǎo)致氣道和氣流阻塞惡化。COX-2 催化花生四烯酸生成PGE2，PGE2能抑制巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)，擴(kuò)張血管，增加血管通透性，引起支氣管黏膜水腫，增加腺體分泌，使?jié)B出物堵塞氣道，從而加重氣流阻塞。吸煙可引起的氣道炎癥反應(yīng)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，激活MMP9，進(jìn)而激活TGF-β/Smads信號(hào)通路，使膠原產(chǎn)生增加、ECM過(guò)度沉積，發(fā)生肺纖維化，導(dǎo)致氣道重塑[15-16]。本研究結(jié)果顯示，上述重要的炎癥因子在煙熏法建立的COPD小鼠模型中均有所增加。結(jié)合肺臟病理HE染色發(fā)現(xiàn)，炎癥因子的表達(dá)與病理?yè)p害呈正相關(guān)。模型組和臨床COPD病人表現(xiàn)類似[17]。經(jīng)過(guò)吉祥草治療15天后，能有效降低造模小鼠血清中IL-1β、IL-6、COX-2、PGE2和MMP9的水平，減輕其氣道炎癥反應(yīng)，修復(fù)肺臟的病理?yè)p害，從而達(dá)到治療效果。

COPD 中醫(yī)認(rèn)為屬于“咳嗽”、“肺脹”等范疇，以肺、脾、腎虧虛為發(fā)病之本，以痰濁、瘀血為病理產(chǎn)物[18]；吉祥草始載于隋唐時(shí)期陳藏器《本草拾遺》，在《本草綱目》、《中藥大辭典》中均有記載[19]，其性平、味苦，具有清肺止咳、涼血止血以及解毒利咽的功效。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，吉祥草植株主要含有甾體皂苷類等化學(xué)成分，具有止咳、化痰、抗炎的作用[20]，能有效改善人體通換氣功能，抑制炎癥相關(guān)因子，促進(jìn)人體內(nèi)環(huán)境平衡。本研究采用吉祥草水提物對(duì)煙熏法建立的COPD模型小鼠進(jìn)行治療，結(jié)果顯示吉祥草水提物安全有效，能抑制炎癥因子的分泌，有效改善COPD模型小鼠癥狀，初步揭示了吉祥草治療COPD的作用機(jī)制，為臨床推廣應(yīng)用提供了理論支持。