濕地甲烷厭氧氧化機(jī)制研究進(jìn)展*

李金業(yè)，陳慶鋒?，尹志超，馮 優(yōu)，莊新軍，張慶麗

（1. 齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省分析測(cè)試中心，濟(jì)南 250014；2. 濟(jì)南大學(xué)土木建筑學(xué)院，濟(jì)南 250022；3. 許家崖水庫(kù)管理處，山東臨沂 273400）

中國(guó)一直積極參與國(guó)際氣候變化治理及全球減排進(jìn)程，在《巴黎協(xié)定》上提出我國(guó)碳減排目標(biāo)：2020年碳排放強(qiáng)度相比2005年降低40%～45%，2030年碳排放強(qiáng)度相比2005年下降60%～65%[1]。因此，我們要積極采取措施加快碳減排進(jìn)程，大力減少碳排放總量。濕地是大氣中CH4最大的天然排放源[2]。近年來(lái)，CH4濃度以每年約6×10-3cm3m-3的速度劇烈上升[3]，2018年1—10月全球平均溫度較工業(yè)化前高0.98±0.1℃，是有記錄以來(lái)第四最溫暖的年份，僅次于發(fā)生了超級(jí)厄爾尼諾的2015年、2016年和2017年，CH4濃度達(dá)到了1 859（±10）×10-3cm3m-3，是工業(yè)化前水平的257%[4]。創(chuàng)紀(jì)錄的溫室氣體濃度將全球溫度推向越來(lái)越危險(xiǎn)的水平，不僅影響到全球氣候變化，而且氣候變化的反饋?zhàn)饔脮?huì)破壞生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，從而進(jìn)一步推動(dòng)變暖。

CH4的氧化分為兩大類型（圖1）：一類是有氧條件下由微生物利用O2作為電子受體將CH4氧化；另一類是在厭氧條件下由微生物利用除O2外的其他電子受體（如等）將CH4氧化[5]。 長(zhǎng)期以來(lái)，人們一直認(rèn)為CH4的有氧氧化是CH4氧化的唯一過(guò)程。然而，直到1974年開(kāi)始，有研究者[6]在厭氧海洋沉積物中發(fā)現(xiàn)硫酸鹽還原對(duì)CH4的厭氧氧化，從而改變了一直以來(lái)對(duì)CH4僅存在好氧氧化的認(rèn)識(shí)。以往研究表明，甲烷厭氧氧化（AOM）大約消耗了海洋CH4排放通量的90%以上[7]，減少了淡水濕地CH4排放通量的50%以上[8]，從而降低了大氣中CH4的濃度水平。由于濕地受周期性淹水的影響，濕地土壤呈現(xiàn)間歇性的淹水狀態(tài)，具有好氧、厭氧界面，同時(shí)土壤中含有豐富的有機(jī)質(zhì)和各種電子受體，有機(jī)質(zhì)分解后會(huì)產(chǎn)生大量CH4，具備了發(fā)生AOM的良好條件。近年來(lái)，微生物技術(shù)與方法的發(fā)展促進(jìn)了學(xué)者們對(duì)微生物世界的探索，特別是穩(wěn)定同位素標(biāo)記法、高通量測(cè)序、變形梯度凝膠電泳（DGGE）、宏基因組學(xué)和單細(xì)胞水平研究方法（如納米二次離子質(zhì)譜與熒光原位雜交相結(jié)合的方法）[9-11]等技術(shù)的應(yīng)用，為研究者進(jìn)行環(huán)境微生物的研究提供了技術(shù)手段，掀起了國(guó)際上對(duì)AOM研究的高潮，一些標(biāo)志性成果相繼發(fā)表在國(guó)際學(xué)術(shù)刊物Science和Nature上。因此，有關(guān)濕地CH4的生物地球化學(xué)循環(huán)研究一直是國(guó)際前沿與熱點(diǎn)。

圖1 CH4氧化原理[5]Fig. 1 Methane oxidation principle[5]

1 AOM途徑的研究進(jìn)展

目前，根據(jù)電子受體的不同，AOM 途徑主要為硫酸鹽還原型甲烷厭氧氧化（SAMO），反硝化型甲烷厭氧氧化（DAMO），以Fe3+、Mn4+作為電子受體的甲烷厭氧氧化（Metal-AOM）以及種間直接電子轉(zhuǎn)移（DIET）。

1.1 硫酸鹽還原型甲烷厭氧氧化（SAMO）

SAMO過(guò)程的微生物包含甲烷厭氧氧化古菌（ANME）和硫酸鹽還原細(xì)菌（SRB）。這兩類微生物在空間上緊密耦合聯(lián)系[12]，通常以聚集體的形式存在[13]。研究者們基于16S rRNA和改良胞嘧啶限制蛋白A（mcrA）基因多態(tài)性，將ANME劃分為3類：ANME-1、ANME-2、ANME-3，均屬于廣古菌門(mén)，它們的親緣關(guān)系如圖2a）[14]：ANME-1與產(chǎn)甲烷微菌目（Methanomicrobiale）有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系；ANME-2屬于產(chǎn)甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales），包含4個(gè)亞簇：ANME-2a、ANME-2b、ANME-2c、ANME-2d（又叫AAA）；而ANME-3與甲烷擬球菌屬（Methanococcoides）親緣關(guān)系較近。這3類ANME的序列相似度僅有75%～92%，但生理特性相似，表明不同的ANME群落偏好不同的生態(tài)環(huán)境。ANMEmcrA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，ANME-1—3的親緣關(guān)系十分疏遠(yuǎn)（圖2b）），與16S rRNA結(jié)果相符合。

圖2 ANME系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[14]Fig. 2 Phylogenetic trees of ANME[14]

SRB種類豐富，在SAMO過(guò)程中主要包括脫硫八疊球菌屬（Desulfosarcina）、脫硫球菌屬（Desulfococcus）和脫硫葉菌屬（Desulfobuibus）。脫硫八疊球菌屬（Desulfosarcina：DSS）和脫硫球菌屬（Desulfococcus）主要吸附在ANME-1、ANME-2上，形成細(xì)胞絮凝體[15-16]；脫硫葉菌屬一般與ANME-3共存發(fā)生作用（圖3a））。ANME-2與SRB組成互養(yǎng)共生體，其內(nèi)部核心由ANME-2充當(dāng)，而其外部被SRB構(gòu)成的殼層部分或全部包圍（圖3b），圖3c））[17]。隨著進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，SRB與ANME的共存形式呈現(xiàn)多樣化，如在Eel河流域沉積物中發(fā)現(xiàn)了脫硫葉菌屬與ANME-2c共存現(xiàn)象，以及脫硫八疊球菌屬和脫硫球菌屬與ANME-2c共存的現(xiàn)象[18]；更多的證據(jù)表明與ANME共生的細(xì)菌可能不僅限于SRB，而是具有較高的多樣性[19]，如僅由ANME-2細(xì)胞形成的單一類型微生物的共生體（圖3d））[20-21]；在某些環(huán)境發(fā)現(xiàn)α-變形菌綱的Spbingomonasspp.和β-變形菌綱的Burkbolderiaspp.也會(huì)與ANME-2c關(guān)聯(lián)生長(zhǎng)[18]。

圖3 通過(guò)熒光原位雜交（FISH）顯示的不同類型甲烷厭氧氧化（AOM）古菌團(tuán)聚體的熒光顯微照片（a）ANME-3（紅色）與脫硫葉菌（綠色）團(tuán)聚體；b）滲漏沉積物中觀察到ANME-2a（紅色）和脫硫八疊球菌屬（DSS）（綠色）細(xì)胞的混合型聚生體；c）滲漏沉積物中的ANME-2c（紅色）和DSS（綠色）細(xì)胞的殼型聚生體；d）滲漏沉積物中單個(gè)ANME-2c細(xì)胞[14] .）Fig. 3 Epifluorescence micrographs of different species of anaerobic methanotrophic archaea（ANME）aggregates visualized by fluorescence in situ hybridization（FISH）（a）ANME-3（red）and Desulfobulbus（green）consortia；b）Mixed-type consortia of ANME-2a（red）and Desulfosarcina（DSS）（green）cellso bserved in sediments；c）Shell-type consortia of ANME-2c（red）and DSS（green）cells in sediments；d）single ANME-2c cells observed in sediments[14].）

當(dāng)前，SAMO理論反應(yīng)機(jī)理主要有四種（表1）：反向產(chǎn)甲烷理論、乙酸生成理論、甲基化理論和以S0作為中間產(chǎn)物（圖4）的SAMO機(jī)理[28-39]。其中，反向產(chǎn)甲烷理論模型研究得最深入[28-34]。

表1 硫酸鹽還原型甲烷厭氧氧化四種理論模型Table 1 Introduction of four theoretical models of sulfate reducing anaerobic oxidation of methane（SAMO）

圖4 以S0作為中間產(chǎn)物的甲烷厭氧氧化 [28]Fig. 4 Anaerobic oxidation of methane with S0 as the intermediate product28]

乙酸生成理論是對(duì)反向產(chǎn)甲烷理論的補(bǔ)充與發(fā)展，它解釋了H2在 AOM 過(guò)程中并非起中間體作用，H2濃度與AOM作用之間的影響關(guān)系。以S單質(zhì)作為中間產(chǎn)物的SAMO機(jī)制被認(rèn)作是一個(gè)全新的途徑[30]，該過(guò)程由ANME的一個(gè)分支（ANME-2）在無(wú)SRB參與下，以S0為中間載體完成了AOM過(guò)程中的硫酸鹽還原，從一個(gè)全新的角度定義ANME和SRB的功能，開(kāi)拓了一個(gè)新的研究方向。

1.2 反硝化型甲烷厭氧氧化（DAMO）

參與DAMO途徑的微生物是一類新的微生物Candidatus Methylomirabilis oxyfera（M. oxyfera）[17]，隸屬于新發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌門(mén)—NC10 門(mén)，且所有與反硝化過(guò)程耦合的AOM富集培養(yǎng)中均含有一定量（30%～80%）的NC10門(mén)細(xì)菌；其他少數(shù)古菌為ANME（屬于甲烷八疊球菌目）的AAA分支的細(xì)菌。NC10門(mén)細(xì)菌細(xì)胞呈細(xì)桿狀、桿狀，以單細(xì)胞或團(tuán)聚體的形式存在。根據(jù)NC10門(mén)設(shè)計(jì)的特異引物，將基因庫(kù)中的序列比對(duì)之后發(fā)現(xiàn)，NC10門(mén)細(xì)菌包括a、b、c及d四個(gè)類群。然而，目前所富集的細(xì)菌均歸屬于a類群，說(shuō)明a類群是參與DAMO的主要功能群，而NC10門(mén)中其他種類的細(xì)菌是否具有甲烷厭氧氧化的能力尚未確定。

目前針對(duì)DAMO機(jī)理的研究分為NC10門(mén)細(xì)菌單獨(dú)催化 DAMO 的催化機(jī)理和古菌協(xié)同催化機(jī)理兩個(gè)研究方向（圖5）[31]。

（1）NC10門(mén)細(xì)菌催化DAMO機(jī)理 2006年，Raghoebarsing等[32]通過(guò)全基因測(cè)序推測(cè)出DAMO的機(jī)理：基于M. oxyfera本身缺少編碼NO還原酶的基因卻能夠自己生成O2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)它的細(xì)胞內(nèi)存在某種能夠歧化NO生成O2的未知酶，將產(chǎn)生的一部分（3/4）O2用于CH4的氧化反應(yīng)；2011年Wu等[33]提出了M. oxyfera細(xì)菌的分解代謝和能量代謝途徑：在亞硝酸還原酶的作用下，NO2-還原生成的 NO經(jīng)過(guò)NO歧化酶分解成N2和O2，產(chǎn)生的O2用于CH4氧化，依次在甲烷單加氧酶（MMO）、甲醇脫氫酶（MDH）、甲醛脫氫酶（FADH）和甲酸脫氫酶（FDH）的作用下最終被氧化成 CO2和 H2O；2012年Wu等[34]通過(guò)免疫學(xué)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)M. oxyfera細(xì)菌中存在CH4氧化的關(guān)鍵酶（甲烷單加氧酶）（pMMO）和反硝化過(guò)程的關(guān)鍵酶NO2-還原酶（NirS），驗(yàn)證了Raghoebarsing[32]提出的NC10門(mén)細(xì)菌獨(dú)自完成甲烷厭氧氧化耦合亞硝酸鹽還原過(guò)程。

（2）古菌參與DAMO的催化機(jī)理 目前，對(duì)于古菌參與DAMO途徑的研究較少。在Raghoebarsing[32]、Hu等[35]的文章中提到DAMO 的富集培養(yǎng)物中存在著古菌和細(xì)菌的混合物，且均具有消耗NO3-或NO2-的能力，他們推測(cè)古菌催化NO3-的能力要強(qiáng)于NC10門(mén)細(xì)菌，而NC10細(xì)菌對(duì)NO2-的競(jìng)爭(zhēng)能力則強(qiáng)于古菌，古菌將NO3-轉(zhuǎn)化為NO2-，為后續(xù)的AOM提供反應(yīng)物，即NO3-是古菌的電子受體，NO2-為細(xì)菌的電子受體。后來(lái)Haroon等[31]證實(shí)古菌ANME-2d能夠利用NO3-作為最終電子受體獨(dú)自實(shí)現(xiàn)整個(gè)AOM過(guò)程。

圖5 型AOM途徑[31]Fig. 5 Anaerobic oxidation of methane（AOM）coupled with/ reduction[31]

DAMO的研究進(jìn)展如表2所示，這是一種近年新發(fā)現(xiàn)的AOM途徑，在微生物學(xué)、生態(tài)學(xué)和環(huán)境工程領(lǐng)域有很大的研究?jī)r(jià)值和前景，發(fā)現(xiàn)至今受到眾多學(xué)者的關(guān)注。研究者致力于分析 DAMO 功能微生物、功能微生物的內(nèi)在機(jī)理及其富集的影響因素和DAMO的實(shí)際應(yīng)用。因DAMO 中主要功能微生物M. oxyfera富集培養(yǎng)緩慢，時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)周甚至數(shù)月，反硝化速率較低，目前工藝研究較少，主要應(yīng)用DAMO脫氮工藝[36]：利用DAMO功能菌與Anammox功能菌共同作用進(jìn)行脫氮，CH4作為反硝化過(guò)程中的電子供體，將還原成，而M. oxyfera細(xì)菌則與Anammox細(xì)菌共同作用，利用CH4和作為電子供體，將還原，這對(duì)解決濕地土壤中長(zhǎng)期使用氮肥造成的硝/銨態(tài)氮污染和緩解溫室效應(yīng)具有重大作用。針對(duì)富集培養(yǎng)問(wèn)題，研究者們研究了中空纖維膜反應(yīng)器（HfMBR）[37]、痕量金屬濃度的變化和電場(chǎng)刺激對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的影響[38]等方面，提高了功能細(xì)菌的增長(zhǎng)并促進(jìn)其活性，一定程度上提高了反硝化速率。

表2 反硝化型甲烷厭氧氧化的相關(guān)研究進(jìn)展Table 2 Progresses of researches on denitrifying anaerobic oxidation of methane

1.3 以金屬離子為電子受體的AOM（Metal-AOM）

Metal-AOM反應(yīng)涉及固、液、氣相，反應(yīng)速率低且機(jī)理復(fù)雜。早期研究中，Beal等[49]懷疑ANME-1、ANME-3或擬甲烷球菌可能與甲烷氧化有關(guān)，金屬還原細(xì)菌（如某些種類的擬桿菌、脫硫單胞菌、酸桿菌）可能作為它們的伙伴，對(duì)金屬還原起著至關(guān)重要的作用。根據(jù)對(duì)臺(tái)灣東部陸地泥火山中AOM和微生物群落的環(huán)境調(diào)查，研究人員認(rèn)為ANME-1～ANME-3和脫硫單胞菌屬可能與Metal-AOM有關(guān)[50]。在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)微生物研究Metal-AOM菌群的報(bào)道中提到屬于ANME的ANME-2亞類 ANME-2a、ANME-2c、ANME-2d（AAA）均可參與Metal-AOM。2016年，Scheller等[51]、Fu等[52]及Ettwig等[53]的三項(xiàng)獨(dú)立研究表明，一些菌株的ANME-2無(wú)論是否有細(xì)菌伴侶，均能夠結(jié)合CH4進(jìn)行金屬還原，且ANME-2d能夠在不同的環(huán)境條件下利用不同的氧化劑作為電子受體。

目前主要的機(jī)理有三種：第一種通過(guò)幾種微生物（ANME-2a、ANME-2c、ANME-2d），負(fù)責(zé)Metal-AOM的整個(gè)過(guò)程，ANME氧化CH4是將電子直接轉(zhuǎn)移至可溶性金屬離子、復(fù)合物或者固體金屬氧化物（圖6a））。第二種氧化機(jī)理與SAMO一樣，ANME與金屬還原微生物（MRM）合作進(jìn)行金屬的厭氧氧化，相關(guān)的MRM接受來(lái)自ANME的電子以分解金屬氧化物（圖6b））。值得注意的是，在SAMO機(jī)理中發(fā)生的“隱硫循環(huán)”（在硫化物存在條件下形成S0，通過(guò)S0的歧化反應(yīng)生成和S2-）可能與上述Metal-AOM模式共存（圖6c））。最后一種通過(guò)反向產(chǎn)甲烷途徑提供過(guò)量的H2，與Fe3+發(fā)生氧化作用耦合進(jìn)行Fe的還原。Metal-AOM現(xiàn)在已經(jīng)被認(rèn)為是一些淡水生態(tài)系統(tǒng)的甲烷庫(kù)，它發(fā)生的假定層位略低于有氧/缺氧界面，無(wú)氧、硝酸鹽/亞硝酸鹽和硫酸鹽，僅有鐵和錳氧化物。根據(jù)Metal-AOM的化學(xué)計(jì)量學(xué)，其氧化產(chǎn)物Fe（II）/Mn（II）和CO2也可能參與其他金屬、硫和磷以及礦物形成的地質(zhì)過(guò)程，這就解釋了鐵錳氧化物的原位濃度不足卻可以進(jìn)行甲烷氧化的問(wèn)題。例如在出現(xiàn)MRM的條件下，F(xiàn)e（II）可以與磷酸鹽、硫化物、碳酸鹽和殘余Fe（III）反應(yīng)生成藍(lán)鐵礦、黃鐵礦、菱鐵礦和磁鐵礦等礦物，明顯影響著地球地質(zhì)組成，Metal-AOM的相關(guān)研究進(jìn)展見(jiàn)3。

圖6 不同機(jī)制下微生物介導(dǎo)的金屬甲烷厭氧氧化[54]Fig. 6 Different mechanismsonmicrobe-mediated metal anaerobic oxidationof methane[54]

1.4 種間直接電子轉(zhuǎn)移（DIET）

種間直接電子轉(zhuǎn)移（DIET）是在Milucka等[65]和Nauhaus等[12]研究基礎(chǔ)上推斷出的一種新的AOM途徑。他們通過(guò)對(duì)海洋中的ANME菌和SRB菌還原硫酸鹽的實(shí)驗(yàn)猜測(cè)ANME與SRB之間的電子轉(zhuǎn)移體系不需要通過(guò)常規(guī)的中間產(chǎn)物（間氫、醋酸或者甲酸等）作為電子轉(zhuǎn)移載體，而是一種更直接的方式——DIET。DIET 的前身是胞外電子轉(zhuǎn)移機(jī)制（DEET）[66]，最早發(fā)現(xiàn)于地桿菌的共培養(yǎng)中；隨后，Summers等[67]又在金屬還原性土壤桿菌和硫還原性土壤桿菌共培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)兩種菌體形成了一種導(dǎo)電的聚集體，聚集體DNA測(cè)序結(jié)果表明，在缺乏種間氫轉(zhuǎn)移的突變體中，團(tuán)聚體的形成較快，證明種間電子轉(zhuǎn)移是直接的；此外，產(chǎn)甲烷過(guò)程中也發(fā)生DIET（圖7）[68]。隨著近年來(lái)穩(wěn)定同位素示蹤、宏基因組、理論模型等先進(jìn)技術(shù)的發(fā)展和AOM上的應(yīng)用，2015年Wegener 等[69]用ANME-1古細(xì)菌和SRB（HotSeep-1）在60℃下測(cè)試直接種間電子交換的假設(shè)，觀察到在嗜熱AOM（TAOM）條件下，古菌和細(xì)菌均過(guò)度表達(dá)細(xì)胞色素生成的基因，并形成類似于種間電子連接的納米線結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)負(fù)責(zé)共生菌群之間的種間電子轉(zhuǎn)移；McGlynn等[70]通過(guò)單細(xì)胞色素的檢測(cè)以及聚集體細(xì)胞之間基質(zhì)的氧化還原依賴性染色實(shí)驗(yàn)，為直接電子轉(zhuǎn)移的共同耦合提供了證據(jù)；Scheller等[51]使用速率測(cè)量和單細(xì)胞穩(wěn)定同位素探測(cè)相結(jié)合的方法證明SAMO過(guò)程無(wú)硫酸鹽時(shí)，AOM反應(yīng)速率并未衰減，正是通過(guò)DIET這種方式進(jìn)行電子交換。

表3 金屬-甲烷厭氧氧化研究Table 3 Studies on metal anaerobic oxidation of methane

圖7 種間直接電子轉(zhuǎn)移機(jī)制下甲烷厭氧氧化（AOM）電子轉(zhuǎn)移方式[68]Fig. 7 Electron transfer in anaerobic oxidation of methane controlled by direct interspecies electron transfer（DIET）[68]

2 AOM的現(xiàn)代檢測(cè)方法

傳統(tǒng)的微生物多樣性研究方法是將微生物從環(huán)境中分離，然后在實(shí)驗(yàn)室對(duì)其進(jìn)行分離培養(yǎng)得到微生物的單菌株。由于微生物種類繁多，實(shí)驗(yàn)室富集培養(yǎng)微生物的僅有極少數(shù)，造成了研究上的困難。而現(xiàn)代微生物多樣性研究是基于Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)，利用雙末端測(cè)序的方法，構(gòu)建小片段文庫(kù)在編碼核糖體RNA的核酸序列保守區(qū)進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)對(duì)序列拼接過(guò)濾，操作分類單元（Operational taxonomic units，OTU）聚類，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，揭示樣品的物種構(gòu)成；進(jìn)一步進(jìn)行α多樣性分析、β多樣性分析和顯著物種差異分析等，挖掘樣品之間的差異。

2.1 現(xiàn)代檢測(cè)方法分類及優(yōu)點(diǎn)

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)能夠揭示DNA序列遺傳多態(tài)性，用于推斷系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)比較鑒定未知微生物，其中基于16S rRNA的分子生物學(xué)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用（表4），例如變性梯度凝膠電泳（DGGE）、溫度梯度凝膠電泳（TGGE）、末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（T-RFLP）等可依據(jù)獨(dú)特核酸物質(zhì)的分離，提供微生物多樣性的輪廓；宏基因組學(xué)由Handelsman等[71]1998年提出，對(duì)生境中所有微生物的總基因組DNA進(jìn)行研究，可避開(kāi)傳統(tǒng)可培養(yǎng)方法的局限性，提高新微生物的發(fā)現(xiàn)效率，結(jié)合宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)及新一代質(zhì)譜技術(shù)催生下的宏蛋白質(zhì)組學(xué)，可系統(tǒng)研究微生物群落及其功能，全面分析其組成、發(fā)展規(guī)律、進(jìn)化和功能預(yù)測(cè)，認(rèn)識(shí)微生物群落中物種多樣性、基因潛力以及基因表達(dá)與調(diào)控，已廣泛應(yīng)用于海洋湖泊、深海熱泉、人體腸道、牛瘤胃生境、森林土壤與堆肥生境等環(huán)境中微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能研究。

2.2 現(xiàn)代檢測(cè)方法的局限性

分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步促進(jìn)了環(huán)境微生物的研究，但不同方法有其局限性，如PCR擴(kuò)增以優(yōu)勢(shì)種群為主，不利于檢測(cè)豐度較低的稀有微生物種群；高通量測(cè)序得到的序列難以組成完整的基因，且很多基因的功能尚不清楚，很難獲得由序列到功能的準(zhǔn)確圖譜；DGGE中受影響的條帶可能含有多個(gè)物種，檢測(cè)結(jié)果需要結(jié)合克隆庫(kù)來(lái)驗(yàn)證；454測(cè)序中對(duì)一條序列的同一個(gè)堿基的重復(fù)測(cè)量準(zhǔn)確度低；Illumina測(cè)序在測(cè)定GC含量（鳥(niǎo)嘌呤和胞嘧啶的比率）高的序列區(qū)域時(shí)容易產(chǎn)生偏差；FISH樣品的熒光會(huì)影響探針的熒光信號(hào)，導(dǎo)致微生物細(xì)胞的同位素組成受到樣品制備過(guò)程的干擾。

表4 幾種分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用情況Table 4 Application of several molecular biological methods

3 展 望

本文綜述了四種不同電子受體的濕地AOM途徑以及參與反應(yīng)的微生物菌群，探討了環(huán)境因子對(duì)濕地AOM的影響機(jī)制，列舉了幾種研究微生物群落結(jié)構(gòu)特征、數(shù)量分布特征、活性和相對(duì)作用強(qiáng)度的分子生物學(xué)技術(shù)，為從原理上探明AOM途徑的發(fā)生機(jī)理和微生物在功能、生態(tài)和進(jìn)化上的關(guān)系提供更多的科學(xué)依據(jù)，在濕地溫室氣體排放領(lǐng)域取得新突破。關(guān)于濕地AOM途徑的未來(lái)研究方向可從以下幾個(gè)方面進(jìn)行。

首先，微生物的富集和純培養(yǎng)是深入研究AOM的基礎(chǔ)，但由于功能微生物的培養(yǎng)過(guò)程非常緩慢，目前針對(duì)AOM各過(guò)程機(jī)理的研究多數(shù)仍停留在理論階段，多種理論間互有沖突，未有充足的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支撐，其中對(duì)于Metal-AOM途徑以及DIET途徑的研究更是處于起步階段。今后的研究需要進(jìn)一步探索各途徑微生物菌群富集培養(yǎng)的適宜條件，減少各過(guò)程之間的相互影響，提高反應(yīng)穩(wěn)定性。

其次，由于河口濕地受到淡水與海水入侵的雙重作用，以及人類活動(dòng)對(duì)濕地碳源輸入的影響，濕地AOM過(guò)程的環(huán)境影響因子（溫度、鹽度、植被類型、pH等）和電子受體（NO3-、NO2-、Fe3+等）隨之多變，主導(dǎo)AOM途徑的微生物群落也會(huì)產(chǎn)生較大的不確定性。今后可以研究人類活動(dòng)、環(huán)境因子和電子受體三者之間的聯(lián)系，進(jìn)一步揭示它們的耦合關(guān)系對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，加強(qiáng)對(duì)濱海濕地CH4排放的管理。

最后，AOM途徑應(yīng)用于實(shí)際環(huán)境工程。例如可利用DAMO處理目前亟待解決的含氮廢水，將CH4作為替代碳源用于傳統(tǒng)的反硝化工藝，并研發(fā)新型的脫氮除碳工藝，具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境生態(tài)效益，可進(jìn)一步研發(fā)具體的工藝流程。