環(huán)境因素對(duì)人類疾病調(diào)控作用機(jī)制研究

謝明仁, 盧建珍, 王賢賢, 謝劉陽(yáng), YU Xin, 俞發(fā)榮,*

環(huán)境因素對(duì)人類疾病調(diào)控作用機(jī)制研究

謝明仁1, 盧建珍1, 王賢賢1, 謝劉陽(yáng)1, YU Xin2, 俞發(fā)榮1,*

1. 甘肅政法大學(xué) 公安技術(shù)學(xué)院, 蘭州 730070 2. Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030, US

為了探索環(huán)境因素對(duì)人類疾病調(diào)控作用機(jī)制, 研究植物提取物二十碳烯酸對(duì)人食管癌細(xì)胞(EC56細(xì)胞)PI3K-Akt信號(hào)通路調(diào)控基因表達(dá)水平的影響, 分別給予EC56細(xì)胞 0.2,0.8,1.6 mg·L-1二十碳烯酸和5-FU培養(yǎng)48 h。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)EC56細(xì)胞凋亡率; 用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測(cè)EC56細(xì)胞中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、酪氨酸激酶受體B(TrkB)、粘著斑激酶(FAK)、蛋白激酶(Akt)表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 給予EC56細(xì)胞二十碳烯酸和5-FU培養(yǎng)48 h, 細(xì)胞凋亡率為15.46%, 21.52%, 23.13%和18.34, 與對(duì)照組比較, 細(xì)胞凋亡率有顯著性差異(<0.01); BDNF、TrkB水平比對(duì)照組分別降低了22.76%, 43.90%, 56.91%, 40.65%和22.59%, 43.49%, 67.76%, 49.28%(<0.01); FAK和Akt水平比對(duì)照組分別降低了14.34%, 36.49%, 50.7%, 49.7% 和15.11%, 24.99%, 32.71%, 20.84%。結(jié)果提示, 植物提取物二十碳烯酸對(duì)EC56細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用,其作用機(jī)制與PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)道通路中調(diào)控基因TrkB、BDNF、FAK和Akt表達(dá)水平下調(diào)和抑制EC56細(xì)胞分裂周期有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為充分利用自然環(huán)境資源, 協(xié)調(diào)生態(tài)環(huán)境平衡, 提高人類身心健康研究提供了參考依據(jù)。

二十碳烯酸; 人食管癌細(xì)胞; 細(xì)胞分裂周期; 凋亡; PI3K-Akt信號(hào)通路

0 前言

人類生活在自然生態(tài)環(huán)境中, 人類的健康無(wú)時(shí)無(wú)刻不受自然環(huán)境因素的影響。當(dāng)人類的活動(dòng)影響或使生態(tài)環(huán)境平衡遭到破壞, 就直接或間接威脅人類健康, 誘發(fā)疾病生成。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)及其受體酪氨酸激酶受體B(TrkB) 在多種人體腫瘤中均有異常表達(dá)[1],在腫瘤發(fā)生、發(fā)展[2]和轉(zhuǎn)移[3]過程中具有重要功能。TrkB介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),因此,阻斷或者抑制TrkB活性, 可破壞腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳遞,從而達(dá)到抗腫瘤的目的[4]。以磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和其下游分子蛋白激酶(Akt)所組成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵分子為靶點(diǎn)的腫瘤治療研究發(fā)現(xiàn), PI3K-Akt信號(hào)通路與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。該通路調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活,其活性異常不僅能導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化,在組織血管生成和細(xì)胞生長(zhǎng),增殖,新陳代謝, 遷移, 分化和凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用[5]。PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受BDNF、TrkB、局部粘著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)基因的調(diào)控。當(dāng)BDNF、TrkB、FAK表達(dá)上調(diào)時(shí), PI3K-Akt被激活[6], 促進(jìn)細(xì)胞增殖[7]、遷移[8], 抑制細(xì)胞凋亡[9]。根據(jù)BDNF, TrkB, FAK在PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中調(diào)節(jié)特點(diǎn), 在前期研究[10]的基礎(chǔ)上, 將二十碳烯酸給予人食管癌細(xì)胞(EC56), 研究分析對(duì)PI3K- Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)調(diào)控基因的作用, 為進(jìn)一步研究環(huán)境因素對(duì)人類疾病調(diào)控作用及其機(jī)制積累資料。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

二十碳烯酸, 蘭州大學(xué)化工學(xué)院天然植物研究所提供, 由中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所進(jìn)行質(zhì)量鑒定; 5-氟尿嘧啶( 5-FU), 批號(hào)20190306, 規(guī)格: 每支 5 mL, 南通精華制藥有限公司生產(chǎn); 二甲基亞砜(DMSO), 蘇州聯(lián)雄化工科技公司生產(chǎn); 胎牛血清, 鄭州九龍生物制品有限公司提供。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)試劑盒、酪氨酸激酶受體B(TrkB)試劑盒, 局部粘著斑激酶(FAK)試劑盒, 蛋白激酶(Akt)試劑盒, 購(gòu)于北京索寶生物科技有限公司。

1.2 儀器

MULTISKAN MK3酶標(biāo)儀, 上海雷勃分析儀器有限公司; 流式細(xì)胞儀, Coulter EPICS XL型, USA; ZHJH-C1112B型雙人單面百級(jí)超凈工作臺(tái), 上海智城分析儀器制造有限公司; 3552-2型全自動(dòng)高溫滅菌CO2培養(yǎng)箱, SHELDON MFG INC.; Olympus數(shù)碼顯微鏡, 奧林巴斯(中國(guó))投資有限公司; 100X-640X倒置顯微鏡, 北京佳源興業(yè)科技有限公司; 96孔板, USA.

1.3 人食管癌細(xì)胞(EC56)

甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院藥理毒理實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 人食管癌細(xì)胞(EC56)培養(yǎng)

將EC56細(xì)胞加入含RPMI1640培養(yǎng)液、10%的胎牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺、1×105U·L-1青霉素、1×105U·L-1鏈霉素的培養(yǎng)瓶中, 放入CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

2.2 分組和給藥

取EC56細(xì)胞(細(xì)胞密度為2×106個(gè)·L–1)接種于96孔培養(yǎng)板, 每孔90 μL。給藥組分為低劑量組(L): 每孔加入0.2 mg·L–1二十碳烯酸 10 μL; 中劑量組(M): 每孔加入0.8 mg·L–1二十碳烯酸 10 μL; 高劑量組(H): 每孔加入1.6 mg·L–1二十碳烯酸 10 μL; 5-FU組: 每孔加5-FU(10 mg·L–1)10 μL; 對(duì)照組: 每孔加DMSO(30 μL·L–1)10 μL。各設(shè)4個(gè)重復(fù)孔。5%CO2, 37℃, 飽和濕度條件中培養(yǎng)48 h, 用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各組細(xì)胞吸光度(OD), ELISA法測(cè)BDNF、TrkB、FAK、Akt表達(dá)水平。

2.3 二十碳烯酸對(duì)EC56細(xì)胞分裂周期影響

取EC56細(xì)胞2 mL, 加入含RPMI1640液6 mL的培養(yǎng)瓶,給藥組分別加入二十碳烯酸 0.2,0.8, 1.6·L-1和5-Fu各0.8 mL; 對(duì)照組加DMSO(30 μL·L-1)0.8 mL, 培養(yǎng)48 h, 離心收集細(xì)胞, 用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分裂期細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞凋亡率。

2.4 直線回歸方程制作

取BDNF, TrkB, FAK, Akt試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品50 uL分別加入酶標(biāo)板, 用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值), 以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo), 對(duì)應(yīng)的吸光度(OD值)為縱坐標(biāo)計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料用百分率(%)表示, 組間比較用單因素方差分析, 以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 二十碳烯酸對(duì)EC56細(xì)胞分裂周期的影響

L、M、H濃度二十碳烯酸組和5-FU組EC56細(xì)胞用流式細(xì)胞儀測(cè)得凋亡率分別為15.46%, 21.52%, 23.13%和18.34%, 二十碳烯酸組和5-FU組細(xì)胞的凋亡率比對(duì)照組顯著升高(<0.01); H組比5-FU組細(xì)胞凋亡率顯著升高(<0.01), 見表1。

Tabel 1 The effect of eicosenoic acidon EC56 cells division cycle

表1 二十碳烯酸對(duì)EC56細(xì)胞分裂周期的影響

與對(duì)照組比:**<0.01; 與5-FU組比:▼<0.05,▼▼<0.01。

3.2 二十碳烯酸對(duì)EC56細(xì)胞BDNF表達(dá)水平的影響

BDNF標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程為:=1.1× 10-3+1.15×10-2,2=0.9997。L、M、H組和5-FU組的BDNF水平分別為215.91±1.33, 156.82±1.24, 120.45±1.04和165.91±2.03, 比對(duì)照組BDNF水平(279.55±2.07)分別降低了22.76%, 43.90%, 56.91%和40.65% (<0.01)。見圖1。

3.3 二十碳烯酸對(duì)EC56細(xì)胞TrkB表達(dá)水平的影響

TrkB標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程為:=1.1× 10-3+1.33×10-2,2=0.9998。L、M、H組和5-FU組的TrkB水平分別為171.36±2.12, 125.91±1.97, 71.36±1.53和112.27±2.81, 比對(duì)照組TrkB水平(221.36±1.65)分別降低了22.59%, 43.49%, 67.76%和49.28%(<0.01)。見圖2。

3.4 二十碳烯酸對(duì)EC56細(xì)胞FAK表達(dá)水平的影響

FAK標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程為:=1.5× 10-2+1.1×10-2,2=0.9994。L、M、H組和5-FU的FAK水平分別為72.06±0.41, 53.42±0.19, 41.47±0.18和42.31±0.33, 比對(duì)照組FAK水平(84.12±0.22)分別降低了14.34%, 36.49%, 50.70%和49.70%。見圖3。

3.5 二十碳烯酸對(duì)EC56細(xì)胞Akt表達(dá)水平的影響

Akt標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程為:=1.19×10-2+ 2.32×10-2,2=0.9996。L、M、H組和5-FU組的Akt水平分別為52.14±0.32, 46.07±0.45, 41.33± 0.53和48.62±0.22, 比對(duì)照組Akt水平(61.42±0.36)分別降低了15.11%, 24.99%, 32.71%和20.84%。見圖4。

圖1 二十碳烯酸對(duì)EC56細(xì)胞BDNF表達(dá)水平的影響(與C比: **P<0.01)

Figure 1 Effect ofeicosenoic acid on BDNF expression level in EC56 cells(**<0.01C group)

圖2 二十碳烯酸對(duì)EC56細(xì)胞TrkB表達(dá)水平的影響(與C比: **P<0.01)

Figure 2 Effect ofeicosenoic acid on TrkB expression level in EC56 cells(**<0.01C group)

圖3 二十碳烯酸對(duì)EC56細(xì)胞FAK表達(dá)水平的影響(與C比: *P<0.05, **P<0.01)

Figure 3 Effect ofeicosenoic acid on FAK expression in EC56 cells(*<0.05,**<0.01C group)

圖4 二十碳烯酸對(duì)EC56細(xì)胞Akt表達(dá)水平的影響(與對(duì)照組比: *P<0.05, **P<0.01)

Figure 4 Effect of eicosenoic acid on Akt expression in EC56 cells(*<0.05,**<0.01C group)

4 討論

研究報(bào)道, 酪氨酸激酶受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān), 酪氨酸激酶受體可促進(jìn)多種腫瘤[11]的生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移。因此, 抑制酪氨酸激酶受體活性, 可阻斷腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳遞, 抑制腫瘤形成, 從而達(dá)到抗腫瘤的目的[4]。提示酪氨酸激酶受體可能成為抗腫瘤治療的潛在靶點(diǎn),酪氨酸激酶受體抑制劑的應(yīng)用可能成為抗腫瘤治療的新策略[12]。李坤等[13]研究發(fā)現(xiàn), 給予神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)細(xì)胞全反式維甲酸(ATRA)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF), 誘導(dǎo)酪氨酸激酶受體B(TrkB)高表達(dá), TrkB進(jìn)一步激活其下游PI3K /Akt通路, 促進(jìn)NB細(xì)胞合成、分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF); 若給予酪氨酸蛋白激酶抑制劑(K252a)阻斷TrkB-BDNF信號(hào)通路或給予PI3K 抑制劑(LY294002)阻斷TrkB-BDNF信號(hào)下游通路PI3K/Akt均可有效抑制NB細(xì)胞合成分泌VEGF[14]。粘著斑激酶(FAK) 是細(xì)胞內(nèi)一種非受體酪氨酸激酶, 在多種腫瘤細(xì)胞中均出現(xiàn)異常表達(dá)量[15], 在細(xì)胞存活[16]、粘附、遷移多種細(xì)胞信號(hào)通路中起著關(guān)鍵作用[17]。當(dāng)FAK被激活時(shí), 腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲活性增加, 抑制細(xì)胞凋亡[9]。給予FAK抑制劑, 發(fā)現(xiàn)FAK表達(dá)或活性阻斷使細(xì)胞增殖受到顯著抑制, 這種抑制主要體現(xiàn)在G2/M期細(xì)胞比率的增加及S期細(xì)胞比率的下降[18]。上述研究成果表明, TrkB、BDNF、FAK水平調(diào)節(jié)控制著PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)道通路的活性。羅紅[19]將二十碳五烯酸單獨(dú)或聯(lián)合視黃酸給予HL-60細(xì)胞, 細(xì)胞增殖抑制率為 24.38%或42.75 %, 可見二十碳五烯酸可抑制 HL- 60細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其分化, 與視黃酸聯(lián)合應(yīng)用效果更為明顯, 這種聯(lián)合效應(yīng)可能與二十碳五烯酸減緩 HL-60細(xì)胞內(nèi)視黃酸的代謝相關(guān)。沈桂芬[20]將由細(xì)胞色素P450表氧化酶從花生四烯酸合成環(huán)氧化二十碳三烯甘油酸給予人舌癌細(xì)胞(Tca-8113)培養(yǎng)72 h, S期和G2/M期細(xì)胞比對(duì)照組明顯增多, Akt磷酸化水平顯著增加, 表明PI3K/Akt細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在細(xì)胞增殖過程中起重要作用。在前期實(shí)驗(yàn)中, 將十二碳稀酸[21], 十八碳稀酸[22], 不飽和脂肪酸(含二十碳稀酸)[23]分別給予不同腫瘤細(xì)胞, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)均有抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用, 但對(duì)其作用機(jī)制討論較少。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 給予EC56細(xì)胞二十碳烯酸處理后, TrkB、BDNF、FAK和Akt表達(dá)水平明顯下調(diào), 細(xì)胞凋亡率隨給藥劑量的增加而升高, 其中G0/G1細(xì)胞比例增加, G2/M細(xì)胞比例明顯減少, 進(jìn)入M期的細(xì)胞減少, 細(xì)胞分裂增殖被抑制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。結(jié)果提示, 二十碳稀酸對(duì)人食管癌細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用, 其作用機(jī)制與抑制PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)道通路中調(diào)控基因TrkB、BDNF、FAK和Akt表達(dá)水平和抑制人食管癌細(xì)胞分裂周期有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為充分利用自然環(huán)境資源, 協(xié)調(diào)生態(tài)環(huán)境平衡, 提高人類身心健康研究提供了參考依據(jù)。

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[23] 俞發(fā)榮, 李建軍, YU Xin, 等. 不飽和脂肪酸對(duì)人胃癌細(xì)胞PI3K-Akt 信號(hào)通路中相關(guān)基因表達(dá)的影響[J]. 生態(tài)科學(xué), 2019, 38(6): 60–63.

The mechanism of environmental factors on the regulation of human diseases

XIE Mingren1,LU Jianzhen1,WANG Xianxian1, XIE Liuyang1, YU Xin2, YU Farong1,*

1. School of Public Security Technical, Gansu University of Political Science and Law, Lanzhou 730070, China 2. Baylor College of Medicine, Houston, Texas,77030, US

In order to explore the regulatory mechanism of environmental factors on human diseases, the effects of plant extract eicosaenoic acid on regulatory gene expression level of PI3K-Akt signaling pathway in human esophageal cancer cells (EC56 cells) were studied. EC56 cells were cultured with 0.2,0.8,1.6 mg·L-1eicosaenoic acid and 5-FU for 48 h. The apoptosis rate of EC56 cells was detected with flow cytometry; expression levels of brain-derived neurotrophic factor (BDNF), tyrosine kinase receptor B (TrkB), adhesion spot kinase (FAK) and protein kinase (Akt) in EC56 cells were determined by ELISA. The results showed that the apoptosis rate was 15.46%, 21.52%, 23.13% and 18.34; compared with the control group, the apoptosis rate was significantly different (<0.01). The levels of BDNF and TrkB decreased by 22.76%, 43.90%, 56.91%, 40.65% and 22.59%, 43.49%, 67.76%, 49.28%, respectively (<0.01). The levels of FAK and Akt decreased by 14.34%,36.49%,50.7%,49.7% and 15.11%, 24.99%, 32.71%, 20.84%, respectively. The results indicated that plant extracts eicosaenoic acid had a significant inhibitory effect on the proliferation of EC56 cells, and its mechanism was related to the down-regulation of the expression levels of the regulatory genes TrkB, BDNF, FAK and Akt in the PI3K-Akt signaling pathway and the inhibition of the EC56 cell division cycle. The experimental results provide a reference for the research of making full use of natural resources, coordinating the balance of ecological environment and improving the physical and mental health of human beings.

eicosenoic acid; human esophageal cancer cells; cell division cycle; apoptosis; PI3K-Akt signaling pathway

10.14108/j.cnki.1008-8873.2020.06.022

R915

A

1008-8873(2020)06-175-06

2020-04-05;

2020-04-24

甘肅省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2016C-09); 蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015-3-80; 2019-1-48); 甘肅政法大學(xué)省級(jí)特色學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目; 甘肅政法大學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目(2016XZDLW04)

謝明仁(1977—), 男, 甘肅民勤人, 碩士, 副教授, 物證技術(shù)專業(yè)碩士生導(dǎo)師, 主要從事物證技術(shù)教學(xué)與研究, E-mail:xmr6700@gsli.edu.cn

俞發(fā)榮, 男, 博士, 研究員, 主要從事環(huán)境因素與人類健康的關(guān)系、藥理毒理學(xué)研究, E-mail: tim9898@163.com

謝明仁, 盧建珍, 王賢賢, 等. 環(huán)境因素對(duì)人類疾病調(diào)控作用機(jī)制研究[J]. 生態(tài)科學(xué), 2020, 39(6): 175–180.

XIE Mingren, LU Jianzhen, WANG Xianxian, et al. The mechanism of environmental factors on the regulation of human diseases[J]. Ecological Science, 2020, 39(6): 175–180.