茯苓提取物對高脂飲食致腸道菌群失調(diào)小鼠的影響△

吳振寧，祁龍凱，陳地靈

1.海南省中醫(yī)院，海南 海口 570203；2.廣東省科學(xué)院 廣東省微生物研究所 華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室/廣東省微生物安全與健康重點實驗室，廣東 廣州 510070

隨著社會經(jīng)濟發(fā)展及生活水平的提高，人類飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生較大改變，富含飽和脂肪的肉類及油炸食品攝入比例日益提高。研究顯示，長期高脂飲食可導(dǎo)致肥胖、高脂血癥、糖尿病等一系列慢性代謝性疾病[1-2]。腸道是人體最重要的消化器官，大部分營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收均在腸道進行，而人體腸道內(nèi)寄生著數(shù)萬億計的微生物。研究表明，腸道微生物與宿主能量代謝密切相關(guān)，其在肥胖、糖尿病等代謝性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中更是扮演重要角色[1，3]。菌群組成改變可能是飲食引發(fā)的肥胖及相關(guān)代謝性疾病的關(guān)鍵誘發(fā)因素。臨床大數(shù)據(jù)研究顯示，肥胖人群腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，菌群多樣性降低，厚壁菌門/擬桿菌門比值顯著提升[4]。動物實驗證實，長期高脂飲食可改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，破壞正常腸道屏障，促進異位脂肪沉積及腸道內(nèi)毒素脂多糖(LPS)進入內(nèi)循環(huán)引起全身低度炎癥[5-6]。

正常狀態(tài)下，機體內(nèi)腸道菌群結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。但諸多研究指出，飲食或膳食補充劑中的蛋白質(zhì)、糖類、膳食纖維、多酚等特定營養(yǎng)成分均可影響腸道菌群的組成。1977年，Hentges等[7]首次報道了膳食中的蛋白質(zhì)對腸道微生物的影響，通過比較素食與食用大量牛肉青少年人群的腸道微生物后發(fā)現(xiàn)，食肉的青少年腸道菌群中雙歧桿菌數(shù)量顯著降低，而擬桿菌和梭狀芽胞桿菌數(shù)量顯著增加。多項研究結(jié)果表明，攝入蛋白量與腸道微生物總體多樣性呈正相關(guān)[8-10]。目前除蛋白質(zhì)外，營養(yǎng)成分對腸道微生物影響更多集中于低聚糖、膳食纖維這類無法直接被人體消化吸收的碳水化合物，該類化合物可被腸道微生物發(fā)酵，為宿主提供能量[11-12]，且在此過程中可改變腸道環(huán)境，提高腸道菌群豐度及雙歧桿菌、乳酸菌等有益菌數(shù)量[13-15]。鑒于腸道微生物、飲食與健康的關(guān)聯(lián)，通過飲食或膳食補充劑改善腸道微生物可能對某些疾病的預(yù)防和治療具有重要作用。

茯苓是多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，中醫(yī)認為茯苓具有利水滲濕、寧心、健脾的功效，常用于水腫尿少、痰飲眩悸、脾虛食少、便溏泄瀉、心神不安、驚悸失眠等癥[16]。茯苓屬于藥食同源的藥材，不僅是常用健脾祛濕藥，更是滋補佳品，藥性緩和，補而不峻，利而不猛，已有2000多年應(yīng)用歷史。迄今為止，從茯苓中分離發(fā)現(xiàn)的化合物主要有多糖類、三萜類、甾醇等，藥理學(xué)研究表明，茯苓具有較好的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、調(diào)脂保肝等生物活性，其重要活性成分為多糖和三萜類[17-18]。本實驗從茯苓健脾開胃、調(diào)理腸道的功能入手，制備高脂飲食誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)模型，研究茯苓不同提取物對脂質(zhì)代謝和腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，以期為茯苓提取物調(diào)控脂質(zhì)代謝和腸道菌群的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 實驗動物

雄性昆明種(KM)小鼠50只，SPF級，體質(zhì)量12～14 g，28～30日齡，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號SCXK(粵)2013-0002。小鼠飼養(yǎng)于廣東省微生物所動物實驗中心，飼養(yǎng)溫度(23±1) ℃，濕度(55±10)%，采用12 h晝夜間斷照明。小鼠自由進食飲水。

1.2 試藥

茯苓藥材由廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司提供，批號：YW20190410，由廣東省微生物研究所陳地靈副研究員鑒定為多孔菌科茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf的干燥菌核，標(biāo)本保存于廣東省微生物研究所食用菌研究發(fā)展中心；氫氧化鈉、無水乙醇均為分析純(廣東光華科技股份有限公司)；總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測試盒(南京建成生物工程研究所)；高脂飼料購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心(批號：D12492，含52.2%基礎(chǔ)飼料、20%蔗糖、15%豬油、10%酪蛋白、1.2%膽固醇、0.6%磷酸氫鈣、0.4%石粉、0.4%預(yù)混料和0.2%膽酸鈉)。

1.3 儀器

ALPHA 1-4 LD plus型冷凍干燥機(德國Christ公司)；INFINITE 200 Pro型酶標(biāo)儀(勒菲生物科技有限公司)；HM340E型輪轉(zhuǎn)式切片機、HiStoStar組織包埋機、Excelsior AS型自動組織脫水機、Gemini AS型全自動染色機(賽默飛世爾儀器有限公司)；Illumina HiSeq 2500 PE250型測序儀(美國Illumina公司)；RE-6000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；ML-1600型平板顯微鏡(浙江康濤自動化設(shè)備有限公司)；ME204E型電子分析天平(d = 0.1 mg，梅特勒-托利多儀器有限公司)。

2 方法

2.1 茯苓不同提取物的制備

取干燥茯苓，粉碎，過三號藥篩。取粉末，加12倍量無水乙醇，加熱回流提取2 h，濾過，取續(xù)濾液即醇提取溶液；濾渣加12倍量水，加熱回流提取2 h，濾過，取第2次續(xù)濾液即為水提取溶液；濾渣加10倍量2%氫氧化鈉溶液，攪拌下浸泡12 h，超聲30 min，3000×g離心10 min，取上清即為堿提取溶液。將醇提取溶液、水提取溶液和堿提取溶液分別減壓濃縮、冷凍干燥，即得茯苓醇提取物(PCS)、茯苓水提取物(PCW)、茯苓堿提取物(PCA)，冷藏備用。

2.2 多糖、蛋白質(zhì)含量測定

多糖含量測定參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1676—2008《食用菌中粗多糖含量的測定》方法，蛋白質(zhì)含量測定參照中華人民共和國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5—16《食品中蛋白質(zhì)的測定》第一法：凱氏定氮法。

2.3 模型制備與給藥

飼養(yǎng)期間小鼠自由進食飲水，每日檢查1次，取全部健康小鼠進行實驗。50只KM小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機分成對照組、模型組、PCW組、PCA組、PCS組，每組10只。對照組用普通飼料喂養(yǎng)，模型組和各給藥組用高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)，連續(xù)喂養(yǎng)2個月后給藥。各給藥組按PCW 426.59 mg·kg-1、PCA 56.80 mg·kg-1、PCS 135.06 mg·kg-1灌胃給藥，相當(dāng)于茯苓生藥量2 g·kg-1，對照組及模型組按0.5 mL/只給予純水，每天給藥1次，連續(xù)給藥35 d。對照組小鼠繼續(xù)用普通飼料喂養(yǎng)，給藥組和模型組小鼠繼續(xù)用高脂高膽固飼料喂養(yǎng)。每組隨機選取8只進行檢測分析。

2.4 小鼠外觀體態(tài)觀察及體質(zhì)量檢測

每天觀察小鼠的外觀體態(tài)(毛、色、形)和動態(tài)并作相應(yīng)記錄，每隔7 d測量體質(zhì)量1次。

2.5 血樣及組織樣采集

小鼠末次灌胃24 h后，摘除眼球取血，血液經(jīng)4 ℃，1000×g離心2次，每次10 min，收集血清，儲存于-80 ℃冰箱備用。

取血后將小鼠頸椎脫臼處死，迅速剖取，收集肝臟、腸組織，并固定于4%多聚甲醛溶液中；收集盲腸內(nèi)容物，液氮猝滅后，儲存于-80 ℃冰箱。

2.6 血脂生化指標(biāo)的測定

取血清，解凍后按試劑盒說明操作，測定血清中HDL-C、LDL-C、TG、TC水平，分析數(shù)據(jù)并比較各組血脂4項指標(biāo)的變化。

2.7 小腸、肝臟病理學(xué)檢查

取多聚甲醛固定的小鼠小腸、肝組織，修剪后乙醇逐級脫水，石蠟包埋，切片，蘇木-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織、腸組織形態(tài)及病理變化。

2.8 盲腸內(nèi)容物16 S rRNA測序

提取小鼠盲腸內(nèi)容物中的DNA，檢測其質(zhì)量并定量；采用正向引物5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′和反向引物5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′對小鼠16 S rRNA的V3～V4區(qū)基因進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對目標(biāo)片段切膠回收；將PCR擴增回收產(chǎn)物進行熒光定量。根據(jù)熒光定量結(jié)果，將各組樣本按相應(yīng)比例混合后，制備測序文庫，用Illumina HiSeq 2500 PE250進行2×300 bp雙端測序。

在97%相似度下利用Qiime v1.8.0軟件進行操作分類單元(operational taxonomic units，OTUs)聚類和物種注釋，比較對照組、模型組及各給藥組小鼠的腸道菌群變化，觀察茯苓提取物對肥胖小鼠腸道菌群的影響。

2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

3 結(jié)果與分析

3.1 茯苓不同提取物中蛋白質(zhì)和多糖測定結(jié)果

茯苓不同提取物中多糖與蛋白質(zhì)的含量差異顯著，PCW中多糖和蛋白質(zhì)含量最高，PCA中多糖與蛋白質(zhì)含量最低，提示茯苓中多糖主要為水溶性多糖，其次為醇溶性小分子多糖，酸性多糖含量最低，蛋白質(zhì)主要為水溶性蛋白，見表1。

表1 茯苓不同提取物多糖和蛋白含量 g·kg-1

3.2 茯苓不同提取物對高脂飲食喂養(yǎng)小鼠外觀體態(tài)與體質(zhì)量的影響

在實驗過程中，與對照組比較，高脂飲食模型組小鼠毛皮暗淡無光澤；茯苓給藥組小鼠的毛皮較模型組更平滑光潤。高脂飲食連續(xù)飼喂2個月，與對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量顯著升高(P<0.01)，說明高脂飲食誘導(dǎo)肥胖模型造模成功。與模型組比較，連續(xù)灌胃不同茯苓提取物5周后，各給藥組小鼠平均體質(zhì)量均降低，其中PCW組小鼠平均體質(zhì)量(65.19 g)與模型組(71.02 g)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量差值顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，各茯苓提取物組小鼠體質(zhì)量差值均降低，其中PCW組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。表明茯苓不同提取物均可以減緩因高脂飲食導(dǎo)致的小鼠體質(zhì)量增加并提亮毛色，其中PCW效果最佳。

注：與對照組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；下同。圖1 茯苓不同提取物對高脂飲食喂養(yǎng)小鼠體質(zhì)量的影響

3.3 茯苓不同提取物對高脂飲食喂養(yǎng)小鼠血清脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響

與對照組比較，長期高脂飲食喂養(yǎng)可顯著升高小鼠血清TG和TC水平，降低HDL-C水平(P<0.01)。與模型組比較，茯苓不同提取物均可不同程度降低小鼠血清TG、TC和LDL-C水平，升高HDL-C水平(P<0.05，P<0.01)，見圖2。結(jié)果表明，長期高脂飼料會導(dǎo)致小鼠血脂代謝異常，茯苓不同提取物均可不同程度改善小鼠血脂代謝異常問題，其中茯苓水提物改善脂質(zhì)代謝異常效果最佳。

圖2 茯苓不同提取物對高脂飲食喂養(yǎng)小鼠血清脂質(zhì)代謝指標(biāo)的影響

3.4 茯苓不同提取物對高脂飲食喂養(yǎng)小鼠小腸和肝組織病理形態(tài)的影響

對照組小鼠小腸組織黏膜層較厚，絨毛較長且排列整齊緊密；模型組小鼠小腸黏膜顯著變薄，絨毛殘缺變短，排列疏松；給予茯苓不同提取物后，小鼠小腸黏膜厚度顯著增加，絨毛變長，完整性提高，其中PCW效果最好，見圖3。結(jié)果提示，長期高脂飲食可破壞腸道屏障，使腸壁變薄，絨毛變短，而茯苓提取物可不同程度改善小腸腸黏膜結(jié)構(gòu)，修復(fù)高脂飲食誘導(dǎo)的腸道損傷。

對照組小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)完整，中央靜脈附近的肝細胞有少許空泡樣變性和少量脂肪變性；模型組小鼠肝組織有明顯脂肪肝特征，多數(shù)肝細胞脂肪變性，空泡化，中央靜脈附近的肝細胞排列無序，出現(xiàn)點狀壞死，呈現(xiàn)蔓延性空泡樣；給予茯苓不同提取物后，各組小鼠肝臟雖仍有少量脂肪空泡，但細胞排列結(jié)構(gòu)較為完整，脂肪變性程度顯著降低，并趨向于正常水平，其中PCA改善高脂飲食誘導(dǎo)肝細胞損傷效果最好，見圖3。

結(jié)果提示，茯苓不同提取物均可不同程度降低長期高脂飲食所引起的脂質(zhì)在肝臟堆積，改善肝損傷。

注：A.小腸；B.肝組織。圖3 茯苓不同提取物對高脂飲食喂養(yǎng)小鼠小腸和肝組織病理形態(tài)的影響(HE)

3.5 茯苓不同提取物對高脂飲食喂養(yǎng)小鼠腸道菌群的影響

3.5.1茯苓提取物對腸道菌群α多樣性的影響α多樣性可以反映物種的豐富度和均勻度，其中Ace、Chao1和Observed OTUs是菌群豐度的常用算法，Shannon和Simpson是物種豐富度和均勻度的常用算法[19]。由表2可知，模型組小鼠腸道菌群的Ace、Chao1和Observed OTUs指數(shù)低于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，Shannon和Simpson指數(shù)無明顯變化。給予茯苓不同提取物后，與模型組比較，各組小鼠腸道菌群的Ace、Chao1和Observed OTUs指數(shù)均有不同程度的降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，Shannon和Simpson指數(shù)無明顯變化。結(jié)果表明，長期高脂飲食及給予茯苓不同提取物對小鼠腸道菌群豐度和多樣性影響較小。

表2 茯苓提取物對腸道菌群α多樣性的影響

3.5.2茯苓提取物對高脂飲食小鼠腸道菌群門水平的影響 茯苓提取物對高脂飲食小鼠腸道菌群門水平結(jié)構(gòu)影響見圖4。40個樣品共計得到203個OUT，歸屬于9個菌門，其中小鼠腸道微生物歸主要屬于厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和脫鐵桿菌門(Deferribacteres)。分析結(jié)果顯示，與對照組比較，長期高脂飲食可顯著提高厚壁菌門相對豐度，降低擬桿菌門相對豐度(P<0.05)。與模型組比較，茯苓不同提取物均可不同程度降低厚壁菌門相對豐度，提高擬桿菌門相對豐度，其中PCS組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

圖4 茯苓提取物對高脂飲食小鼠腸道菌群門水平的影響

3.5.3茯苓提取物對高脂飲食小鼠腸道菌群屬水平的影響 茯苓提取物對高脂飲食小鼠腸道菌群屬水平結(jié)構(gòu)影響見圖5。小鼠腸道微生物歸屬于20多個菌屬，其中平均質(zhì)量分數(shù)>1.0%的菌屬有AF12、乳桿菌屬(Lactobacillus)、顫螺旋菌屬(Oscillospira)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、Odoribacter、擬桿菌屬(Bacteroides)、普氏菌屬(Prevotella)、[Ruminococcus]、糞球菌屬(Coprococcus)、Dehalobacterium、Dorea、Mucispirillum和[Prevotella]等。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，與對照組比較，長期高脂飲食可顯著降低乳桿菌屬相對豐度(P<0.01)、顯著升高顫螺旋菌屬相對豐度(P<0.01)；與模型組比較，PCA和PCS可顯著提高乳桿菌屬相對豐度(P<0.05)，茯苓各提取物均可顯著降低顫螺旋菌屬相對豐度(P<0.01)，PCW可顯著提高瘤胃球菌屬相對豐度(P<0.05)，PCS可顯著降低瘤胃球菌屬相對豐度(P<0.05)。

圖5 茯苓提取物對高脂飲食小鼠腸道菌群屬水平的影響

4 討論

隨著經(jīng)濟水平的提高，富含脂肪類的肉類等食品在日常膳食中的比重日益提高，可提供足夠的能量及優(yōu)質(zhì)蛋白，但長期高脂飲食所引起的問題也日益凸顯，尤其是改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，破壞菌群與宿主間平衡，并由此引發(fā)肥胖、高血脂等系列代謝性疾病。本研究采用高脂飲食制備腸道菌群失調(diào)及肥胖小鼠模型，與對照組比較，各組小鼠未出現(xiàn)食量下降、體質(zhì)量降低、毛發(fā)灰暗粗糙等現(xiàn)象。但相對模型組，茯苓提取物組小鼠毛發(fā)更光亮。連續(xù)高脂飼料飼喂2個月后，模型組小鼠體質(zhì)量顯著高于對照組。給予茯苓提取物干預(yù)5周，各組小鼠體質(zhì)量及體質(zhì)量差值均低于模型組，其中PCW效果最顯著(P<0.05)，說明茯苓提取物對高脂飲食誘導(dǎo)肥胖具有一定抵抗作用。茯苓提取物對小鼠血清脂質(zhì)代謝指標(biāo)及肝組織病理形態(tài)的影響表明，長期高脂飲食誘使小鼠脂質(zhì)代謝失常及脂肪在肝臟堆積，而茯苓不同提取物呈現(xiàn)出不同程度的改善脂質(zhì)代謝、減少脂質(zhì)在肝臟堆積的作用，說明茯苓提取物具有調(diào)血脂及護肝作用，其中PCW效果最好，這可能與其中多糖和蛋白含量最高有密切關(guān)系。

研究表明[1-2]，肥胖個體腸道菌群異于正常個體，而飲食所致腸道菌群失衡與肥胖、高血脂等慢性代謝性疾病密切相關(guān)。小腸是機體最重要的營養(yǎng)消化吸收場所，小腸絨毛是小腸內(nèi)表面環(huán)形皺襞上的眾多絨毛狀的突起，可增大小腸吸收面積，其結(jié)構(gòu)好壞與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收密切相關(guān)，絨毛越長，吸收能力越強[20]。本研究中，長期高脂飲食使小腸黏膜顯著變薄，絨毛殘缺變短，排列疏松，腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，門水平上，厚壁菌門相對豐度顯著升高，擬桿菌門相對豐度顯著降低，這與以往研究[4，21]結(jié)果一致；屬水平上，長期高脂飲食可使乳桿菌屬相對豐度顯著降低，而PCA和PCS可以顯著提升乳桿菌屬相對豐度，乳桿菌屬多為腸道有益菌，其代謝產(chǎn)生的乳酸等有機酸可降低腸道pH，促進專性厭氧菌在腸道定植，抑制腐敗有害菌繁殖，調(diào)節(jié)腸道功能[22-23]。模型組小鼠腸道中顫螺旋菌屬相對豐度顯著升高，而各茯苓提取物可顯著降低顫螺旋菌屬相對豐度，使其回歸正常水平?？傊?，茯苓提取物可能通過修復(fù)小腸絨毛、調(diào)節(jié)腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)達到改善高脂飲食誘導(dǎo)腸道菌群失調(diào)的目的。

長期定向飲食或攝入膳食補充劑可顯著影響腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)[24-26]。飲食中的低聚糖、多糖等成分雖無法被機體利用，但可作為腸道微生物的碳源和益生元，提高腸道有益菌水平，對諸多疾病模型腸道菌群均會產(chǎn)生一定影響[27-28]。如龍眼多糖可有效改變小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高琥珀酸、乙酸、丙酸和丁酸等腸道菌群代謝物水平，并能顯著改善小鼠免疫指標(biāo)[29]。茯苓及其固態(tài)發(fā)酵物均對腸道正常菌群有扶植作用，可顯著提高雙歧桿菌的水平，可作為一種有效益生元[30-31]。本研究采用3種不同茯苓提取物，探討其對高脂飲食誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)的影響。結(jié)果表明，與模型組比較，茯苓3種提取物均能有效改善脂質(zhì)代謝，修復(fù)腸道屏障(小腸絨毛)，調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高乳桿菌屬等潛在有益菌數(shù)量，通過對上述多項指標(biāo)綜合分析推斷，茯苓提取物可能是通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)調(diào)脂、護肝、改善腸道微生態(tài)的作用。本研究雖驗證了茯苓不同提取物對高脂飲食誘導(dǎo)小鼠脂代謝和腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，但其作用機制仍需進一步研究。