基于4種序列的遼產(chǎn)蒼術(shù)屬植物DNA條形碼鑒定△

尹海波，鄧聰，王娜，任雪，陳吉祥

遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連 116600

菊科蒼術(shù)屬(AtractylodesDC.)植物為多年生草本，我國境內(nèi)有5種，遼寧地區(qū)有4種，分別為關(guān)蒼術(shù)A.japonicaKoidz.ex Kitam、朝鮮蒼術(shù)A.coreana(Nakai)Kitam、茅蒼術(shù)A.lancea(Thunb.)DC.[1](引種栽培)、北蒼術(shù)A.chinensis(Bunge)Koidz.[2]。蒼術(shù)首載于《本草經(jīng)集注》[3]，名為“赤術(shù)”?！吨腥A人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版以茅蒼術(shù)和北蒼術(shù)干燥根莖為蒼術(shù)的正品基原，主治濕阻中焦、風(fēng)濕痹痛等癥[4]。

DNA條形碼鑒定技術(shù)是一種在分子水平上具有很高可靠性的物種鑒定方法[5-6]?！吨袊幍洹?015年版以內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)作為DNA條形碼鑒定技術(shù)的主要序列片段，以psbA-trnH序列片段為輔鑒定物種[7]。matK基因是保證葉綠體功能正常運(yùn)行的重要基因之一[8]，廣泛應(yīng)用于枸杞、姜科植物、燈盞花等物種鑒定[9-11]。rbcL基因在光合作用和光呼吸中起關(guān)鍵作用[12]，應(yīng)用于浙貝母、陽春砂、鳶尾屬植物等物種的鑒別[13-15]。因此，本研究使用這4種序列片段對遼寧省蒼術(shù)屬植物進(jìn)行研究，探究適合蒼術(shù)屬分類的基因序列，并探究種內(nèi)與種間、野生品與栽培品之間的差異，為遼寧省蒼術(shù)屬植物規(guī)范化栽培種植提供參考。

1 材料

1.1 藥材

通過野外收集及栽培基地走訪，共收集遼寧地區(qū)蒼術(shù)屬植物4種，共43份樣品，其中朝鮮蒼術(shù)Atractylodescoreana(Nakai)Kitam 23份、茅蒼術(shù)A.lancea(Thunb.)DC 3份、關(guān)蒼術(shù)A.japonicaKoidz. ex Kitam 6份、北蒼術(shù)A.chinensis(DC.) Koidz 11份，所有樣品經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室尹海波教授鑒定，樣品存放于遼寧省中藥原料質(zhì)量檢測技術(shù)服務(wù)中心。樣品信息見表1。

表1 遼寧蒼術(shù)屬植物樣品信息

續(xù)表1

1.2 試劑

DP320新型植物基因組提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；2×EsTaqMasterMix (Dye)(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；引物(北京六合華大基因股份有限公司)；瓊脂糖及溴化乙錠(上海Sangon公司)；Trans 2k DNA Marker(大連寶生物股份有限公司)；無水乙醇等試劑(天津科密歐有限公司)。

1.3 儀器

PT-35SL型微量電子天平[華志(福建)電子科技有限公司]；TGL-16M型高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司)；HH-ZK型數(shù)控恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限公司)；G1000改進(jìn)型基因聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(杭州博日科技有限公司)；4100型凝膠成像處理系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；渦旋混勻器(德國IKA公司)；ABI3730XL型測序儀(美國Applied Biosystems公司)；移液槍(美國賽默飛世爾公司)；BCD-451WDEMU1型冰箱(青島海爾股份有限公司)。

2 方法

2.1 總DNA提取

選取干燥葉片，使用75%乙醇擦拭表面，干燥后放入無菌研缽，加入適量液氮研磨成細(xì)粉，稱取20 mg粉末，用試劑盒提取蒼術(shù)總DNA，操作步驟及注意事項(xiàng)均遵照試劑盒說明書。

2.2 PCR擴(kuò)增體系及條件

PCR擴(kuò)增體系為50 μL，包括2×EsTaqMasterMix (Dye) 25 μL，正反雙向引物各2 μL，DNA模板3 μL，加入ddH2O(18 μL)補(bǔ)充至50 μL，充分混勻后備用。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)過純化采用雙向測序。引物名稱、序列及擴(kuò)增條件見表2。

表2 引物名稱、序列及擴(kuò)增條件

2.3 數(shù)據(jù)處理

將測序后的正反向序列使用DNAMAN 8.0軟件拼接，使用MEGA 6.0軟件進(jìn)行序列比對，除去低質(zhì)量區(qū)及引物區(qū)獲得目標(biāo)序列，將比對好的序列使用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

3 結(jié)果與分析

蒼術(shù)屬植物共43個(gè)樣品4種序列通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA提取成功率、擴(kuò)增成功率均為100%，4種序列雙向測序成功率為100%。

3.1 系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析

基于ITS2、psbA-trnH、matK、rbcL 4種序列構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，見圖1。4種序列系統(tǒng)聚類樹聚類結(jié)果表明，僅ITS2序列將43個(gè)樣本的4種蒼術(shù)屬植物各自分為一支，分類清晰；而psbA-trnH、matK、rbcL 3種序列聚類較混亂，種之間不能各自分為一支，因此不能作為4種蒼術(shù)屬植物DNA條形碼鑒定的依據(jù)。

注：A.ITS2序列；B.psbA-trnH序列；C.matK序列；D.rbcL序列。圖1 蒼術(shù)屬植物4種序列系統(tǒng)聚類樹

3.2 ITS2二級結(jié)構(gòu)分析

將比對后得到的ITS2序列通過Internal Transcibed Spacer 2 Ribosomal RNA Database(http：//its2.bioapps. biozentrum.uni-wuerzburg.de/#opennewwindow)網(wǎng)站預(yù)測二級結(jié)構(gòu)，見圖2。圖中為4種蒼術(shù)屬植物ITS2序列的二級結(jié)構(gòu)，由1個(gè)主環(huán)和4個(gè)螺旋組成，結(jié)構(gòu)模型均為綠色，顯示輸入序列為BLAST標(biāo)識模型，綠色圓點(diǎn)表示同源序列的結(jié)構(gòu)和位置。從圖2中可以看出，4種蒼術(shù)屬植物ITS2序列模型相似，但是莖環(huán)數(shù)目和位置各不相同，莖環(huán)大小也有一定差異。

圖2 蒼術(shù)ITS2序列二級結(jié)構(gòu)

3.3 種間和種內(nèi)變異

43個(gè)蒼術(shù)樣品ITS2序列長度均為229 bp，其中種間變異位點(diǎn)有11個(gè)，其中朝鮮蒼術(shù)、茅蒼術(shù)種內(nèi)并無差異，關(guān)蒼術(shù)種內(nèi)G3樣品34號位存在1個(gè)變異位點(diǎn)C→T，G1～G3樣品125號位存在1個(gè)變異位點(diǎn)T→A，北蒼術(shù)種內(nèi)B8、B10樣品206號位存在1個(gè)變異位點(diǎn)C→T，見表3?；贗TS2序列的蒼術(shù)屬植物種間遺傳變異距離(0.012 494～0.044 865)>蒼術(shù)屬植物種內(nèi)遺傳距離(0～0.003 726)，見表4。

表3 基于ITS2序列的蒼術(shù)屬植物種間及種內(nèi)變異位點(diǎn)

表4 基于ITS2序列的蒼術(shù)屬植物種間遺傳變異距離

4 討論

蒼術(shù)作為大宗藥材，具有悠久的歷史?！哆|寧植物志》[2]中記載遼寧蒼術(shù)屬植物有3種，為北蒼術(shù)、關(guān)蒼術(shù)、朝鮮蒼術(shù)。而本實(shí)驗(yàn)樣品中的茅蒼術(shù)是從江蘇茅山引種至遼寧清原。4種蒼術(shù)屬植物的ITS2序列二級結(jié)構(gòu)圖顯示，朝鮮蒼術(shù)和北蒼術(shù)的非同源結(jié)構(gòu)及位置較少，關(guān)蒼術(shù)和茅蒼術(shù)相似但也有差異，關(guān)蒼術(shù)與其他3種蒼術(shù)不同之處在于多了1個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。從系統(tǒng)聚類樹可知，朝鮮蒼術(shù)和北蒼術(shù)為1支，支持率分別為65%和63%；茅蒼術(shù)和關(guān)蒼術(shù)為1支，支持率分別為63%和62%。4種蒼術(shù)屬植物聚類清晰，因此ITS2序列可作為遼寧蒼術(shù)屬植物DNA條形碼的有效序列。

《遼寧植物志》對于北蒼術(shù)和朝鮮蒼術(shù)的地理分布記載為“北蒼術(shù)生于灌叢間或干山坡”“朝鮮蒼術(shù)生于林下、林緣或干山坡”。姜宇珺等[18]研究結(jié)果表明，ITS2序列無法區(qū)分北蒼術(shù)和朝鮮蒼術(shù)，原因可能是其選用的北蒼術(shù)均為栽培品，栽培蒼術(shù)人工干預(yù)其生長環(huán)境的因素較大，因此導(dǎo)致2種蒼術(shù)遺傳分化不明顯。因《遼寧植物志》記載朝鮮蒼術(shù)和北蒼術(shù)地理分布和生長環(huán)境等有一定差異，郭蘭萍等[19]認(rèn)為，蒼術(shù)遺傳分化和地理分布具有一定相關(guān)性，因此產(chǎn)生了差異。

Chase等[20]認(rèn)為，rbcL基因序列的變異水平在種間水平以上，種間及種內(nèi)的變異很小，可能是rbcL基因序列不能鑒定蒼術(shù)屬植物的主要原因。Kress等[21]認(rèn)為，與種間變異相比，psbA-trnH序列的種內(nèi)變異相對較低。從系統(tǒng)聚類樹中得知，matK、psbA-trnH對蒼術(shù)的物種分離度低，因此不適合鑒定蒼術(shù)屬植物。Chen等[22]對7種序列識別物種的成功率進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)ITS2>psbA-trnH>matK>rbcL，而本實(shí)驗(yàn)4種系統(tǒng)聚類樹結(jié)果也驗(yàn)證了ITS2序列的識別能力最強(qiáng)。

馬起鳳等[23]根據(jù)性狀推測朝鮮蒼術(shù)和北蒼術(shù)均由南蒼術(shù)(河南以南)演變而來，蒼術(shù)葉裂這種性狀具有不穩(wěn)定性，不具備一定的分類學(xué)意義。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果ITS2序列片段系統(tǒng)聚類樹來看，朝鮮蒼術(shù)和北蒼術(shù)確實(shí)有較近的親緣關(guān)系；ITS2序列片段不能將葉裂和葉不裂的蒼術(shù)區(qū)分開，變異位點(diǎn)顯示葉裂與葉不裂也沒有差異，因此，這2種性狀可能不是由于基因變異造成的。系統(tǒng)聚類樹和變異位點(diǎn)結(jié)果表明，蒼術(shù)屬野生品與栽培品沒有差異，無法通過DNA條形碼鑒定，可以考慮從化學(xué)成分、顯微結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行鑒定?！吨袊参镏尽分懈鶕?jù)蒼術(shù)的生態(tài)型將北蒼術(shù)和茅蒼術(shù)合并為1個(gè)種，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，2種蒼術(shù)在分子生物學(xué)鑒定中存在一定差異，建議將北蒼術(shù)列為茅蒼術(shù)的亞種，茅蒼術(shù)作為原亞種較為合適。