新型冠狀病毒肺炎康復者恢復期血漿制備過程對SARS-CoV-2 IgG抗體滴度的影響*

鄭 雪， 包安裕， 瞿 珍， 許婷婷， 謝松麗△

1武漢血液中心，武漢 4300302武漢大學人民醫(yī)院檢驗科，武漢 430060

在新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情期間，武漢血液中心自2020年2月13日起開始執(zhí)行新冠肺炎康復者恢復期血漿的采集制備和發(fā)放任務，我中心承擔其中的制備工作，主要流程為分裝、病毒滅活及-30℃速凍。根據(jù)《新冠肺炎康復者恢復期血漿臨床治療方案(試行第二版)》的要求，新冠肺炎康復者血漿中具有治療價值的是IgG抗體[1]，且新冠肺炎病毒特異性IgG抗體是既往感染病毒的指示指標，故本研究只討論血漿制備過程中的各種因素對IgG抗體滴度的影響。

由于新冠肺炎病毒核酸檢測可能存在假陰性或假陽性，因此結合血清特異性病毒抗體檢測有助于彌補核酸檢測不足，同時對流行病學調(diào)查和疾病診斷起到輔助作用。國家衛(wèi)生健康委員會《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》對于確診病例增加了有關病毒特異性抗體檢測內(nèi)容，其中IgM抗體和IgG抗體同時陽性或血清IgG抗體由陰性轉為陽性或恢復期較急性期4倍及以上升高可以作為確診病例的診斷依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

隨機選取2020年2月至3月在武漢血液中心無償捐獻血漿的新冠肺炎康復者50名，其中男性30名，女性20名，平均年齡37.4歲。首次捐獻者41名，第2次捐獻者9名。檢驗科測定IgG抗體滴度大于1∶160的有38名，小于1∶160的有12名。留取捐獻者血漿病毒滅活前后的血漿樣辮，置于-20℃保存。

1.2 檢測方法

亞甲藍/光化學病毒滅活使用的是上海輸血技術有限公司生產(chǎn)的一次性使用病毒滅活輸血過濾器材和滅活柜。血漿辮在天商公司生產(chǎn)的天商-20℃冷庫中保存。IgG抗體滴度檢測由新波生物技術有限公司生產(chǎn)的2019-nCoV IgG抗體檢測試劑盒檢測，為科研試用試劑，使用其公司配套的型號為SuperFlex全自動化學發(fā)光免疫分析儀進行檢測分析。

采用SARS-CoV-2陰性血漿對50份滅活前后的血漿標本進行倍比稀釋，共設置了7個稀釋梯度，分別為1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1280、1∶2560，吸取稀釋后樣本各10 μL分別上機檢測。使用磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析法檢測滅活前后的抗體滴度。使用同樣的方法對采集的血漿標本在凍存前和-20℃凍存4個月后進行SARS-CoV-2 IgG抗體滴度檢測。

抗體滴度≥1∶160的血漿標本判定為合格標本，抗體滴度<1∶160的血漿標本判定為不合格標本。記錄實驗所得的化學發(fā)光量值，并轉換為抗體滴度等級。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 22.0軟件對滅活前后、凍存前后的血漿標本IgG抗體滴度進行Wilcoxon秩和檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 亞甲藍/光化學法滅活對IgG抗體滴度的影響

使用亞甲藍/光化學法滅活新冠肺炎康復者恢復期血漿，滅活前后的抗體滴度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.2 -20℃冰凍保存對IgG抗體滴度的影響

本研究中的樣本在捐獻者捐獻后即進行IgG滴度檢測，將樣本置于-20℃冷庫保存4個月，再次檢測IgG抗體滴度，Wilcoxon配對秩和檢驗顯示，凍存前后抗體滴度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2。

3 討論

新冠肺炎康復者恢復期血漿是患者在早期感染時激發(fā)體液免疫產(chǎn)生的針對病原的特異性抗體，康復后采集該患者的血漿所獲得的血漿制劑[2]。重癥患者輸注康復者恢復期血漿可以中和體內(nèi)感染病原，清除血液循環(huán)中的病原體以緩解病情[3]。2020年2月14日，國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布文件《新型冠狀病毒肺炎重癥、危重癥病例診療方案(試行第二版)》，將輸注恢復期血漿治療作為一種特異性治療方案加以推廣，并對捐獻者抗體水平做出規(guī)范要求[4-5]。根據(jù)《新冠肺炎康復者恢復期血漿臨床治療方案(試行第二版)》相關規(guī)定，血漿IgG抗體滴度大于1∶160或總抗體滴度大于1∶320時可用于臨床重癥患者治療[4]，本研究中的50份血漿標本中IgG抗體滴度合格(滴度大于1∶160)標本38份，IgG抗體滴度不合格(滴度小于1∶160)標本12份。

抗體滴度2、4、6分別代表1∶80、1∶320、1∶1280的滴度水平圖1 亞甲藍/光化學法滅活對IgG滴度的影響Fig.1 Influence of methylene blue/photochemical inactivation on IgG titer

抗體滴度2、4、6分別代表1∶80、1∶320、1∶1280的滴度水平圖2 血漿標本凍存前后IgG抗體滴度的變化Fig.2 The change of IgG titer before and after plasma freezing

對血液制品進行病毒滅活可采用多種方法，亞甲藍/光化學法滅活血漿病毒是近年來應用的新技術，在國內(nèi)應用最為廣泛，可使大多數(shù)的脂質(zhì)包膜病毒和部分的非脂質(zhì)包膜病毒滅活，特別是對HCV、HBV、HIV等病毒的滅活效果非常好。有研究顯示亞甲藍/光化學法可以高效滅活血漿中的脂包膜病毒，對SARS病毒也具有較強滅活作用[6]。我中心在制備新冠肺炎康復者恢復期血漿時，對每單位血漿都進行了病原滅活，以確保輸注的安全性[7]。由于IgG抗體是一種糖蛋白，亞甲藍/光化學法主要作用于病毒核酸和脂包膜上[8]，故對血漿中抗體生物活性影響較小。本研究50份滅活前后樣本對比也證實了這一點。但其中有1份顯示滅活前滴度大于1∶2560，滅活后滴度降到1∶160。為了排除取樣和操作誤差，我們重新測試了一遍，結果與上述無差。我們又將此標本原液和另外隨機4份標本原液進行了56℃ 30 min的熱滅活，此標本滅活后IgG抗體滴度降至1∶1280，而其他4份標本IgG抗體滴度未變?；仡櫺哉{(diào)查獻漿者捐獻資料，發(fā)現(xiàn)該獻漿者是4次捐漿中的第2次，第4次IgG抗體滴度檢測不合格。此特例情況未在其他文獻中找到可能原因，還需進一步深入研究。

我中心在血漿滅活后還進行了-30℃ 30 min速凍，并-20℃冷庫保存。目前有研究顯示，恢復期患者特異性血漿抗體在冰凍狀態(tài)下可以保持6個月到1年，或更長時間[9]。在實際工作中，新鮮冰凍血漿有效期為1年，普通冰凍血漿保存有效期更長，能保證血漿抗體的有效性。本研究顯示新冠康復者恢復期血漿的冰凍時間至少在4個月內(nèi)IgG抗體滴度無明顯衰減，但血漿中新冠特異性IgG抗體在冰凍保存條件下能保證臨床治療有效的最長期限的準確數(shù)據(jù)，還需要更多樣本來支持進一步的研究。

以上研究可以初步判定我中心在新冠肺炎康復者恢復期血漿制備上流程合理，對血漿中IgG抗體的保存基本沒有負面影響。武漢作為曾經(jīng)是疫情最嚴重的國內(nèi)城市，積極響應政府號召，仍在持續(xù)招募和采集新冠肺炎康復者恢復期血漿，希望在短時間內(nèi)能建立新冠恢復期血漿庫，以期在臨床的對癥治療，乃至疫苗研發(fā)和治療性抗體制備中發(fā)揮作用。