黃連解毒湯含藥血清通過TLR4/NF-κB信號通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)*

王俊力， 楊 運(yùn)， 邵 衛(wèi)， 羅衛(wèi)東， 張忠文， 梅俊華， 陳國華

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430022

毒邪作為一類重要的致病因素，既可由外侵入，又可由內(nèi)產(chǎn)生，與多種疾病的發(fā)生和演變密切相關(guān)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，人們對毒邪致病的認(rèn)識也在不斷深入，“內(nèi)生毒邪”的病因病機(jī)逐漸被廣為接受，如王永炎院士提出：“中風(fēng)后常有瘀毒、痰毒、熱毒互結(jié)，破壞形體，損傷腦絡(luò)”，從而在對腦病的認(rèn)識中形成了“毒損腦絡(luò)”的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)[1]。

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)[2]是發(fā)生于老年和老年前期，以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，屬于中醫(yī)癡呆范疇?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，β-淀粉樣蛋白(amyloid β peptide，Aβ)在腦內(nèi)的過度沉積會激活小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生神經(jīng)免疫炎癥反應(yīng)，引起神經(jīng)元內(nèi)穩(wěn)態(tài)異常及氧化損傷，使tau蛋白過度磷酸化，形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，導(dǎo)致膽堿神經(jīng)元選擇性丟失伴神經(jīng)遞質(zhì)分泌減少而出現(xiàn)臨床癡呆[3-6]，同時小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)是神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的重要影響因素[7]。而對于AD的中醫(yī)病機(jī)，現(xiàn)代部分醫(yī)家認(rèn)為腦為“清靈之府”，最忌穢氣濁毒，年邁體弱、臟腑虛衰再加外邪侵襲，人體臟腑功能失調(diào)，氣血津液運(yùn)行失常，體內(nèi)的痰濁、瘀血等不能及時排出，郁蒸腐化，化熱成毒，濁毒內(nèi)生，毒損腦絡(luò)，導(dǎo)致腦竅壅塞、神機(jī)失用而發(fā)為癡呆[8-9]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)的病理生理機(jī)制與中醫(yī)學(xué)的病因病機(jī)學(xué)說有不謀而合之處：Aβ沉積形成的老年斑、神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)，以及各種具有神經(jīng)元毒性的病理產(chǎn)物均屬于“內(nèi)生毒邪”范疇[10]。與毒邪相對應(yīng)的中醫(yī)解毒治法應(yīng)該具有明確的療效，目前的諸多研究也表明清熱解毒法能夠有效改善免疫炎癥反應(yīng)所帶來的機(jī)體損害，然而這種毒邪及清熱解毒法在癡呆發(fā)病及治療中的作用機(jī)制仍不明確。因此本研究通過脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化建立體外神經(jīng)炎癥模型，探討黃連解毒湯含藥血清對神經(jīng)炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用，以期為清熱解毒法治療AD提供科學(xué)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和細(xì)胞

SPF級雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量(250±20)g，購自三峽大學(xué)實驗動物中心，合格證號：No.42010200001292。BV2小膠質(zhì)細(xì)胞株購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心(資源編號：3142 C0001000000337)。本實驗經(jīng)武漢市第一醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥品與主要試劑

中藥材黃連、黃芩、黃柏、梔子購于武漢市第一醫(yī)院中藥房(湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司提供)，武漢市第一醫(yī)院制劑中心制作黃連解毒湯浸膏，本課題組質(zhì)控后備用；高糖DMEM培養(yǎng)液(貨號：SH30022.01)、青霉素和鏈霉素(貨號：SV30010)、0.25%胰蛋白酶(含EDTA，貨號：SH30042.01)購于Hyclcone公司；胎牛血清(FBS)購于Gibco公司(貨號：04-121-1)；NO檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司(貨號：S0024)；小鼠白細(xì)胞介素-6(IL-6)及白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒均購于深圳欣博盛生物科技有限公司(貨號：EMC004.96，EMC001b.96)；RNAiso Plus、Prime ScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRTMPremix Ex Taq TMⅡ購于TaKaRa公司(貨號：D9108A，RR047A，RR820A)；兔來源MyD88多克隆抗體(分子量33 kD，貨號：AF5195，稀釋度1∶1000)、兔來源TLR4單克隆抗體(分子量95 kD，貨號：Ab13556，稀釋度1∶500)購于Affinity公司；兔來源NF-κB p65多克隆抗體(分子量65 kD，貨號：Ab16502，稀釋度1∶2000)、兔來源IκBa多克隆抗體(分子量36 kD，貨號：Ab7217，稀釋度1∶2000)、兔來源p-IκBa單克隆抗體(分子量35 kD，貨號：Ab133462，稀釋度1∶10000)、兔來源p-NF-κB p65多克隆抗體(分子量60 kD，貨號：Ab106129，稀釋度1∶1000)和兔來源GAPDH單克隆抗體(分子量36 kD，貨號：Ab181602，稀釋度1∶10000)均購于Abcam公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(貨號：A21010)購于EARTH公司。

1.3 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理

選用高糖DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)培養(yǎng)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞株，培養(yǎng)箱條件為37℃、5%CO2，按照BV2小膠質(zhì)細(xì)胞生長情況，每隔1～2 d更換培養(yǎng)液。

取對數(shù)生長期BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，分為5組：10%空白大鼠血清組(Control組)、10%空白大鼠血清+LPS組(Control+LPS組)、黃連解毒湯含藥血清(5%、10%、20%)+LPS組(HLJDD+LPS組)；各組LPS濃度均為1 μg/mL，各HLJDD+LPS組用對應(yīng)含藥血清預(yù)處理1 h后再加入LPS作用24 h，完成后續(xù)實驗。

1.4 黃連解毒湯含藥血清及大鼠對照血清制備

SPF級SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，隨機(jī)分為大鼠對照血清組和黃連解毒湯組，每組10只，分別給予生理鹽水和黃連解毒湯灌胃(1 mL/100 g，2次/d)，連續(xù)6 d；第6天第1次給藥后1 h，以水合氯醛腹腔麻醉實驗大鼠，經(jīng)心臟采集全血并分組混勻，靜置1 h后3000 r/min離心15 min分離血清，56℃水浴30 min滅活，微孔濾膜過濾除菌，凍存管分裝，-70℃保存?zhèn)溆?；黃連解毒湯含藥血清以高糖DMEM培養(yǎng)液配制成5%、10%、20%濃度備用，大鼠對照血清以高糖DMEM培養(yǎng)液配制成5%濃度備用。

劑量換算：依據(jù)實驗動物與人的體表面積比例表[11]進(jìn)行劑量換算，70 kg人的等效劑量相當(dāng)于200 g大鼠的56倍，故黃連解毒湯組SD大鼠灌胃劑量=30÷56÷0.2=2.678(g/kg)。

1.5 實時熒光定量PCR(qPCR)檢測TLR4、MyD88、IκBa和NF-κB p65 mRNA表達(dá)

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞接種于6孔板(2.5×105個/孔)中，細(xì)胞分組及處理同上。按照RNA提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞總RNA，經(jīng)分光光度計測定濃度和純度后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA(反應(yīng)體積20 μL)。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃ 1 min預(yù)變性，95℃ 15 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，循環(huán)40次；72℃末段延伸5 min。熔解曲線：72℃～95℃，每20 s升溫1℃。所用引物序列見表1，每組設(shè)3個復(fù)孔，使用GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的表達(dá)值。

表1 qPCR檢測所用引物序列Table 1 Primers used in qPCR detection

1.6 Western blot檢測TLR4、MyD88、p-IκBa、IκBa、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白的表達(dá)

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞接種到6孔板(2.5×105個/孔)中，按不同分組進(jìn)行處理。各組棄去培養(yǎng)液，無菌PBS清洗3次，加入蛋白酶抑制劑與RIPA裂解緩沖液的混合液提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，計算含40 μg蛋白的溶液體積即為上樣量。加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃水浴5 min變性。取各組蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后加入5%脫脂奶粉(0.5%TBST配制)常溫?fù)u床封閉1 h。分別加入兔抗GAPDH單克隆抗體、兔抗TLR4、MyD88、p-IκBa、IκBa、p-NF-κB p65和NF-κB p65抗體(各抗體稀釋倍數(shù)如前所述)，4℃孵育過夜。0.5% TBST洗膜10 min×3次，加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(抗體稀釋倍數(shù)如前所述)室溫下孵育30 min，0.5%TBST洗膜10 min×3次，加入等體積混勻的ECL化學(xué)發(fā)光試劑A和B，均勻滴加到膜的蛋白面，保持1～2 min后放入凝膠成像儀中曝光成像，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行各樣本條帶灰度值統(tǒng)計分析，結(jié)果以目的蛋白條帶與GAPDH條帶灰度值的比值表示。

1.7 ELISA法檢測IL-1β和IL-6含量

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞接種到96孔板中(5×104/mL，每孔100 μL)，按不同分組進(jìn)行處理。收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用ELISA試劑盒檢測IL-1β和IL-6水平，具體操作按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β和IL-6的含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 黃連解毒湯含藥血清對LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4、MyD88、IκBa和NF-κB p65 mRNA表達(dá)的影響

qPCR檢測結(jié)果顯示：與Control組比較，Control+LPS組細(xì)胞TLR4、MyD88、IκBa和NF-κB p65 mRNA的表達(dá)均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；而不同濃度黃連解毒湯含藥血清(5%、10%、20%)預(yù)處理后，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4、MyD88、IκBa和NF-κB p65 mRNA的表達(dá)均受到抑制，與Control+LPS組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，且抑制作用在實驗濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性(圖1)。

2.2 黃連解毒湯含藥血清對LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4、MyD88、p-IκBa、IκBa、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示：與Control組比較，Control+LPS組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4、MyD88、p-NF-κB p65和IκBa蛋白的表達(dá)均明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；而與Control+LPS組比較，黃連解毒湯含藥血清預(yù)處理后的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4、MyD88、p-NF-κB p65和IκBa蛋白的表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與Control組比較，Control+LPS組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB p65和p-IκBa蛋白表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；而與Control+LPS組比較，黃連解毒湯含藥血清預(yù)處理后的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NF-κB p65和p-IκBa蛋白的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)(圖2)。

與Control組比較，*P<0.05；與Control+LPS組比較，#P<0.05圖1 熒光定量PCR檢測TLR4、MyD88、IκBa和NF-κB p65 mRNA表達(dá)變化Fig.1 Fluorescent quantitative PCR for detection of relative mRNA expression of TLR4，MyD88，IκBa and NF-κB p65

1：Control組；2：Control+LPS組；3：HLJDD(5%)+LPS組；4：HLJDD(10%)+LPS組；5：HLJDD(20%)+LPS組；與Control組比較，*P<0.05；與Control+LPS組比較，#P<0.05圖2 各組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4、MyD88、p-IκBa、IκBa、p-NF-κB p65和NF-κB p65蛋白表達(dá)變化Fig.2 Changes of TLR4，MyD88，p-IκBa，IκBa，p-NF-κB p65 and NF-κB p65 protein expression in BV2 microglia in each group

2.3 黃連解毒湯含藥血清對LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞IL-1β和IL-6分泌的影響

ELISA檢測結(jié)果顯示(圖3)：與Control組比較，Control+LPS組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-6的濃度均明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；而不同濃度黃連解毒湯含藥血清(5%、10%、20%)預(yù)處理后，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-6的濃度顯著下降，與Control+LPS組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

與Control組比較，*P<0.05；與Control+LPS組比較，#P<0.05圖3 各組BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β和IL-6含量Fig.3 Changes of IL-1β and IL-6 in BV2 microglia in each group

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的神經(jīng)炎癥級聯(lián)反應(yīng)是AD等神經(jīng)退行性疾病的重要特征[12]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫防御細(xì)胞，β-淀粉樣蛋白沉積激活小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)是AD的核心病理機(jī)制[13-15]。既往研究表明，AD患者及實驗動物模型中均可觀察到β-淀粉樣蛋白周圍聚集有處于激活狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞[16-17]，小膠質(zhì)細(xì)胞分泌釋放多種炎性因子，對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性損傷[18-19]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，小膠質(zhì)細(xì)胞被激活后主要分化為發(fā)揮促炎作用的M1型和起抗炎作用的M2型[20-22]，因此，調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的激活是AD預(yù)防及治療的主要研究靶點(diǎn)之一。

黃連解毒湯是清熱解毒法的代表方劑，葛洪《肘后備急方》首次記載了其藥物組成，后經(jīng)唐朝王燾在《外臺秘要》中冠名為黃連解毒湯。本方由黃連、黃芩、黃柏、梔子四味中藥按3∶2∶2∶3的比例配伍組成。方中以黃連為君，瀉中焦之火，清心經(jīng)之熱；黃芩為臣，瀉上焦之火，清肺熱；黃柏為佐，瀉下焦之火，清腎經(jīng)虛熱；梔子為使，通瀉三焦之火，導(dǎo)火下行；四藥合用，苦寒直折，使火邪去而熱毒解，主治一切實熱火毒、三焦熱盛之證[23]。我們前期臨床研究發(fā)現(xiàn)[9]，黃連解毒湯可改善老年性癡呆(心肝火旺型)患者的智力和生活能力，延緩臨床癥狀的進(jìn)展；同時既往研究證實黃連解毒湯相關(guān)中藥的活性成分具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[24-25]，但目前其調(diào)控神經(jīng)炎癥反應(yīng)的機(jī)制尚未闡明。

本課題組前期通過LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞建立體外神經(jīng)炎癥模型[26]發(fā)現(xiàn)，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化可激活TLR4信號通路，促進(jìn)IL-1β和IL-6炎癥因子的分泌；TLR4信號通路主要通過其銜接蛋白MyD88/NF-κB和TRIF途徑下傳信號，其中MyD88/NF-κB途徑是經(jīng)典信號傳導(dǎo)途徑。LPS等刺激后，經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活MyD88，可誘發(fā)細(xì)胞質(zhì)中無活性狀態(tài)NF-κB相關(guān)蛋白的磷酸化，促使NF-κB向核內(nèi)轉(zhuǎn)位，激活相應(yīng)的靶基因，誘導(dǎo)多種促炎因子的表達(dá)，形成正反饋放大炎癥反應(yīng)。故本實驗采用LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化建立體外神經(jīng)炎癥模型，運(yùn)用此模型探討黃連解毒湯含藥血清對神經(jīng)炎癥反應(yīng)的保護(hù)機(jī)制，實驗結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞過量表達(dá)TLR4、MyD88、IκBa和NF-κB p65 mRNA，而黃連解毒湯含藥血清能有效抑制上述信號分子mRNA的表達(dá)；同時LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化可增高TLR4、MyD88、p-NF-κB p65和IκBa蛋白的表達(dá)，減少NF-κB p65和p-IκBa蛋白的表達(dá)，而黃連解毒湯含藥血清預(yù)處理后可抑制TLR4、MyD88、p-NF-κB p65和IκBa蛋白的表達(dá)，增加NF-κB p65和p-IκBa蛋白的表達(dá)；此外BV2小膠質(zhì)細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)下分泌釋放炎癥因子IL-1β和IL-6的水平顯著增加，而黃連解毒湯含藥血清預(yù)處理后上述炎癥因子的分泌明顯減少。

綜上所述，LPS誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化可誘發(fā)IκBa和NF-κB p65蛋白磷酸化，NF-κB p65核轉(zhuǎn)位，促進(jìn)IL-1β和IL-6炎癥因子的分泌；而黃連解毒湯含藥血清可抑制TLR4及MyD88的表達(dá)，影響IκBa降解和NF-κB p65核轉(zhuǎn)位而發(fā)揮抗炎保護(hù)作用，即黃連解毒湯含藥血清可能通過TLR4/NF-κB信號通路來進(jìn)行調(diào)控，初步闡明了黃連解毒湯的抗炎保護(hù)作用機(jī)制，為中醫(yī)清熱解毒法預(yù)防及治療AD等神經(jīng)炎癥相關(guān)性疾病提供了理論依據(jù)。由于時間和經(jīng)費(fèi)的限制，本實驗僅運(yùn)用體外實驗探討了黃連解毒湯的抗炎保護(hù)作用機(jī)制，并未運(yùn)用體內(nèi)實驗去觀察黃連解毒湯對AD動物行為學(xué)及病理改變的影響，這將是我們今后進(jìn)一步研究的方向之一。