孕激素對白假絲酵母菌刺激的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NLRP3炎性體表達(dá)的影響*

許 莉， 陳 娜

武漢市第一醫(yī)院皮膚科，武漢 430022

外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)是一種常見的陰道黏膜真菌感染性疾病，白假絲酵母菌是最常見的致病菌。VVC的主要癥狀為外陰瘙癢，陰道灼熱感，部分患者陰道分泌物增多，呈白色凝乳或豆渣樣，可通過性接觸傳染[1]。約75%育齡婦女在一生中至少感染一次VVC，其中約半數(shù)病例出現(xiàn)再次發(fā)作，5%病例最終發(fā)展為復(fù)發(fā)性VVC[1]。有研究發(fā)現(xiàn)孕婦陰道假絲酵母菌病發(fā)病率增高，而妊娠增加宿主對細(xì)菌、病毒、真菌的易感性可能與孕激素水平增高導(dǎo)致的免疫抑制效應(yīng)有關(guān)[2]。但孕激素是通過何種途徑下調(diào)機(jī)體的免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫抑制作用，并最終導(dǎo)致假絲酵母菌感染的發(fā)生，至今仍未闡明。NLRP3炎性體是一類大分子蛋白質(zhì)，它可激活半胱天冬酶-1(Caspase-1)，進(jìn)而促進(jìn)促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-18剪切為成熟的IL-1β、IL-18并分泌，在天然免疫、獲得性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[3]。IL-1β是一種具有多種免疫調(diào)節(jié)功能的炎性細(xì)胞因子，它可通過誘發(fā)炎性反應(yīng)及機(jī)體的防御反應(yīng)而參與抗白假絲酵母菌免疫反應(yīng)[4]。IL-18又稱IFN-γ誘導(dǎo)因子，主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可誘導(dǎo)T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，在抗真菌感染中發(fā)揮重要作用[5]。Simitsopoulou等[6]發(fā)現(xiàn)白假絲酵母菌通過核因子(NF)-κB活化途徑誘導(dǎo)人外周血單核細(xì)胞NLRP3表達(dá)的增加。此外，有研究顯示孕激素可下調(diào)NF-κB的表達(dá)和活性[7]。我們猜測孕激素可能通過調(diào)節(jié)NF-κB活性，進(jìn)而影響白假絲酵母菌刺激的巨噬細(xì)胞NLRP3表達(dá)及IL-1β、IL-18分泌。本研究觀察孕激素對白假絲酵母菌刺激后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3炎性體表達(dá)及炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-18分泌的影響，探討孕激素在白假絲酵母菌感染中的免疫抑制機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco)，小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，孕酮(Sigma)，Trizol(Invitrogen)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO)，SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(TaKaRa)，anti-NLRP3抗體(Abcam)，anti-NF-κB p65單抗(Santa)，anti-Caspase-1 p20單抗(Santa)，IL-1β ELISA試劑盒(Abcam)，IL-18 ELISA試劑盒(Abcam)。

1.2 菌株

所用白假絲酵母菌為澳大利亞悉尼Westmead醫(yī)院感染性疾病和微生物研究中心提供的標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC10231。實(shí)驗(yàn)前1 d將白假絲酵母菌轉(zhuǎn)種到新鮮的沙氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，取半環(huán)菌落于滅菌的PBS中，1500 r/min離心8 min，PBS洗滌2次，再用含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液將白假絲酵母菌調(diào)成106CFU/mL的懸液備用，錐蟲藍(lán)染色證實(shí)活細(xì)胞數(shù)>95%。

1.3 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)及處理

雌性BALB/c小鼠(6～8周齡，體質(zhì)量18～20 g)由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。常規(guī)提取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，按2×105/cm2接種于6孔板中，每孔加入2 mL含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待巨噬細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為5個實(shí)驗(yàn)組。①空白對照組：用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)8 h；②白假絲酵母菌組：加入106CFU/mL白假絲酵母菌懸液作用巨噬細(xì)胞8 h；③白假絲酵母菌+1×10-9mol/L孕酮組：預(yù)先用1×10-9mol/L孕酮作用巨噬細(xì)胞2 h，再加入106CFU/mL白假絲酵母菌懸液作用巨噬細(xì)胞8 h；④白假絲酵母菌+1×10-8mol/L孕酮組：預(yù)先用1×10-8mol/L孕酮作用巨噬細(xì)胞2 h，再加入106CFU/mL白假絲酵母菌懸液作用巨噬細(xì)胞8 h；⑤白假絲酵母菌+1×10-7mol/L孕酮組：預(yù)先用1×10-7mol/L孕酮作用巨噬細(xì)胞2 h，再加入106CFU/mL白假絲酵母菌懸液作用巨噬細(xì)胞8 h。

1.4 實(shí)時熒光定量PCR檢測細(xì)胞中NLRP3 mRNA表達(dá)

用Trizol試劑提取巨噬細(xì)胞總RNA，每組取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA。取1 μL cDNA產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)。RT-PCR所用引物序列如下，NLRP3上游：5′-AAGCAGCAGATGGAGACTGGAAA-3’，下游：5′-TGAACAGAGCCCTGGCAGGTAG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為149 bp；內(nèi)參β-actin上游：5′-TTCCTTCTTGGGTATGGAAT-3′，下游：5′-GAGCAATGATCTTGATCTTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為203 bp。

1.5 Western blot檢測NLRP3、Caspase-1 p20和NF-κB p65蛋白表達(dá)

分別提取培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的胞核蛋白和胞質(zhì)蛋白。提取的胞核蛋白用作NF-κB p65蛋白Western blot分析，胞質(zhì)蛋白用作NLRP3和Caspase-1 p20蛋白Western blot分析。取各組不同組分蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離，然后將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。加入稀釋后的一抗4℃孵育過夜，洗膜3次后加入稀釋的HRP標(biāo)記的二抗37℃孵育2 h，洗膜3次后用DAB緩沖液避光顯色。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-18含量

嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)完成后使用酶標(biāo)儀在450 nm處讀取樣本的吸光度值(A450nm)，依據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，間接法計(jì)算各組樣本的IL-1β、IL-18含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3 mRNA表達(dá)的變化

加入白假絲酵母菌刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞8 h，細(xì)胞內(nèi)NLRP3 mRNA的表達(dá)水平較空白對照組升高(P<0.01)。加入孕酮預(yù)處理2 h后，細(xì)胞內(nèi)NLRP3 mRNA的表達(dá)水平隨著孕酮作用濃度的升高而逐漸降低。1×10-7mol/L及1×10-8mol/L孕酮可以明顯降低白假絲酵母菌引起的巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3 mRNA表達(dá)增加，與白假絲酵母菌組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，見圖1。

1：空白對照組；2：白假絲酵母菌組；3：白假絲酵母菌+1×10-9mol/L孕酮組；4：白假絲酵母菌+1×10-8mol/L孕酮組；5：白假絲酵母菌+1×10-7mol/L孕酮組；與空白對照組比較，*P<0.01；與白假絲酵母菌組比較，#P<0.01圖1 熒光定量PCR檢測小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NLRP3 mRNA表達(dá)Fig.1 Detection of NLRP3 in murine peritoneal macrophages by real-time PCR

2.2 巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3、Caspase-1 p20和NF-κB p65蛋白表達(dá)的變化

不同組別小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Western blot結(jié)果顯示，白假絲酵母菌組細(xì)胞內(nèi)NLRP3、Caspase-1 p20和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平較空白對照組均明顯增加，分別為其6.21倍、5.50倍和4.86倍。加入孕酮預(yù)處理2 h后，細(xì)胞內(nèi)NLRP3、Caspase-1 p20和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平隨著孕酮作用濃度的升高而逐漸降低。加入1×10-7mol/L或1×10-8mol/L孕酮可以明顯降低白假絲酵母菌刺激引起的巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3、Caspase-1 p20和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平升高，與白假絲酵母菌組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(圖2、3)。

2.3 培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-1β、IL-18含量的變化

加入白假絲酵母菌刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞8 h，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-18含量均較空白對照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。加入孕酮預(yù)處理2 h后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、IL-18水平隨著孕酮作用濃度的升高而逐漸降低。加入1×10-7mol/L或1×10-8mol/L孕酮可以明顯降低白假絲酵母菌刺激引起的巨噬細(xì)胞IL-1β、IL-18分泌，與白假絲酵母菌組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(表1)。

1：空白對照組；2：白假絲酵母菌組；3：白假絲酵母菌+1×10-9mol/L孕酮組；4：白假絲酵母菌+1×10-8mol/L孕酮組；5：白假絲酵母菌+1×10-7mol/L孕酮組圖2 免疫印跡法檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)NLRP3、Caspase-1 p20、NF-κB p65蛋白表達(dá)Fig.2 Detection of NLRP3，Caspase-1 p20 and NF-κB p65 in murine peritoneal macrophages by Western blotting

1：空白對照組；2：白假絲酵母菌組；3：白假絲酵母菌+1×10-9mol/L孕酮組；4：白假絲酵母菌+1×10-8mol/L孕酮組；5：白假絲酵母菌+1×10-7mol/L孕酮組；與空白對照組比較，*P<0.01；與白假絲酵母菌組比較，#P<0.01圖3 NLRP3、Caspase-1 p20、NF-κB p65蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.3 Comparison of NLRP3，Caspase-1 p20 and NF-κB p65 protein expression levels among different groups

表1 培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-1β、IL-18含量的變化Table 1 The levels of IL-1β and IL-18 in the

3 討論

NLRP3炎性體是由核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族成員NLRP3、接頭蛋白ASC和效應(yīng)蛋白Caspase-1組成的一種分子量約為700 kD的大分子多蛋白復(fù)合體，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮外源性微生物或內(nèi)源性危險信號感受器的作用，是Caspase-1活化所必需的反應(yīng)平臺[3]。NLRP3炎性體組裝并激活，將無活性的Caspase-1前體轉(zhuǎn)化為活性Caspase-1，活化的Caspase-1可將不活躍的IL-1β、IL-18前體加工成成熟的促炎細(xì)胞因子并分泌，引起炎癥反應(yīng)[3]。本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，給予白假絲酵母菌刺激后小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NLRP3 mRNA表達(dá)顯著增加，胞質(zhì)內(nèi)NLRP3蛋白表達(dá)及活化形式的Caspase-1 p20蛋白表達(dá)也顯著增加，細(xì)胞上清中IL-1β、IL-18的分泌亦相應(yīng)地顯著增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在白假絲酵母菌感染小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的體外模型中，NLRP3炎性體參與了Caspase-1的活化及炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-18的分泌。在白假絲酵母菌感染中，IL-1β作為一種重要的促炎反應(yīng)介質(zhì)，可以活化T細(xì)胞并間接活化B細(xì)胞、提高粘附分子表達(dá)、誘導(dǎo)一系列其它促炎性細(xì)胞因子以及炎性相關(guān)蛋白表達(dá)，形成炎性反應(yīng)的放大級聯(lián)反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的抗真菌免疫反應(yīng)及組織損傷過程[4]。Borghi等[5]發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)性VVC患者陰道分泌物中IL-18水平低于健康對照者，IL-18缺乏可導(dǎo)致VVC易感性增加和Th17/Treg失衡，提示IL-18可能在宿主防御假絲酵母菌感染中發(fā)揮了重要作用。

孕激素與VVC關(guān)系非常密切，在黃體期的女性及孕婦容易感染假絲酵母菌性陰道炎[8]。妊娠期間孕婦體內(nèi)高性激素水平導(dǎo)致陰道組織內(nèi)糖原增多，為假絲酵母菌的生長和繁殖提供了良好的碳源，可導(dǎo)致VVC反復(fù)發(fā)作且癥狀嚴(yán)重[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)假絲酵母菌存在類固醇結(jié)合蛋白，孕激素可促進(jìn)假絲酵母菌形成假菌絲，耐藥基因活化可使其毒力增強(qiáng)[9]。這些都說明孕激素對機(jī)體具有免疫調(diào)節(jié)功能，能影響宿主對假絲酵母菌的易感性及炎癥反應(yīng)。

NF-κB是一種重要的多功能核轉(zhuǎn)錄因子，最常見的活化形式是NF-κB p65，它激活后參與眾多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子、粘附分子、趨化因子等的表達(dá)[10]。孕激素主要是通過孕激素作用元件與NF-κB的相互作用引起免疫抑制效應(yīng)，孕激素預(yù)處理能有效地抑制NF-κB p65亞基的核轉(zhuǎn)位，且NF-κB p65亞基核轉(zhuǎn)位的抑制反映了NF-κB活性的下降[11]。本實(shí)驗(yàn)中，加入不同濃度的孕酮預(yù)處理后，隨著孕酮濃度的增加，白假絲酵母菌刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的NLRP3 mRNA表達(dá)水平，胞質(zhì)內(nèi)NLRP3蛋白和活化形式的Caspase-1 p20蛋白表達(dá)以及細(xì)胞上清中IL-1β、IL-18的分泌均逐漸降低，且這種逐漸降低的趨勢與胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白的逐漸減少趨勢一致。這表明孕酮可抑制白假絲酵母菌刺激引起的巨噬細(xì)胞NLRP3表達(dá)及IL-1β、IL-18分泌，且這種抑制作用可能是通過抑制NF-κB活性實(shí)現(xiàn)的。

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，在白假絲酵母菌感染時NLRP3炎性體的活化參與了炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-18的分泌，孕激素可以抑制NLRP3表達(dá)水平及炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-18分泌，且孕激素對NLRP3的抑制作用可能與其抑制NF-κB活性有關(guān)。這為解釋孕激素在VVC婦女發(fā)病中的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供了一定的科學(xué)依據(jù)。