藏藥甲地然果中化學(xué)成分、微量元素及礦物元素含量測(cè)定方法研究進(jìn)展*

劉學(xué)良，陳 鵬，韓達(dá)斌，俞雅瓊，祝艷年，劉海青

（青海省食品藥品監(jiān)督管理局食品藥品審評(píng)中心，青海 西寧 810007）

甲地然果［1－2］又名吉合斗拉果瑪和賈滴仁高瑪［3］，為龍膽科Gentianaceae花錨屬植物橢圓葉花錨Halenia ellipiticaD.Don的干燥地上部分，味苦，性寒，清熱利濕，平肝利膽，為藏醫(yī)藥系統(tǒng)中用于治療肝膽系統(tǒng)疾病的常用藥材品種“蒂達(dá)”的主要原植物之一，泛稱藏茵陳［4］，現(xiàn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥（第一冊(cè)）》［1］。目前已從橢圓葉花錨中分離得到了酮及其苷類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、三萜類和生物堿等成分［5－6］。在此，綜述了橢圓葉花錨化學(xué)成分的含量測(cè)定方法，為更好研究、開發(fā)、利用橢圓葉花錨提供參考。

1 主要化學(xué)成分、微量元素及礦物元素含量測(cè)定

紀(jì)蘭菊等［7］以甲醇為溶劑對(duì)橢圓葉花錨成分進(jìn)行加熱回流提取，再經(jīng)C18硅膠小柱做脫脂處理，以VP－ODS C18柱為色譜柱，乙腈－水－0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用HPLC法測(cè)定橢圓葉花錨中青蘭苷、去甲氧基花錨苷和花錨苷的含量。結(jié)果表明，野生花錨藥材中去甲氧基花錨苷含量高于花錨苷，栽培花錨中花錨苷和去甲氧基花錨苷含量與野生花錨無明顯差異，初步證明栽培植物藏藥花錨可代替野生花錨入藥。

王宏［8］、王瓊［9］分別以三氯甲烷為溶劑加熱回流提取乙肝健片（A）橢圓葉花錨為原料的單方制劑中的2種酮類成分，以C18柱為色譜柱，以乙酸乙酯－甲醇（70∶30，V/V）為流動(dòng)相，采用HPLC法測(cè)定2種酮類成分（1－羥基－2，3，5，7－四甲氧基酮和1－羥基－2，3，5－三甲氧基酮）的含量。

俞培忠等［10］以甲醇為溶劑對(duì)橢圓葉花錨藥材進(jìn)行超聲提取，以Kromasil C18柱為色譜柱，以0.01 mol/L磷酸氫二鉀溶液（pH8.0）－甲醇（20∶80，V/V）為流動(dòng)相，采用HPLC法測(cè)定橢圓葉花錨中4種酮類成分（1－羥基－2，3，5－三甲氧基酮，1－羥基－2，3，4，5－四甲氧基酮，1－羥基－2，3，7－三甲氧基酮，1－羥基－2，3，4，7－四甲氧基酮）的含量，結(jié)果4個(gè)酮類成分的含量分別為0.38%，0.82%，0.28%，0.21%。

古銳等［11］以90%甲醇（酸水解）為溶劑對(duì)不同產(chǎn)地的橢圓葉花錨藥材進(jìn)行水浴回流提取，以Welchrom C18柱為色譜柱，以乙腈－水（43∶57，V/V）為流動(dòng)相，采用HPLC法測(cè)定橢圓葉花錨中4種酮類成分（1－羥基－2，3，4，7－四甲氧基酮，1－羥基－2，3，7－三甲氧基酮，1－羥基－2，3，4，5－四甲氧基酮，1－羥基－2，3，5－三甲氧基酮）的含量。結(jié)果不同產(chǎn)地橢圓葉花錨藥材中4種酮類成分在植株花和葉中的含量高于莖和根，水解后前者的含量約為后者的4倍，提示在藥材采集后的干燥、儲(chǔ)存過程中應(yīng)注意避免因花、葉脫落而導(dǎo)致藥材質(zhì)量降低。

申曉娟等［12］以甲醇為溶劑對(duì)橢圓葉花錨、花錨藥材進(jìn)行超聲提?。ㄌ崛∫豪渲煤筮^濾除去雜質(zhì)），以Kromasil C18柱為色譜柱，以甲醇－水（65∶35，V/V）為流動(dòng)相，采用反相高效液相色譜（RP－HPLC）法測(cè)定2種藥材中異龍膽黃素（1，3－二羥基－7－甲氧基酮）的含量。結(jié)果表明，2種藥材中異龍膽黃素的含量相差較大。

馮麗娟等［13］以甲醇為溶劑，對(duì)不同時(shí)間段采集的野生和栽培橢圓葉花錨藥材（C18硅膠小柱除去色素）進(jìn)行回流提取，以VP－ODS C18柱為色譜柱，乙腈－0.1%磷酸溶液（梯度洗脫）為流動(dòng)相，采用RP－HPLC法測(cè)定含量。結(jié)果表明，夏季采收的栽培與野生藥材中有效成分的含量最高，秋季采收的最低；人工管理措施不同等因素可能造成去甲氧基花錨苷、花錨苷等有效成分含量的差異。

王琰等［14］以甲醇為溶劑對(duì)橢圓葉花錨藥材進(jìn)行超聲提取（提取液離心處理），以Alltima C18柱為色譜柱，乙腈－0.5%磷酸溶液（梯度洗脫）為流動(dòng)相，大氣壓化學(xué)電離（APCI）為離子源，正離子為掃描模式，采用HPLC－DAD－MS法測(cè)定采集和市售橢圓葉花錨中6種酮類成分，即5個(gè)酮苷元［1－羥基－2，3，5－三甲氧基－酮（HM－1），1－羥基－2，3，4，7－四甲氧基－酮（HM－2），l－羥基－2，3，4，5－四甲氧基－酮（HM－3），1，7－二羥基－2，3，4，5－四甲氧基－酮（HM－4），l，5－二羥基－2，3－二甲氧基－酮（HM－5）］及1個(gè)酮苷1－O－［β－D－木糖－（1－6）－β－D－葡糖］－2，3，5－三甲氧基－酮（HM－2－10）的含量。結(jié)果表明，采集樣品中酮苷（HM－2－10）的含量明顯高于市售樣品，雖然不同樣品中酮的含量差異較大，但所有藥材中均以HM－1和HM－3的含量最高，HM－4和HM－5的含量最低。

吉文鶴等［15］以甲醇為溶劑對(duì)不同時(shí)間段采集的野生和栽培橢圓葉花錨藥材（C18硅膠小柱除去色素）中的成分進(jìn)行回流提取，以VP－ODS C18柱為色譜柱，乙腈－0.1%磷酸溶液（梯度洗脫）為流動(dòng)相，采用RP－HPLC法測(cè)定花錨中花錨苷和去甲氧基花錨苷的含量。結(jié)果表明，去甲氧基花錨苷的含量高于花錨苷，且2種苷的含量由6月至9月逐漸降低。

1.2 黃酮類化合物

黃酮類化合物的基本骨架為C6—C3—C6，包括黃酮類、二氫黃酮類、異黃酮類、查耳酮類、黃酮醇類、橙酮類、黃烷醇類等，具有抗心肌缺血、降壓、抗胃潰瘍、保護(hù)神經(jīng)、保護(hù)生殖系統(tǒng)、抗炎、抗腫瘤、降血糖等藥理學(xué)作用［16］。橢圓葉花錨中的黃酮類成分主要有5－羥基－2－甲氧基色原酮、木犀草素－7－O－龍膽雙糖苷、芹菜素－7－O－龍膽雙糖苷、木犀草素－7－O－β－D－葡萄糖苷等化合物［17］。楊曉泉等［18］以甲醇為溶劑，在50℃條件下超聲提取橢圓葉花錨樣品中的成分，以Thermo Syncronis－C18柱為色譜柱，以乙腈－0.04%磷酸溶液（梯度洗脫）為流動(dòng)相，采用HPLC法測(cè)定云南3個(gè)產(chǎn)地橢圓葉花錨中芒果苷的含量，并與其他“蒂達(dá)”類藥材進(jìn)行比較。結(jié)果表明，橢圓葉花錨作為藏藥“蒂達(dá)”在民間使用最廣泛的基原植物，與傳統(tǒng)對(duì)藏藥“蒂達(dá)”的認(rèn)識(shí)保持一致。

1.3 環(huán)烯醚萜及其他萜類化合物

橢圓葉花錨中的環(huán)烯醚萜類化合物包括獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、龍膽苦苷，均為龍膽科植物的重要活性成分，具有保肝、調(diào)脂、降血糖、抗炎、抗腫瘤、保護(hù)神經(jīng)等多種藥理學(xué)作用，對(duì)肝臟疾病，尤其是治療高血糖、高脂血癥療效較好，主要通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)途徑、膽汁酸合成通路、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）信號(hào)通路產(chǎn)生藥效。同時(shí)，具有抗腫瘤和保護(hù)神經(jīng)等生物活性［19］。齊墩果酸和熊果酸等三萜類化合物具有保肝、護(hù)肝、降低轉(zhuǎn)氨酶、增加白細(xì)胞、清熱、消炎、抑菌等作用［20－21］。熊果酸除具有抗促癌、抗突變、抗氧化作用外，還具有誘導(dǎo)消化道腫瘤細(xì)胞、白血病細(xì)胞凋亡作用［22］。目前，主要采用HPLC法測(cè)定萜類化合物的含量。

高光躍等［23］以甲醇為溶劑對(duì)橢圓葉花錨樣品中的成分進(jìn)行超聲提取，以水－甲醇－異丙醇－四氫呋喃（65∶30∶5∶1，V/V/V/V）為流動(dòng)相，采用HPLC法測(cè)定橢圓葉花錨中3種環(huán)烯醚萜苷類成分（獐牙菜苷、獐牙菜苦苷、龍膽苦苷）的含量，并與其他“蒂達(dá)”類藥材進(jìn)行比較。結(jié)果表明，橢圓葉花錨外形與獐牙菜屬植物極為相似，在西南地區(qū)二者?；煜褂茫渖V圖與獐牙菜屬植物相差很大，且不含龍膽苦苷，故建議二者區(qū)別使用。

俞青芬［24］以甲醇為溶劑對(duì)不同產(chǎn)地橢圓葉花錨樣品中的成分進(jìn)行超聲提取，以Kromasil C18柱為色譜柱，以甲醇－0.04 %磷酸溶液（梯度洗脫）為流動(dòng)相，采用HPLC法測(cè)定青海省樂都和循化兩地區(qū)野生橢圓葉花錨中2種環(huán)烯醚萜苷類成分（落干酸和龍膽苦苷）的含量。結(jié)果表明，樂都地區(qū)樣品中落干酸的含量最高，循化地區(qū)樣品中龍膽苦苷的含量最高。

楊慧玲等［25］以無水乙醇為溶劑對(duì)橢圓葉花錨中的成分進(jìn)行超聲提取，以Phenomenex Kromasic C18柱為色譜柱，以甲醇－水－磷酸（94∶4∶2，V/V/V）為流動(dòng)相，采用HPLC法測(cè)定栽培條件下不同生長期、野生狀態(tài)下不同海拔的橢圓葉花錨中齊墩果酸的含量。結(jié)果表明，齊墩果酸的含量受物候期和海拔變化的影響，花期階段熊果酸含量最高；橢圓葉花錨中齊墩果酸的含量隨海拔的增加而增加；栽培藥材的含量低于野生藥材。

李志軍［26］、朱鵬程等［27］均以95%乙醇為溶劑對(duì)不同產(chǎn)地橢圓葉花錨中的成分進(jìn)行超聲提取，以Thermo C18柱為色譜柱，以甲醇－0.4%磷酸溶液（85∶15，V/V）為流動(dòng)相，采用HPLC法測(cè)定青海省青沙山、大通寶庫鄉(xiāng)兩地野生橢圓葉花錨中2種三萜類成分（熊果酸、齊墩果酸）的含量。結(jié)果表明，青沙山產(chǎn)地藥材中熊果酸和齊墩果酸的含量較高，2個(gè)產(chǎn)地花錨中熊果酸的含量均高于齊墩果酸。

馮京等［28］以甲醇為溶劑對(duì)橢圓葉花錨中的成分進(jìn)行超聲提取，以Diamonsl C18柱為色譜柱，以甲醇－0.5%磷酸水溶液（85∶15，V/V）為流動(dòng)相，采用HPLC法測(cè)定橢圓葉花錨中2種三萜類成分（熊果酸、齊墩果酸）的含量。結(jié)果表明，溫度對(duì)花錨藥材中齊墩果酸和熊果酸的分離度影響最大，低溫會(huì)延長組分保留時(shí)間，增大分離度，20℃為最佳柱溫；流速為0.8 mL/min時(shí)可提高分離度，同時(shí)能保持良好的峰形。

1.4 揮發(fā)油類化合物

楊紅澎等［29］采用氣相色譜質(zhì)譜（GC－MS）技術(shù)和參考美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（NIST）質(zhì)譜庫，首次從橢圓葉花錨的揮發(fā)油中發(fā)現(xiàn)并鑒定了其中的51種成分，并采用色譜峰面積歸一化法計(jì)算了各成分的相對(duì)含量。結(jié)果表明，絕大部分檢出物為醇、酯、酮、酸類化合物，其中含量在1%以上的組分有17種，占揮發(fā)油總量的51.56%，通過鑒定，初步明確了其揮發(fā)油的主要成分及含量。

1.5 微量元素及礦物元素

必需微量元素是人體代謝和健康生存不可缺少的，鈣可降低毛細(xì)血管通透性，增加毛細(xì)血管壁的致密度，減少滲出，具有消炎、消腫、抗過敏作用；鋅與人體內(nèi)多種酶、核酸及蛋白質(zhì)的合成密切相關(guān)；鐵是血紅蛋白、肌紅蛋白和某些酶的重要組成部分［30］；銅、錳是許多酶的組分或活化中心；銅、鋅、錳、鐵等元素對(duì)機(jī)體免疫功能均有重要影響；鎂是生物體內(nèi)多種酶的激活劑，對(duì)周圍血管有舒張作用；鉀、鈉對(duì)維持體液的正常滲透壓及酸堿平衡、細(xì)胞的新陳代謝、神經(jīng)肌肉的興奮性均有重要意義［31］。

巨占云等［32］采用主成分分析法對(duì)青海省不同地區(qū)花果期野生橢圓葉花錨藥材中銅、鋅、鐵、鈷、錳、鎳等微量元素含量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，不同地區(qū)野生橢圓葉花錨的微量元素含量差異較大，對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，進(jìn)一步說明了微量元素是決定中藥功效的主要因素，提示微量元素含量和中藥功效之間存在相關(guān)性。

牛迎鳳等［33］采用原子吸收光譜法（空氣－乙炔火焰）測(cè)定了橢圓葉花錨中8種微量元素的含量，并與其他6種藏藥材的含量進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，橢圓葉花錨中的鈣、銅、鐵、錳、鋅、鉀、鎂、鈉含量分別為0.44，0.014，0.16，4.3，2.2，0.014，1.7，0.041 g/kg，7種藏藥材中鉀、鎂、鈉元素的含量普遍較高，橢圓葉花錨中鋅元素的含量最高。

李天才等［34－35］采用原子吸收光譜法對(duì)青海省不同地區(qū)野生橢圓葉花錨中6種微量元素的含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果不同地區(qū)花果期野生橢圓葉花錨中銅、鋅、鐵、錳、鈷、鎳等微量元素含量隨生長地區(qū)不同而有差異，同一元素在不同地區(qū)的含量相差數(shù)倍，表明野生青海橢圓葉花錨中微量元素含量具有地區(qū)性特征；各種微量元素含量與植物生長的土壤、水分、日照、氣候等生態(tài)因子密切相關(guān)；生長周期內(nèi)不同微量元素之間的協(xié)同性和拮抗性相互作用較復(fù)雜。

李佩佩等［36］采用微波消解－電感耦合等離子體－發(fā)射光譜（ICP－OES）法測(cè)定了橢圓葉花錨中21種礦物元素的含量，并與花錨進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，橢圓葉花錨中鈣、鎂含量較高，其鈣含量是花錨的1.6倍；鈹、鎘、鈷、鋰、鉬、鉛、錫、鈦8種元素中鈣和鎂的含量基本接近；其余11種元素在橢圓葉花錨中含量較低。同時(shí)，參考相應(yīng)標(biāo)本采集地的土壤背景值，推測(cè)植物中元素含量與其所處生長環(huán)境有關(guān)。

2 問題與展望

受生長環(huán)境、土壤性質(zhì)、采收時(shí)間、晾曬加工等多方面因素影響，橢圓葉花錨中的成分種類、含量等有所不同，表現(xiàn)為不同產(chǎn)區(qū)，甚至是同一產(chǎn)區(qū)的藥材質(zhì)量存在一定差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，花、葉部位中酮類成分含量明顯高于莖、根部位，提示在藥材采集、干燥、儲(chǔ)存過程中，要避免因花、葉脫落導(dǎo)致藥材質(zhì)量降低的情況發(fā)生；花期后抗肝炎主要活性成分（甲氧基花錨苷、花錨苷、熊果酸等）含量逐漸降低，這與部頒藏藥標(biāo)準(zhǔn)中花期采收的規(guī)定相吻合；隨著海拔的上升，齊墩果酸等成分含量呈上升趨勢(shì)，可能與其生長環(huán)境的土壤、氣候有關(guān)，還需進(jìn)一步研究；野生橢圓葉花錨藥材中酮類成分與栽培品接近，鑒于其在部分藏區(qū)被列為三級(jí)瀕危藏藥材，應(yīng)在可持續(xù)利用的前提下加強(qiáng)橢圓葉花錨人工種植方面的研究，用栽培品代替野生藥材，以便更好地保護(hù)和利用資源。