食品藥品中N－亞硝基二甲胺檢測(cè)方法研究進(jìn)展*

趙艷霞，周維利，馬克民，孫 銅，郭常川，羅學(xué)剛

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南250101；3.成都康弘生物科技有限公司，四川 成都610036）

亞硝胺類化合物是含有N－亞硝基基團(tuán)的亞硝酸鹽與胺類合成的一類化學(xué)物質(zhì)，包括亞硝胺與亞硝酰胺。常見的N－亞硝胺類化合物包括N－亞硝基二甲胺(NDMA)、N－亞硝基二乙胺(NDEA)、N－亞硝基二丙胺、N－亞硝基二丁胺、N－亞硝基二苯胺、N－亞硝基嗎啉、N－亞硝基哌啶、N－亞硝基吡咯烷。相對(duì)分子量大的亞硝胺多為固體，相對(duì)分子質(zhì)量小的亞硝胺如NDMA在常溫下為黃色液體，NDMA、NDEA、N－亞硝基二乙醇胺及某些N－亞硝基氨基酸等均可溶于有機(jī)溶劑及水，大多數(shù)亞硝胺僅溶于有機(jī)溶劑，不溶于水。一般條件下，亞硝胺不易發(fā)生水解、氧化或轉(zhuǎn)為亞甲基等，只有在機(jī)體發(fā)生代謝時(shí)才有致癌能力，且毒性隨烴鏈的延長(zhǎng)而降低。NDMA分子式C2H6N2O，相對(duì)分子質(zhì)量為74.08，又名N－二甲基亞硝胺，黃色液體，可溶于水、乙醇、乙醚、二氯甲烷，由二甲胺與亞硝酸鹽在酸性條件下反應(yīng)生成。NDMA具有很強(qiáng)的肝毒性，人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）M7（R1）指南中明確指出其具有較高的致癌性；根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的致癌物清單[1]，NDMA屬2A類致癌物[2]，廣泛存在于各種腌制、熏烤肉制品和熱加工食品中，長(zhǎng)期食用該類食品會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生潛在危害。自2018年以來，國(guó)內(nèi)外多家藥品生產(chǎn)企業(yè)曾因纈沙坦類降壓藥及消化系統(tǒng)藥雷尼替丁中檢出超限NDMA而啟動(dòng)召回。在此，對(duì)食品藥品中NDMA的由來、現(xiàn)行檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述。

1 NDMA的由來

1.1 食品

經(jīng)腌漬、煙熏、焙烤等工藝加工的肉類產(chǎn)品、腌制菜等，使用硝酸鹽和亞硝酸鹽作為防腐劑和發(fā)色劑，在微生物的作用下，蛋白質(zhì)、氨基酸降解產(chǎn)生胺類物質(zhì)，適宜條件下，亞硝酸鹽與胺類物質(zhì)發(fā)生亞硝基化作用，會(huì)產(chǎn)生具有強(qiáng)致癌性的N－亞硝胺類化合物。我國(guó)部分地區(qū)的食道癌和胃癌發(fā)病率較高，多與當(dāng)?shù)鼐用袷秤秒缰撇思盁熝獾仁称酚嘘P(guān)[3]。

1.2 藥品

根據(jù)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《化學(xué)藥物中亞硝胺類雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（征求意見稿）》，生產(chǎn)工藝、降解途徑、污染引入等均是亞硝胺類雜質(zhì)產(chǎn)生的原因。在一定條件下，胺類化合物尤其是仲胺，可與亞硝酸鈉（NaNO2）或其他亞硝化試劑反應(yīng)產(chǎn)生亞硝胺類雜質(zhì)。在制劑的生產(chǎn)或儲(chǔ)存過程中，也可能產(chǎn)生亞硝胺類雜質(zhì)；原料藥生產(chǎn)過程中使用了被亞硝胺類雜質(zhì)污染的物料（包括起始物料、中間體、溶劑、試劑、催化劑等），回收的物料可能帶來亞硝胺類雜質(zhì)污染的風(fēng)險(xiǎn)；此外，某些藥物如雷尼替丁本身也會(huì)降解產(chǎn)生亞硝胺類雜質(zhì)。

2 NDMA的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)

2.1 食品

食品中NDMA雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法執(zhí)行《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中N－亞硝胺類化合物的測(cè)定》GB5009.26－2016，包括氣相色譜－質(zhì)譜(GC－MS)法和氣相色譜－熱能分析儀(GC－TEA)法。

2.2 藥品

纈沙坦、替米沙坦及厄貝沙坦等沙坦類制劑、雷尼替丁制劑中NDMA雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法，目前僅有中國(guó)食品藥品檢定研究院推薦的方法。如鹽酸雷尼替丁和纈沙坦分別參考中國(guó)食品藥品檢定研究院發(fā)布的《關(guān)于開展雷尼替丁中N－亞硝基二甲胺檢驗(yàn)工作的通知》中檢化藥函〔2019〕710號(hào)文件和《關(guān)于纈沙坦國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)修訂稿的公示（第二次）》中收載的方法。

3 NDMA的檢測(cè)方法

3.1 超臨界流體色譜(SFC)法

SFC是一種類似正相色譜的分離技術(shù)，是高效液相色譜（HPLC）法和氣相色譜(GC)法的重要補(bǔ)充技術(shù)，以超臨界二氧化碳流體作為流動(dòng)相，可分析多數(shù)不能被GC汽化的不揮發(fā)性物質(zhì)和不能被HPLC分離的無紫外吸收的物質(zhì)，具有高效快速、靈敏度高、綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于食品和藥品的檢測(cè)。SCHMIDTSDORFF等[4]采用SFC法同時(shí)測(cè)定ppb級(jí)別沙坦類降壓藥物中的痕量亞硝胺雜質(zhì)，根據(jù)ICH Q2（R1），該分析方法可用于限度測(cè)定，并滿足歐洲藥品管理局（EMA）和美國(guó)食品藥物管理局（FDA）對(duì)藥物物質(zhì)和基因毒性雜質(zhì)規(guī)定的限值；此外，還適用于其他可能受到亞硝胺污染的藥物的檢測(cè)。

3.2 離子色譜(IC)法

離子色譜法檢測(cè)技術(shù)的主要原理是離子交換，能有效檢測(cè)食品藥品中多種物質(zhì)的含量，具有較高的靈敏性及準(zhǔn)確性，尤其在食品檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。JI等[5]建立了二維離子色譜法快速測(cè)定飲用處理水中痕量亞硝胺類物質(zhì)的含量，消除了干擾樣品的基體離子，6種亞硝胺的檢測(cè)限可達(dá)0.035～0.100 μg／L，回收率為91.7%～109.8%，較常規(guī)一維離子色譜法靈敏度好，操作簡(jiǎn)單，選擇性高，檢測(cè)限低，可實(shí)現(xiàn)NDMA的常規(guī)檢測(cè)。

3.3 HPLC法

HPLC法具有分離效能高、靈敏度高、分析速度快的特點(diǎn)，是食品藥品檢驗(yàn)中最普遍、最常用的方法，常用于藥品中基因毒性雜質(zhì)的檢測(cè)[6]。IAMMARINO等[7]采用固相萃取(SPE)法和HPLC耦合紫外二極管陣列檢測(cè)器(DAD)法，測(cè)定了鮮肉和肉制品中10種N－亞硝胺類化合物的含量，該方法操作簡(jiǎn)便，靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均較高。張建斌等[8]采用超聲波提取－SPE－HPLC法利用紫外檢測(cè)器測(cè)定了肉制品中9種N－亞硝胺的含量，利用回收率為65.80%～93.20%，精密度試驗(yàn)結(jié)果的RSD為1.19%～3.42%，表明該方法操作簡(jiǎn)單快速，靈敏度高，重復(fù)性好。KODAMATANI等[9]建立了HPLC－化學(xué)發(fā)光檢測(cè)方法，采用HPLC法分離NDMA，利用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)進(jìn)行飲用水中的NDMA長(zhǎng)期、快速監(jiān)測(cè)，檢測(cè)限為0.2 ng／L，只需添加抗壞血酸溶液來消除殘余氯，并通過Oasis MAX固相萃取盒，樣品體積小于2 mL，每個(gè)樣品的完整分析時(shí)間短于15 min。范婷婷等[10]采用HPLC法測(cè)定纈沙坦中NDMA的含量，檢測(cè)限為0.001 μg／mL，定量限為0.003 μg／mL，線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度和精密度均較高，前處理簡(jiǎn)單，可用于纈沙坦中NDMA的定量測(cè)定。

3.4 液相色譜－質(zhì)譜（LC－MS）法

LC－MS法是一種集質(zhì)量分離、結(jié)構(gòu)鑒定、定性定量分析等于一體的檢測(cè)技術(shù)，具有自動(dòng)化程度高、準(zhǔn)確度高、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適用于復(fù)雜基質(zhì)樣品中各微量物質(zhì)的確證。簡(jiǎn)龍海等[11]建立了測(cè)定食品中NDMA含量的液相色譜－大氣壓化學(xué)離子化－串聯(lián)質(zhì)譜（LCAPCI－MS／MS）法，加入同位素內(nèi)標(biāo)后，采用改進(jìn)的水蒸氣蒸餾法進(jìn)行處理，餾出液用二氯甲烷萃取，萃取液加水1 mL后減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，測(cè)定濃縮液，結(jié)果NDMA質(zhì)量濃度在5～500 ng／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。吳翠華等[12]建立了測(cè)定腌制肉制品中NDMA含量的LC－MS法，在優(yōu)化的色譜及質(zhì)譜條件下，采用電噴霧電離(ESI)正離子模式電離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式掃描測(cè)定，結(jié)果NDMA在2.0～50.0 μg／L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）為0.999 8，可用于測(cè)定腌制肉制品中NDMA的含量。張偉偉等[13]建立了水蒸氣蒸餾分離－HPLCMS／MS法測(cè)定食品中NDMA的含量，采用大氣壓化學(xué)離子源正離子模式和MRM模式，結(jié)果回收率為85.4%～101.0%，RSD小于11%，表明該方法靈敏度高，測(cè)定下限低，能滿足肉、魚制品等復(fù)雜基質(zhì)中NDMA的定性和定量分析。楊陽等[14]采用LC－MS法測(cè)定水中8種亞硝胺類化合物含量，采用內(nèi)標(biāo)法定量，進(jìn)樣方式采用固相萃取和直接進(jìn)樣，檢測(cè)結(jié)果顯示，SPE法檢測(cè)限更接近環(huán)境中污染物的濃度水平，快速簡(jiǎn)便，線性關(guān)系良好，具有較高準(zhǔn)確度和精密度，重復(fù)性好。SUN等[15]建立了一種同時(shí)測(cè)定吉非替尼中4種基因毒性雜質(zhì)的HPLC－MS／MS法，采用ESI正離子模式電離，結(jié)果4種基因毒性雜質(zhì)質(zhì)量濃度在0.6～96.0 μg／L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，方法簡(jiǎn)便可靠，可用于吉非替尼中4種基因毒性雜質(zhì)含量的測(cè)定。

3.5 GC法

夏日耀等[16]建立了GC法，采用氫火焰檢測(cè)器測(cè)定50種腌制魚干中9種N－亞硝胺類化合物的含量，結(jié)果檢測(cè)限和定量限范圍分別為0.05～0.29 μg／mL和0.18～0.95 μg／mL，方法操作簡(jiǎn)單，且NDMA檢測(cè)限低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量標(biāo)準(zhǔn)，可實(shí)現(xiàn)一般實(shí)驗(yàn)室對(duì)N－亞硝胺化合物的安全性檢測(cè)。張建斌等[8]建立了超聲波提取－固相萃?。瓪庀嗌V－氮磷檢測(cè)方法，對(duì)肉制品中9種N－亞硝胺類化合物進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果回收率為66.80%～93.89%，精密度試驗(yàn)結(jié)果的RSD為1.39%～3.07%，方法操作簡(jiǎn)單，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，靈敏度高，適用于同時(shí)測(cè)定肉及肉糜制品中9種N－亞硝胺類化合物的含量。李美萍等[17]采用固相萃?。瓪庀嗌V高分辨質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，同時(shí)優(yōu)化儀器檢測(cè)條件及固相萃取條件，對(duì)飲用水中16種痕量亞硝胺進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果16種物質(zhì) 的 線 性 范 圍 為0.2～500 μg／L，r為0.994 3～0.999 7，檢測(cè)限為0.05～0.50 ng／L，遠(yuǎn)低于目前各國(guó)的限量，方法靈敏度高，選擇性好，準(zhǔn)確度高，適用于水中痕量亞硝胺的確證檢測(cè)。

3.6 GC－TEA法

熱能分析儀能特異性催化裂解N－亞硝胺類化合物生成一氧化氮（NO）基團(tuán)，與臭氧反應(yīng)后，采用光電倍增管檢測(cè)產(chǎn)生的近紅外光。熱能分析儀是N－亞硝胺類化合物的特異性檢測(cè)器，通過結(jié)合氣相色譜儀對(duì)硝胺進(jìn)行分析，前處理方法簡(jiǎn)單，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，靈敏度高。咸瑞卿等[18]建立了GC－TEA法檢測(cè)纈沙坦原料藥及其制劑中NDMA的含量，采用毛細(xì)管氣相色譜柱（30 m×0.32 mm，0.5 μm），程序升溫，不分流進(jìn)樣。結(jié)果顯示，NDMA的質(zhì)量濃度在10～1 000 ng／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r＝1.000，n＝8），檢測(cè)下限為3 ng／mL。對(duì)13批樣品進(jìn)行了測(cè)定，其NDMA含量范圍為0～87.09×10－6。

3.7 GC－MS法

GC－MS法分析取樣量少，靈敏度高，廣泛用于食品藥品的檢驗(yàn)檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。馮秀娟等[19]建立了測(cè)定肉制品中NDMA含量的GC－三重四極桿質(zhì)譜法，通過QuEChERS法提取樣品，采用MRM模式掃描測(cè)定，結(jié)果的RSD為4.3%～6.2%，r為0.999 5。結(jié)果顯示，15份樣品中有5份樣品檢出NDMA，含量均低于國(guó)家限量值（3.0 μg／kg），滿足要求。喬玲等[20]將樣品經(jīng)QuEChERS法處理，極大簡(jiǎn)化了前處理步驟，采用GC－MS法對(duì)15批次肉類制品中NDMA含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果NDMA在生肉制品中均未檢出，而在熏肉類制品中有5批次樣品檢出，且含量均低于國(guó)家限值。朱萌萌等[21]將肉制品樣品通過蒸餾萃取后，冷凍去脂凈化，采用MRM模式監(jiān)測(cè)，以外標(biāo)法定量，利用GC－MS技術(shù)檢測(cè)肉制品中10種揮發(fā)性N－亞硝胺類化合物的殘留量。結(jié)果r均大于0.99，檢測(cè)限和定量限分別為0.01～0.02 μg／kg和0.04～0.07 μg／kg，且步驟簡(jiǎn)單，靈敏度高。高蕙文等[22]在QuEChERS法的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，將樣品萃取、濃縮后采用GC－MS／MS法測(cè)定動(dòng)物性食品中9種N－亞硝胺類化合物含量，線性關(guān)系良好，檢測(cè)限為0.4 μg／kg，步驟簡(jiǎn)單，檢測(cè)限低，適于大批量樣品的檢測(cè)。張鳳艷等[23]采用GC－MS／MS測(cè)定水產(chǎn)品中的NDMA含量，改進(jìn)樣品處理方法，低溫大體積進(jìn)樣、MRM模式監(jiān)測(cè)、外標(biāo)法定量，線性關(guān)系良好，r為0.998 8，方法前處理步驟少，時(shí)間短，準(zhǔn)確性高，可滿足水產(chǎn)品中NDMA含量的檢測(cè)要求。ROASA等[24]建立了頂空固相微萃取（HS－SPME）－GC－MS法檢測(cè)肉類樣品中9個(gè)揮發(fā)性亞硝胺的含量，結(jié)果表明該方法具有足夠的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度。SUN等[25]同樣采用HS－SEME－GC－MS法，測(cè)定生紅肉中9種揮發(fā)性N－亞硝胺化合物的含量，方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確。楊光等[26]采用QuEChERS－GC－MS法測(cè)定香腸和火腿腸制品中13種N－亞硝胺類化合物的含量，采用MRM模式監(jiān)測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量，結(jié)果顯示，線性關(guān)系良好，操作簡(jiǎn)單，污染少，靈敏度高，重復(fù)性好，可滿足批量肉制品中13種N－亞硝胺類化合物快速檢測(cè)的需要。李登昆等[27]建立了測(cè)定飲用水中3種揮發(fā)性N－亞硝胺類化合物的固相萃取大體積程序升溫進(jìn)樣GC－MS法，MRM模式監(jiān)測(cè)、外標(biāo)法定量，結(jié)果線性關(guān)系良好，方法靈敏準(zhǔn)確，簡(jiǎn)單可靠。沈朝燁等[28]建立了同時(shí)測(cè)定水中9種N－亞硝胺類化合物的SPE－GC－MS法，結(jié)果線性關(guān)系良好，方法檢測(cè)限低于4 ng／L，靈敏度高，準(zhǔn)確度好。

吳兆偉等[29]采用GC－MS法測(cè)定纈沙坦中NDMA的含量，采用DB－WAXUI石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm，0.25 μm），以內(nèi)標(biāo)法定量，結(jié)果線性范圍寬，線性關(guān)系良好，平均回收率為103.2%，方法檢測(cè)限為1 ng／mL，方法步驟簡(jiǎn)單，靈敏度和準(zhǔn)確性高，可較好地滿足纈沙坦原料藥生產(chǎn)中遺傳毒性雜質(zhì)NDMA的含量測(cè)定。姜俊等[30]采用HS－GC－LC法檢測(cè)對(duì)厄貝沙坦原料藥中遺傳毒性雜質(zhì)NDMA和NDEA進(jìn)行準(zhǔn)確定量，通過程序升溫分離，電子轟擊電離源（EI）電離，離子監(jiān)測(cè)（SIM）模式檢測(cè)，方法操作簡(jiǎn)單、數(shù)據(jù)可靠，可有效檢測(cè)沙坦類藥物中相關(guān)遺傳毒性雜質(zhì)的含量。

3.8 其他方法

除了常規(guī)檢測(cè)方法外，還有表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）法、分子印跡技術(shù)等新型檢測(cè)方法。LIN等[31]采用SERS法檢測(cè)NDMA和NDEA的含量，研究中利用聚焦離子束（FIB）技術(shù)制作了金納米棒（Au NRs）和SERS襯底，并用1，2－乙炔二硫醇對(duì)其進(jìn)行修飾，離子體共振產(chǎn)生高能發(fā)光激發(fā)背景信號(hào)；金納米棒因具有較強(qiáng)的兩性離子親水性，可在水溶液中捕獲極性小分子NDMA和NDEA。結(jié)果表明，NDMA和NDEA檢測(cè)限均可達(dá)10－8mol／L。CETó等[32]利用分子印跡聚合物電化學(xué)法檢測(cè)飲用水和再生水樣中NDMA的含量，基于分子印跡聚合物（MIP）作為識(shí)別元件，結(jié)合玻碳電極（GCE）作為電化學(xué)傳感器，在NDMA檢測(cè)中，MIP比非印跡聚合物（NIP）的靈敏度高出1個(gè)數(shù)量級(jí)。

4 結(jié)語

SFC法高效快速，靈敏度高，綠色環(huán)保；離子色譜法具有較高的靈敏性及準(zhǔn)確性，尤其在食品檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛；HPLC法前處理簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度和精密度較高，普適性好；GC法靈敏度、選擇性較高，分析速度快，應(yīng)用范圍較廣；GC－TEA法前處理簡(jiǎn)單，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，靈敏度高；LC－MS法、LC－MS／MS法、GC－MS法和GC－MS／MS法操作簡(jiǎn)便，快速高效，回收率、靈敏度、準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，不僅可提高檢測(cè)效率，還可確保測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，可滿足實(shí)驗(yàn)室大量樣品的日常檢測(cè)需求。隨著新的檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)和分析儀器的日新月異，未來NDMA含量檢測(cè)方法將朝著靈敏度更高、穩(wěn)定性更好、定性能力更強(qiáng)的方向發(fā)展。