棉花籽水提物對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的影響

李 瑤，吳秋雪，張 宇，張文天，王文宇，宋國威，張偉偉,2

(1.齊齊哈爾大學 生命科學與農(nóng)林學院，中國 齊齊哈爾 161000； 2.抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室，中國 齊齊哈爾 161000)

高等脊椎動物出生后肌肉的生長主要依賴骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖分化導致的肌纖維長度的增加和周徑的增大。因此，肌纖維的數(shù)量對肉的產(chǎn)量和品質(zhì)有重要影響，研究肌肉的增殖分化情況對于改良肉的品質(zhì)具有重要的指導意義。目前，關(guān)于全棉籽和棉粕的研究主要集中在代替蛋白質(zhì)飼料上，關(guān)于全棉籽中有效成分及作用機制的研究較少，本試驗研究棉花籽水提物對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的影響，可為棉花籽的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

骨骼肌作為動物機體的重要組成部分，它的生長發(fā)育是生物學研究的重要內(nèi)容[1]。研究表明多種因素可調(diào)控骨骼肌衛(wèi)星細胞的生長發(fā)育。Chen等人發(fā)現(xiàn)骨骼肌主要由有絲分裂后的多核肌纖維組成。肌生成是多步驟過程，包括骨骼肌衛(wèi)星細胞的激活、增殖、分化和多核肌纖維的形成[2]。王男等人發(fā)現(xiàn)當骨骼肌生長和再生需要時，干細胞(骨骼肌衛(wèi)星細胞)就會被激活，然后開始增殖和分化形成肌纖維，從而形成肌肉組織[3]。

棉花籽是棉花(屬于被子植物錦葵目、錦葵科、棉族、棉屬)作物的籽實，具有高能、高蛋白、高纖維的特殊營養(yǎng)特點，是一種既能補充蛋白、能量，又能提供纖維的高營養(yǎng)飼料[4]。佟建明等人用添加高含量棉籽粕的日糧飼喂肉仔雞，結(jié)果顯示棉籽粕日糧組和大豆粕日糧組的肉雞成活率差異不顯著，表明棉籽粕可作為肉雞飼料中主要的蛋白質(zhì)來源[5]；周聯(lián)高等人用3%和6%棉籽粕代替豆粕飼喂櫻桃谷鴨，對其屠宰性能沒有顯著影響[6]；吐爾遜帕夏等人的試驗結(jié)果表明，用50%和100%的棉籽殼替代蘆葦，11月齡羔羊胴體質(zhì)量和凈肉量顯著提高[7]。這些研究結(jié)果說明棉花籽可以作為食用蛋白質(zhì)飼料喂食動物，可使動物質(zhì)量和肉量提高，進而說明棉花籽的有效成分可能存在促進細胞增殖分化的作用。本文選擇牛骨骼肌衛(wèi)星細胞為研究對象，考察棉花籽水提物對其增殖的影響，旨在為棉花籽的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所需棉花籽產(chǎn)品購于亳州市知樂園農(nóng)產(chǎn)品銷售有限責任公司；棉酚標準品購于信陽市中檢計量生物科技有限公司(中檢計量)；CCK-8試劑盒購于上海優(yōu)寧維科技股份有限公司；蛋白提取試劑盒購自碧云天生物公司；CCNB1，CCND1和β-actin一抗購自Abcam公司；羊抗兔二抗IRDye800CW購自美國LI-COR公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 棉花籽水提物制備 分別稱取4份1 g粉碎后的棉花籽，加入20 mL水，分別浸泡10，15，20，25 h后，煮沸于水浴鍋中，煮沸時間為4 h(期間根據(jù)情況加水)，經(jīng)過濾裝置收集上清液，溶液終體積定容為20 mL，然后配置成質(zhì)量濃度為20，40，80及160 mg·L-1的棉花籽水提物，最后4 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.2 HPLC-MS檢測棉花籽水提取物中棉酚含量 利用高效液相色譜法檢測上述制備的棉花籽水提物是否含有棉酚。條件為：色譜柱 Intertsil ODS-2(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.2%磷酸(體積比為 85∶15)溶液，流速 1.0 mL·min-1，紫外檢測波長 235 nm，進樣量 20 μL，柱溫 25 ℃。

1.2.3 牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的制備及分化 牛骨骼肌衛(wèi)星細胞(MDSCs)由本實驗室制備并鑒定[8]。在生長培養(yǎng)基(高糖DMEM+20%胎牛血清+10%馬血清+5%青/鏈霉素) ，37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)牛MDSCs細胞，當細胞匯合度達到80%時，消化細胞以105個·孔-1接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，加入生長培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，當細胞匯合達85%后，更換為2%分化培養(yǎng)基(DMEM高糖培養(yǎng)液+2%馬血清)，在分化時間分別為0 h (MDSC-P)，3 d(MDSC-D1)和5 d (MDSC-D2)時觀察細胞形態(tài)變化并拍照。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞活力 將對數(shù)生長期的牛骨骼肌衛(wèi)星細胞接種到96孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入終質(zhì)量濃度為0，20，40，80，160 mg·L-1的不同浸泡時間的棉花籽水提物，每個濃度3個孔，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入10 μL CCK-8檢驗試劑作用細胞2 h，酶標儀450 nm波長處測定其光吸收值，檢測細胞活力。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 顯微鏡下觀察細胞形態(tài) 將對數(shù)生長期的牛骨骼肌衛(wèi)星細胞接種到6孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入終質(zhì)量濃度為0和20 mg·L-1的不同浸泡時間的棉花籽水提物，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.2.6 Western Blot檢測牛骨骼肌細胞增殖相關(guān)基因表達 將對數(shù)生長期的牛骨骼肌衛(wèi)星細胞接種到6孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入終質(zhì)量濃度為0和20 mg·L-1的不同浸泡時間的棉花籽水提物，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取蛋白質(zhì)，進行SDS-PAGE電泳。利用Bio-Rad電轉(zhuǎn)印儀將蛋白質(zhì)濕轉(zhuǎn)到0.45 μm PVDF膜上，使用Odyssey封閉液室溫封閉2 h，一抗CCNB1(ab191441, abcam)，CCND1 (ab103924, abcam)，β-actin (ab22555, abcam)按照1∶500稀釋，4 ℃孵育過夜，次日PBST洗膜，二抗室溫孵育1 h，在Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)中進行掃描檢測。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)通過SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分化處理后，以平均數(shù)±標準誤差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。利用GraphPad Prism 5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花籽水提取的HPLC-MS分析

根據(jù)液相色譜圖(圖1)可知，分別浸泡10，15，20，25 h的棉花籽水提物檢測不到棉花籽中的游離棉酚，說明棉花籽水提物在煮沸之后可以去除游離棉酚。

(a)和(b)分別為50，100 mg·L-1的棉酚標準品；(c),(d),(e)及(f)分別為浸泡10，15，20，25 h的棉花籽水提物。圖1 棉花籽水提物中棉酚檢測結(jié)果Fig. 1 Detection results of gossypol in cotton seed water extract

2.2 牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的分化

培養(yǎng)的MDSCs在生長培養(yǎng)基中未見肌管出現(xiàn)(圖2，MDSC-P)，在2%分化培養(yǎng)基作用下誘導分化3 d和5 d，細胞之間相互融合形成肌管，肌管呈光滑長條形，肌管之間多呈平行排列(圖2，MDSC-D1)。隨著誘導分化時間的延長，數(shù)量眾多的肌管自發(fā)融合為更粗的肌管(圖2，MDSC-D2)，說明所用細胞符合實驗的要求，能進行下一步實驗。

圖2 MDSCs 分化后細胞形態(tài)(10×10)Fig. 2 Morphology characterization of MDSCs(10×10)

2.3 棉花籽水提取對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞活力的影響

浸泡10，15，20，25 h的棉花籽水提物對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞活力的影響見圖3。由圖可知，與對照組相比，浸泡10 h和15 h的棉花籽水提物在20 mg·L-1時可提高細胞活力(P<0.05)，之后隨著棉花籽水提物濃度的增大細胞活力呈下降趨勢。浸泡20 h和25 h的棉花籽水提物均可提高細胞活力，其中20 mg·L-1時效果最顯著(P<0.05)。

圖3 棉花籽水提取對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞活力的影響 Fig. 3 Effect of cotton seed water extraction on the viability of bovine skeletal muscle satellite cells

2.4 棉花籽水提取對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的影響

浸泡10，15，20，25 h的棉花籽水提物對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的影響見圖4，由圖可知，與對照組相比，20 mg·L-1的棉花籽水提物可增加牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的數(shù)量，細胞形態(tài)未見明顯的變化。

圖4 棉花籽水提取對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的影響(10×10)Fig. 4 Effect of cotton seed water extraction on bovine skeletal muscle satellite cells(10×10)

2.5 棉花籽水提取對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞周期相關(guān)蛋白表達的影響

浸泡不同時間的20 mg·L-1棉花籽水提物對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞周期相關(guān)蛋白表達的影響見圖5，由圖可知，與對照組相比，20 mg·L-1的棉花籽水提物可促進牛骨骼肌衛(wèi)星細胞周期相關(guān)CCND1和CCNB1蛋白的表達，其中浸泡20 h的棉花籽水提物效果最明顯，可使CCND1蛋白表達提高1.31倍(P<0.05)，CCNB1蛋白表達升高1.47倍(P<0.05)。

圖5 棉花籽水提取對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞周期相關(guān)蛋白表達的影響Fig. 5 Effect of cotton seed water extraction on the expression of cell cycle-related proteins in bovine skeletal muscle satellite cells

3 討論

棉花籽是棉花加工過程中的副產(chǎn)品，含有大量纖維和一定的粗蛋白、粗脂肪以及少量的五碳聚糖、木質(zhì)素等物質(zhì)[9]。在國外，全棉籽作為一種高能、高粗蛋白、高纖維含量的飼料已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于奶牛生產(chǎn)[10]，但是棉花籽水提物對細胞有何影響尚未見報道。然而，在動物生產(chǎn)系統(tǒng)中使用棉籽副產(chǎn)品有一個很大的限制因素，即棉酚的存在，棉酚是一種有毒化合物，存在于整個棉花植株中[11]。所以本試驗采用將棉花籽水提物加熱煮沸的方法去除棉酚，經(jīng)HPLC-MS檢測顯示煮沸后的棉花籽水提物中已檢測不到游離棉酚，說明此方法能夠有效地去除游離棉酚，同時棉花籽水煮后固體部分可以用于動物飼料。本試驗通過CCK-8法檢測了水提物作用48 h后的細胞活力，結(jié)果顯示，棉花籽水提物可以提高細胞活力，且對細胞形態(tài)沒有影響。細胞活力的升高依賴于細胞周期的正常運轉(zhuǎn)，各種周期蛋白在此過程中發(fā)揮重要作用。周期蛋白表達水平上調(diào)，可以促進細胞增殖分化[12-17]。本試驗結(jié)果顯示棉花籽水提物作用牛骨骼肌衛(wèi)星細胞后CCND1和CCNB1蛋白表達水平升高，表明棉花籽水提物可以使牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖。異槲皮素苷[18]、阿魏酸[19]、胸腺嘧啶核苷[20]、熊果苷[21]也均為棉花籽的成分，并且也具有促進細胞增殖分化的作用，但棉花籽水提物中是否含有這些物質(zhì)、棉花籽水提物成分如何進入細胞發(fā)揮作用等問題還有待進一步研究。

4 結(jié)論

經(jīng)不同時間處理后棉花籽水提物中未檢測到棉酚，浸泡20 h和25 h的棉花籽水提物均可提高細胞活力，其中20 mg·L-1的棉花籽水提物效果最顯著；20 mg·L-1的棉花籽水提物浸泡20 h能促進牛骨骼肌衛(wèi)星細胞周期相關(guān)CCND1和CCNB1蛋白的表達。結(jié)果表明，棉花籽水提物可以促進牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖，此研究結(jié)果可為棉花籽的開發(fā)應(yīng)用提供實驗依據(jù)。