ChIP-seq技術分析突變IHH-GLI1信號傳導通路對下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響

王 挺，沈 陸，魏慕筠，周 偉，李 沫，賀 林，秦勝營

(上海交通大學生命科學技術學院Bio-X研究院，中國 上海 200030)

A1型短指癥(Brachydactyly type A1，BDA1)是一種罕見的遺傳畸形，主要表現(xiàn)為手指和腳趾的中骨短小或缺失。研究發(fā)現(xiàn)，印度刺猬(Indian hedgehog，IHH)基因與BDA1密切相關，該基因上的雜合錯義突變會導致軟骨發(fā)育不全(從而導致BDA1發(fā)病)[1]。攜帶IHH基因E95K突變的BDA1模型小鼠具有與人類患者一樣的個體矮小和典型的A1型短指/趾癥表型，表現(xiàn)為第二至第四指中指節(jié)嚴重縮短，第五指中指節(jié)缺失[2]。既往研究認為E95K突變導致了IHH突變蛋白信號能力下降，使信號作用距離顯著增加，削弱了其與受體Patched 1(PTCH1)和Huntingtin interacting protein 1(HIP1)的相互作用，從而影響軟骨細胞的增殖和分化并最終導致骨骼生長減少[3]。IHH主要由軟骨細胞表達，該蛋白與其受體PTCH1或其他因子相互作用后通過平滑蛋白(SMO)轉(zhuǎn)導信號，最終作用于含鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子GLI(GLI 1～3)調(diào)節(jié)下游基因的表達。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子GLI1是Hedgehog(HH)信號通路的中央激活因子[4,5]。近年來，HH通路中GLI激活劑能夠直接結(jié)合某些下游靶基因的重大發(fā)現(xiàn)對HH/GLI下游調(diào)節(jié)機制的理解提供了新見解[6]。最近的研究表明，IHH/GLI信號傳導到GLI的梯度活動可以協(xié)調(diào)發(fā)育的模式，GLI轉(zhuǎn)錄因子接收IHH信號的強弱則決定了不同的轉(zhuǎn)錄輸出[7]?；诨蛐酒夹g的研究表明BDA1相關的突變IHH信號通路會改變GLI介導的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式，進而導致了BDA1的發(fā)生[8]。然而目前尚未有研究從全基因組范圍內(nèi)精細分析突變IHH-GLI1信號下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控，而這對于了解BDA1病理機制和靶向治療是必不可少的。

近年來，染色質(zhì)免疫共沉淀測序技術(Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing， ChIP-seq)在轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的靶基因鑒定中的應用越來越多[9]。相對于基因芯片技術，ChIP-seq技術具有高分辨率和高精準度的優(yōu)勢，能夠捕捉到未知的序列，發(fā)現(xiàn)和尋找到新的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。研究人員可將獲得的與目的蛋白結(jié)合的數(shù)百萬序列標簽準確地定位到全基因組上，從而全面、準確地鑒定與蛋白質(zhì)結(jié)合的基因片段信息。該技術現(xiàn)已被廣泛應用于疾病的診斷以及疾病治療靶點的探究中[10]。目前對IHH信號介導的BDA1發(fā)病機制和有效治療靶點仍不清楚，因此，本研究基于ChIP-seq技術從基因組范圍內(nèi)全面地對突變IHH信號下GLI1介導的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控進行分析。本研究向小鼠胚胎來源的間充質(zhì)干細胞系C3H10T1/2中加入人IHH-N野生型重組蛋白(WT)和突變型蛋白(MT, p.E95K)以激活IHH信號通路。IHH蛋白作用2天后，收集并裂解細胞，使用GLI1抗體進行染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)實驗并將DNA產(chǎn)物用于ChIP-seq分析。通過生物信息學分析對GLI1蛋白結(jié)合的靶基因進行注釋和定位，進一步挖掘兩組間不同的GLI1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基因，并對這些基因進行功能注釋和KEGG通路分析；同時將ChIP-seq分析結(jié)果在基因芯片數(shù)據(jù)中進行驗證，以構(gòu)建IHH/GLI1下游通路網(wǎng)絡。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細胞 重組人IHH蛋白的大腸桿菌BL21(DE3)表達菌株，包括表達野生型蛋白(氨基酸殘基28-202)和突變蛋白(E95K)兩種菌株，構(gòu)建過程見文獻[3]，由本研究院保存。小鼠胚胎來源的間充質(zhì)干細胞株(C3H10T1/2)購自ATCC。

1.1.2 主要試劑和儀器 MEM/EBSS培養(yǎng)基、 胎牛血清(FBS)、蛋白酶抑制劑和青霉素/鏈霉素雙抗購自Gibco公司； GenomePlex?全基因組擴增試劑盒購自Sigma-Aldrich公司； EZ-ChIP 試劑盒、0.22 μm 濾膜、GLI1多克隆抗體均購自Millipore公司；IHH 抗體(Santa Cruz)； GST 標簽純化裝置(GE-Healthcare)；蛋白 G 瓊脂糖(Pierce)、RNA酶和蛋白K酶、TRIZOLTM試劑均購自Invitrogen；PCR 純化試劑盒 (Qiagen)；NEBNext DNA 超快速文庫制備試劑盒 (NEB)； 轉(zhuǎn)錄子高保真cDNA合成試劑盒、SYBR Green (Rox) 試劑盒購自Roche公司； Illumina測序試劑和用品均購自諾唯贊生物科技有限公司； ViiATM7實時熒光PCR 儀(Applied Biosystems)；安捷倫2000生物分析儀以及芯片分析所有試劑、儀器均來自安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 IHH蛋白表達和純化 將重組人IHH-N蛋白的大腸桿菌BL21(DE3)表達菌株(包括野生型蛋白氨基酸殘基28-202；突變蛋白E95K)涂布平板后，選擇單克隆菌落，并在5 mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中于37 ℃孵育過夜。然后將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到含有氨芐青霉素的400 mL 2×YT液體培養(yǎng)基中，并在37 ℃下孵育4 h。當誘導菌株的OD值達到0.6時，添加0.2 mmol·L-1IPTG在32 ℃條件下誘導蛋白表達5 h。在4 ℃下以8 000×g離心15 min，加入含有蛋白酶抑制劑的200 mmol·L-1氯化鈉和20 mmol·L-1Tris-鹽酸(pH 7.5)溶液重懸細菌超聲破碎提取蛋白。在4 ℃下以25 000×g離心30 min后，收集上清液。 然后根據(jù)GST純化裝置說明書純化蛋白質(zhì)，使用凝血酶裂解GST標簽。純化的IHH-N蛋白通過Western blot進行驗證，并用0.22 μm濾膜進行過濾。

1.2.2 C3H10T1/2細胞中IHH信號通路的激活 C3H10T1/2細胞的IHH激活按照文獻[5]的方法進行誘導。將C3H10T1/2細胞培養(yǎng)在添加MEM/EBSS完全培養(yǎng)基(包含MEM/EBSS基礎培養(yǎng)基、10%胎牛血清(FBS)和2%青霉素/鏈霉素)的12孔板中，在37 ℃(5%CO2)的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長到每孔5×104時，將WT或MT IHH-N(E95K)添加到生長培養(yǎng)基中(最終IHH-N蛋白為1×=750 nmol·L-1)。 在37 ℃(5%CO2)下進一步孵育48 h后，收獲細胞用于后續(xù)的進一步分析。 通過實時定量PCR檢測IHH信號通路標志物分子Gli1，Ptch1和Ihh的表達。所有誘導測定均一式三份進行。

1.2.3 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)樣品的準備 使用EZ-ChIP試劑盒進行染色質(zhì)免疫沉淀。分離剪切的交聯(lián)染色質(zhì)后，將每個樣品(1×105個細胞)與5 μg多克隆GLI1抗體(或匹配的IgG對照)孵育過夜。然后將60 μL Protein G磁珠添加到每個樣品中，并在4 ℃旋轉(zhuǎn)孵育1 h。孵育后，通過短暫離心將Protein G磁珠沉淀，并根據(jù)說明書進行洗滌。將沉淀物與100 μL稀釋液(10 μL 20%SDS，20 μL 1 mol·L-1NaHC03和70 μL無菌蒸餾水)在室溫下孵育15 min，收集上清液。向每個樣品收集液(總計200 μL)中加入8 μL的5 mol·L-1NaCl，并在65 ℃下溫育過夜，以逆轉(zhuǎn)DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)。第二天，所有樣本依次用RNA酶A和蛋白酶K處理。酶處理后的樣本中加入酚氯仿抽提DNA，使用乙醇沉淀法純化 DNA, 添加TE 試劑溶解DNA 后進行測序文庫的構(gòu)建。

1.2.4 ChIP文庫構(gòu)建、質(zhì)檢及測序 取1 μg input 對照DNA和 ChIP實驗DNA, 按照 NEBNext DNA 超快速文庫制備試劑盒的要求規(guī)范制備測序文庫。構(gòu)建好的文庫使用 Bioanalyzer檢測文庫DNA片段的完整性及插入片段大小，用定量PCR對文庫DNA拷貝數(shù)進行精確定量。隨后將構(gòu)建合格的文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求進行混合，使用Illumina高通量測序平臺 (HiSeq) 進行雙端測序。

1.2.5 實時熒光定量PCR驗證 使用轉(zhuǎn)錄子第一鏈cDNA合成試劑盒將 RNA合成cDNA。依據(jù)SYBR Green Master Rox試劑盒說明書，加入特殊引物進行PCR反應。PCR反應條件： 94 ℃變性10 min，再94 ℃變性15 s，60 ℃退火40 s，總共40個循環(huán)。將反應好的PCR體系放在ViiATM7實時定量PCR系統(tǒng)上進行檢測。每個PCR檢測重復3次，使用Gapdh和Hprt作為內(nèi)參基因?qū)z測基因的表達水平進行歸一化。根據(jù)2-ΔΔCT方法計算相對表達值，當2-ΔΔCT>1或<1認為檢測基因上調(diào)或下調(diào)。所有驗證引物的序列見表1。

表1 RT-PCR驗證引物

1.2.6 ChIP-seq數(shù)據(jù)生物信息學分析 本研究使用自動化分析程序ChiLin對ChIP-seq數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)分析[11]。FastQC檢查原始序列質(zhì)量和GC含量，默認比對工具BWA將ChIP和對照組的FASTQ文件比對到參考基因組mm9上。完成基因組比對后，使用默認峰調(diào)用程序MACS2 (https://github.com/taoliu/MACS/)來執(zhí)行窄峰(用于點源綁定)或?qū)挿宓母患?。進一步通過qvalue計算報告峰的錯誤發(fā)現(xiàn)率以及每個峰的褶皺富集程度。Cistrome平臺中輸入ChiLin 分析完成的bed 和wig格式的最終峰文件，通過對順式調(diào)控元件結(jié)合序列峰在基因組上的特征進行注釋，以找到下游離它最近的基因和最接近的轉(zhuǎn)錄起始位點。UCSC 來源的參考基因注釋文件將每個峰標注到從峰值到轉(zhuǎn)錄起始位點(transcription start site, TSS) 25 kb范圍內(nèi)的任何基因上以探索GLI1結(jié)合峰與潛在靶基因之間的相關性。

1.3 GO和 KEGG 分析以及蛋白互作分析工具

采用R擴展包Cluster Profiler對GLI1結(jié)合的靶基因進行GO(gene ontology，基因本體論)注釋和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析，篩選標準為P<0.05。STRING(http://string-db.org/)是一個預測蛋白質(zhì)間功能相關性的在線數(shù)據(jù)庫[12], 本研究利用STRING提取靶基因之間的相互作用關系(score>0.4)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

統(tǒng)計結(jié)果的所有統(tǒng)計量均以3個獨立實驗的平均值M±SEM表示，采用t檢驗比較IHH正常組與突變組之間的差異，P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 IHH-N突變蛋白抑制的C3H10T1/2細胞IHH信號通路的激活

將C3H10T1/2細胞與750 nmol·L-1IHH-N蛋白孵育48 h后，使用實時定量PCR在兩組中檢測激活的IHH信號傳導的靶標Gli1，Ptch1和Ihh的表達水平,發(fā)現(xiàn)誘導后Ihh和Gli1上調(diào),WT組的Gli1表達高于MT組(3.63vs2.07，P=0.051)(圖1)。這些結(jié)果表明E95K突變削弱了IHH信號的傳導作用。有趣的是，筆者觀察到，屬于Hedgehog(HH)信號傳導的12個跨膜結(jié)構(gòu)域受體Ptch1在WT組中被上調(diào)，而在MT組中被下調(diào)(2.27vs0.67，P=0.093)。IHH和受體PTCH1之間的結(jié)合有利于激活IHH/GLI1介導的下游靶基因的表達(圖1)。

圖1 激活IHH后，Gli1，Ihh和Ptch1的相對mRNA表達水平 Fig. 1 Relative mRNA expression level of Gli1, Ihh and Ptch1 after IHH activation

2.2 IHH突變蛋白作用下GLI1蛋白-DNA結(jié)合位點的全基因組表征

筆者使用Cistrome平臺對預測到的GLI1結(jié)合區(qū)域在小鼠基因組上進行了定位與注釋。結(jié)果表明，在染色體位置分布上，WT組的ChIP區(qū)域在所有染色體上均勻分布，而MT組在4, 9, 11, 13染色體上的富集比例明顯升高(圖2A)。為了獲得GLI1結(jié)合序列在基因組上的分布情況，筆者分別統(tǒng)計了WT, MT以及對照組的ChIP位點在基因組不同區(qū)域的比例。相對于CT組，WT和MT組的ChIP位點在基因組上啟動子區(qū)的分布比例明顯增加。MT組在基因組上明顯富集于啟動子區(qū)(≤1 000 bp)，而在基因組下游(≤1 000 bp)區(qū)域的富集率相對較小(圖2B)。這表明MT組的GLI1作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，主要在基因近端調(diào)控區(qū)發(fā)揮作用。隨后筆者對預測到的GLI1結(jié)合位點富集到基因組上的峰數(shù)目進行統(tǒng)計，鑒定出WT組201個峰、MT組92個峰和CT組87個峰(峰選擇閾值=p值<10e-5)。在WT和MT組之間，GLI1結(jié)合位點重疊區(qū)域較少(圖3A)，這表明突變的IHH信號改變了GLI1轉(zhuǎn)錄因子的下游調(diào)節(jié)機制。

2.3 IHH突變蛋白作用下GLI1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合靶基因的鑒定

本研究使用UCSC小鼠參考基因組注釋了GLI1結(jié)合位點25 kbp之內(nèi)的序列以表征潛在的GLI1調(diào)控靶基因，結(jié)果顯示在GLI1結(jié)合位點鑒定到WT組332個基因、MT組151個基因和CT組101個基因(圖3B)。WT組中GLI1結(jié)合的基因似乎比MT組更多，并且兩組中鑒定到共同的GLI1結(jié)合基因有18個(圖3B)。穩(wěn)定表達GLI1的細胞基因表達譜揭示了Slx1b是GLI1結(jié)合元件的直接下游靶標[13]，這也表明ChIP-seq技術分析結(jié)果具有較高的可靠性。

進一步對在WT 和MT組中預測到的特有的GLI1結(jié)合基因進行GO注釋，結(jié)果顯示，WT組的GLI1結(jié)合基因主要細胞成分為細胞核和細胞內(nèi)膜結(jié)合細胞器(圖4A)。GLI1結(jié)合靶基因參與了多種生物學過程，包括DNA模板轉(zhuǎn)錄的調(diào)控、RNA生物合成的調(diào)控、細胞大分子生物合成調(diào)控等，其中大部分為調(diào)控相關基因，表明GLI1可能參與細胞分化過程中的物質(zhì)合成調(diào)控過程(圖4B)。而MT組中GLI1結(jié)合靶基因無明顯富集的分子功能和生物學過程。進一步對兩組中GLI1結(jié)合的靶基因進行KEGG通路富集分析，結(jié)果表明，與WT組相比，MT組特有的GLI1結(jié)合靶基因富集到的信號通路明顯減少(P<0.05)(圖5)。兩組共有Rap1和ErbB信號通路,MT組主要缺失Wnt信號通路、刺猬因子(HH)信號通路、胰島素樣生長因子(IGF)信號通路、mTOR信號通路、TNF信號通路以及Th17信號通路等，其中刺猬因子(HH)信號通路、胰島素樣生長因子(IGF)信號通路和Wnt信號通路被報道是參與調(diào)控生長板軟骨的生長和發(fā)育的關鍵信號通路。

(A)ChIP區(qū)域在染色體上的分布統(tǒng)計；(B) ChIP區(qū)域在全基因組位置上的分布統(tǒng)計，啟動子區(qū)(≤1 000,≤2 000,≤3 000 bp)和下游調(diào)控區(qū)(≤1 000,≤2 000,≤3 000 bp)。

(A) GLI1結(jié)合位點的維恩圖；(B)預測的GLI1結(jié)合基因的維恩圖。圖3 ChIP-seq分析結(jié)果Fig. 3 Results from ChIP-seq analysis

(A)細胞成分；(B)生物學進程。圖中每個圖形為一個GO term，其中縱坐標代表GO名稱，橫坐標代表富集率，氣泡的大小代表富集到的基因數(shù)目，氣泡顏色越深表示該GO功能的富集越明顯。FDR代表矯正后的P值。

(A) WT組；(B) MT組。每條柱的長度代表每條通路富集到的基因數(shù)目，顏色越深表示該通路的富集越顯著。

分別對兩組中鑒定到的特有GLI1結(jié)合靶基因進行STRING分析，以提取靶基因之間的相互作用關系。結(jié)果顯示，相對于WT組，MT組的GLI1結(jié)合靶基因的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡節(jié)點的數(shù)量明顯減少，相互作用明顯減弱(圖6)。進一步對MT和WT組中預測到的GLI1結(jié)合的基因進行比較，發(fā)現(xiàn)兩組間存在465個不同的基因，對這些基因進行通路富集，列出前10個顯著富集的通路及通路上的候選基因，見表2。以上結(jié)果表明，E95K突變信號極大地改變了GLI1介導的下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而削弱了軟骨細胞增殖和分化中重要參與因子的應答。

表2 前10個明顯富集的KEGG信號通路

(A)WT組特有的靶基因相互作用關系；(B)MT組特有的靶基因相互作用關系。線條粗細代表蛋白與蛋白之間的關聯(lián)程度，線條越粗，代表蛋白之間關聯(lián)度越大。圖6 GLI1結(jié)合的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡Fig. 6 Interaction networks of GLI1 binding proteins

2.4 ChIP-seq分析鑒定到的GLI1結(jié)合基因在基因芯片上的驗證

將ChIP-seq預測的GLI1結(jié)合靶基因集與本實驗室前期的ChIP-chip數(shù)據(jù)集[8]進行聯(lián)合分析, 找到19個共同的候選基因。對這些候選基因進行生物學功能、通路及編碼蛋白互作分析。GO分析結(jié)果顯示，這些基因主要參與細胞與細胞間信號轉(zhuǎn)導等生物過程；KEGG通路富集分析表明這些基因參與cAMP信號通路和刺猬因子(Hedgehog, HH)信號通路(P<0.05)；蛋白互作網(wǎng)絡展示了功能基因編碼蛋白的互作關系，結(jié)果顯示刺猬信號通路下游GLI1調(diào)控的近端信號靶基因如Nkx2-5，Eya1和Foxa1之間存在較強的互作關系，可能是BDA1發(fā)生發(fā)展的關鍵基因(圖7)。同時，筆者也篩選到了感興趣的分子如Clec3a,Mtl5,Foxa1等，為進一步探索BDA1的發(fā)病機制和治療靶點提供理論基礎。

注：兩個節(jié)點之間的線段代表蛋白質(zhì)之間的相互作用。 圖7 GLI1結(jié)合的差異靶基因的蛋白互作網(wǎng)絡Fig. 7 The protein-protein interaction network built with the differentially expressed GLI1-binding target gene

3 討論與結(jié)論

HH/GLI信號通路通過協(xié)調(diào)軟骨細胞的增殖和分化來調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)骨形成的多個方面并控制骨骼的生長。在軟骨發(fā)育過程中，GLI介導的IHH信號在脊椎動物中調(diào)控下游基因的表達[14]。然而目前仍缺乏從全基因組范圍內(nèi)的分析，研究突變IHH-GLI1信號是如何影響下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式，進而導致BDA1的發(fā)生。本研究中，筆者首先使用野生型和突變型IHH蛋白作用于小鼠間充質(zhì)干細胞C3H10T1/2誘導IHH通路激活，通過實時定量PCR檢測和比較兩組間IHH通路相關因子轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果表明，E95K突變會削弱IHH信號在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用，這與前人關于E95K突變體IHH會在軟骨發(fā)育異常的小鼠模型中損害與其結(jié)合的下游靶基因的表達的研究一致[8]。隨后，使用ChIP-seq技術采用生物信息學方法鑒定和比較IHH蛋白正常組和突變組中與GLI1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因，并采用GO注釋和KEGG通路對兩組中特有的靶基因進行了生物學功能表征。在ChIP-seq分析結(jié)果中，筆者發(fā)現(xiàn) E95K突變削弱了IHH信號的傳導作用，使富集到的GLI1結(jié)合的靶基因明顯減少。缺少的信號通路主要有刺猬因子(HH)信號通路[15]、胰島素信號通路[16]和Wnt信號通路[17]等參與調(diào)控生長板軟骨的生長和發(fā)育的關鍵信號通路。本研究進一步解釋了由于IHH p.E95K突變改變的IHH/GLI1下游調(diào)節(jié)機制，為進一步探索BDA1的發(fā)病機制和治療靶點提供理論基礎。

基于對前10個顯著富集的通路的評估，筆者發(fā)現(xiàn)Prkaca基因參與的信號通路最多，發(fā)揮著重要的功能。Prkaca基因編碼蛋白激酶A的一個催化亞基，進而參與cAMP的蛋白磷酸化，在許多細胞過程(包括分化、增殖和凋亡)中發(fā)揮著重要作用。另一個基因Mapk3也參與多個信號通路，其編碼的蛋白質(zhì)是細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(MAP)家族的成員, 在信號級聯(lián)反應中起作用，響應各種細胞外信號調(diào)節(jié)各種細胞過程，例如增殖、分化和細胞周期進程。這也表明E95K突變信號改變了GLI1介導的下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達模式，其信號下游應答因子主要參與與軟骨形成相關的細胞分化、增殖和凋亡等生物學過程。此外，KEGG通路分析提示GLI1結(jié)合的候選靶基因在突變IHH-GLI1信號通路的響應應答中發(fā)揮著重要作用，如參與軟骨發(fā)育關鍵信號通路Wnt 信號通路中的Lgr6，Axin2，Map3k7，Dkk1，Prkaca，Apc及Ctbp2；刺猬因子(HH)信號通路中的Spop及Ptch2；IL-17信號通路中的Hsp90aa1及Fosb；胰島素信號通路中的Sh2b2，Calm2，Ppp1r3a及Mapk3等。

高通量測序和基因芯片等現(xiàn)代生物技術的發(fā)展以及生物信息學應用為我們從分子水平揭示E95K突變改變的IHH/GLI1下游調(diào)控機制以解釋BDA1的發(fā)病機理提供了很好的分析手段。這兩種技術的結(jié)合提高了轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)靶基因的精準鑒定。筆者將ChIP-seq預測的GLI1結(jié)合靶基因集與本實驗室前期的基因芯片數(shù)據(jù)集進行聯(lián)合分析, 找到了19個共同的候選基因。GO和KEGG分析顯示這些基因主要參與細胞與細胞間信號轉(zhuǎn)導等生物過程以及參與cAMP和刺猬因子(HH)等重要信號通路(P<0.05)。

蛋白互作網(wǎng)絡展示了功能基因編碼蛋白的互作關系，筆者發(fā)現(xiàn)刺猬因子(HH)信號通路下游GLI1調(diào)控的近端信號靶基因Nkx2-5，Eya1和Foxa1之間存在較強的互作關系。Nkx2-5基因被報道是骨髓間充質(zhì)干細胞(MMSC)向骨髓成心肌細胞分化的早期形成關鍵基因[18]。有研究表明MMSC是成體多能干細胞，在不同誘導條件下可以分化為軟骨、骨、心肌等多種組織的細胞。因此，筆者猜想本研究中E95K突變信號激活了C3H10T1/2細胞向其他細胞分化的參與因子，從而削弱了IHH信號在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用，導致BDA1的發(fā)生。然而，具體的作用機制還需要在未來的工作中進一步驗證。另外，本研究篩選到的Clec3a基因是成骨作用和骨化作用因子，其過表達會在創(chuàng)傷性顳下頜關節(jié)強直模型動物出現(xiàn)過度成骨現(xiàn)象，從而導致顳下頜關節(jié)強直疾病的發(fā)生[19]；Mtl5是參與骨關節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥的候選基因[20]；Foxa1參與骨癌的發(fā)展過程[21]。

綜上所述，本研究明確了IHH蛋白突變影響IHH通路蛋白轉(zhuǎn)錄，并通過ChIP-seq對GLI1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的靶基因位點進行分析，結(jié)合基因芯片數(shù)據(jù)的結(jié)果，分析和鑒定了IHH野生型蛋白和E95K突變型蛋白導致的GLI1-DNA結(jié)合靶基因的差異。GO分析和KEGG分析提示這些基因具有骨化作用的生物學功能并參與了刺猬信號骨發(fā)育關鍵信號通路。此研究結(jié)果對體內(nèi)E95K突變?nèi)绾胃淖僄LI1介導的基因調(diào)控并最終損害BDA1模型中的IHH信號傳導能力做出了新的解釋，這將為理解IHH信號在BDA1的軟骨形成作用以及探索BDA1的發(fā)病機制和治療靶點提供有用的信息。