美洲南瓜枯萎病生防藥劑和生防菌株篩選

陸美珍 ，柴改鳳 ，方曉麗 ，郭鳳清 ，張樹武 ，劉 佳 ，徐秉良

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070）

瓜類枯萎病又稱萎蔫病、蔓割病、死秧病，是由尖孢鐮刀菌引起的土傳病害。自20世紀(jì)80年代以來，已分布于世界各產(chǎn)瓜區(qū)，成為了世界性瓜類土傳病害［1］。一般發(fā)病率20%～30%，嚴(yán)重的達到50%～80%，甚至絕產(chǎn)，尤其是連作地發(fā)病嚴(yán)重［2］。隨著瓜類種植規(guī)模的擴大，瓜類枯萎病日趨嚴(yán)重，已成為瓜類生產(chǎn)上最主要的病害之一［3］。美洲南瓜（Cucurbito pepo）別名西葫蘆、番瓜，在北方保護地大面積栽培［4］，枯萎病的嚴(yán)重發(fā)生已經(jīng)成為限制美洲南瓜生產(chǎn)的重要因素之一，防治枯萎病已經(jīng)成為了美洲南瓜生產(chǎn)急需解決的重大問題。

對于瓜類枯萎病的防治，目前主要包括用多菌靈或高錳酸鉀溶液浸種，用多菌靈進行苗床消毒，利用棉隆、異氰尿酸、含氯藥劑進行土壤消毒等處理方式，能夠有效降低土壤中枯萎病菌的基數(shù)，減輕病害發(fā)生［5］。然而長期使用化學(xué)藥劑，易造成農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，不僅危害人畜健康而且易使病菌產(chǎn)生抗藥性，防治效果不佳［6］。

植物源殺菌劑因其環(huán)保長效、易光解、無殘留、對環(huán)境污染小等特點進入了人們的視線。其中丁子香酚具有觸殺性強、安全環(huán)保無殘留、速效及持效期長、長期使用無抗藥性等優(yōu)點，成為生產(chǎn)綠色無公害農(nóng)產(chǎn)品的首選農(nóng)藥。陳莉等［7］的研究發(fā)現(xiàn)，丁子香酚在土壤中的半衰期為16.5 h，最低檢出濃度為0.003 mg/kg，符合農(nóng)藥殘留分析的要求，屬易分解農(nóng)藥（T1/230 d），按推薦劑量使用是安全的。鄭慶偉［8］和韓景紅［9］的研究表明，丁子香酚對防治大田馬鈴薯晚疫病和番茄灰霉病都具有良好的效果。

近年來，利用微生物來防治瓜類枯萎病取得了較大的進展，已成為防治該病害的重要手段［10］。如王麗麗等［11］從黃瓜根際土壤中分離出拮抗黃瓜枯萎病病菌的拮抗菌株。肖密［12］利用哈茨木霉菌T2-16防治西瓜枯萎病，發(fā)現(xiàn)哈茨木霉能有效抑制尖孢鐮刀菌的生長，抑制率達到67.21%，室內(nèi)盆栽防效達到了60.00%。李晶等［13］利用枯草芽胞桿菌B29發(fā)酵液浸種和灌根防治黃瓜枯萎病效果顯著，防效達84.9%。但目前針對美洲南瓜枯萎病生物防治的相關(guān)研究相對較少。

我們對美洲南瓜枯萎病生防藥劑及菌株進行了篩選及室內(nèi)防效測定，以期篩選出防治美洲南瓜枯萎病的高效生防藥劑及生防菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試病原菌 美洲南瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）從甘肅省武威市金蘋果有限責(zé)任公司種質(zhì)資源試驗基地患枯萎病的美洲南瓜中分離得到，由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院植物病理學(xué)實驗室分離、鑒定并保存。

1.1.2 供試藥劑 供試化學(xué)藥劑為50%多菌靈可濕性粉劑（上海悅聯(lián)化工有限公司）、供試生防藥劑有20%乙蒜素乳油（河南省南陽臥龍農(nóng)藥廠）、5%香芹酚水劑（蘭州世創(chuàng)生物科技有限公司）、1.3%苦參堿水劑（恒源偉業(yè)生物科技發(fā)展有限公司）、0.3%丁子香酚可溶性液劑（南通神雨綠色藥業(yè)有限公司）。

1.1.3 供試生防菌株 供試生防菌株為生防長枝木霉T6菌株（Trichoderma longibrachiatum CGMCC.No.13183）、多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），均由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院植物病理學(xué)實驗室分離、保存。

1.1.4 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。PDB培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL。NA培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、牛肉浸膏3 g、氯化鈉5 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。NB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g、牛肉浸膏3g、氯化鈉5g、蒸餾水1000mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 美洲南瓜枯萎病生防藥劑篩選 以4種生防藥劑和1種化學(xué)藥劑的推薦濃度為基準(zhǔn)，采用對半稀釋法將每種藥劑稀釋為6個濃度梯度。PDA培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50℃左右，加入配制好的供試藥劑稀釋液，制成含藥培養(yǎng)基，重復(fù)4次。以加入同等量無菌水的培養(yǎng)基為對照。將打好的直徑0.5 cm的美洲南瓜枯萎病菌菌餅置于培養(yǎng)皿中央，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，用十字交叉法測量菌落直徑，取其平均值并記錄，計算相對抑菌率，并拍照記錄每種含藥培養(yǎng)基中病菌生長情況。

1.2.2 美洲南瓜枯萎病生防菌株篩選 在預(yù)試驗測定生防菌株對美洲南瓜枯萎病菌抑制效果的基礎(chǔ)上，設(shè)置4種生防菌株的稀釋倍數(shù)，每種生防菌株分為6個濃度梯度。取出實驗室中保存的枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和多粘芽孢桿菌，在NA培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)至出現(xiàn)單獨菌落備用。使用NB液體培養(yǎng)基制備3種芽孢桿菌菌株的發(fā)酵液，搖床培養(yǎng)1 d，將搖好的發(fā)酵液在8 000 r/min的條件下離心20 min，將上清液用0.22 μm的細菌過濾器過濾孢子，分別得到枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和多粘芽孢桿菌的菌株發(fā)酵液備用。使用PDB液體培養(yǎng)基制備木霉T6菌株的發(fā)酵液，搖菌3 d［14］，同上操作得木霉T6菌株發(fā)酵液。PDA培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50℃左右，加入供試生防菌株的發(fā)酵液，倒入培養(yǎng)皿制成含藥培養(yǎng)基，重復(fù)4次。以加入同等量無菌水的培養(yǎng)基為對照。將打好的0.5 cm美洲南瓜枯萎病菌菌餅置于培養(yǎng)皿中央，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，用十字交叉法測量菌落直徑，取其平均值并記錄，計算相對抑菌率（計算公式同1.2.1），并拍照記錄每種含藥培養(yǎng)基中菌落的生長情況。

1.2.3 生防菌株對美洲南瓜枯萎病的室內(nèi)防效測定 在玻璃培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中鋪3層滅菌濾紙（直徑9 cm），用移液器均勻滴加3 mL無菌水于濾紙上，至濾紙浸濕并無多余水。將美洲南瓜的種子用75%酒精浸泡消毒2 min，然后用3%次氯酸鈉溶液浸泡消毒5～10 min，無菌水沖洗后均勻擺在鋪好的濾紙上，把培養(yǎng)皿放于25℃，16 h光照、8 h黑暗的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約7 d。種子長出長1 cm左右的根后，置于裝有滅菌營養(yǎng)土的盆中培養(yǎng)。

待培養(yǎng)至4～5葉苗齡時期后，選取長勢一致的美洲南瓜苗，將植株根部從花盆中挖出，用流水將植株根部沖洗干凈，用無菌濾紙將水分吸干，用無菌剪刀將植株須根剪掉0.2 cm，造成傷口［15］。采用蘸根法接種［16］，將處理后的植株根部全部浸泡在配制好的美洲南瓜枯萎病菌的孢子懸浮液中（107cfu/mL），浸泡 30 min 后［17］，將接種了病原菌的美洲南瓜苗移栽到裝有滅菌土的盆中，觀察發(fā)病狀況。

在植株發(fā)病初期，用配制篩選出的具有最佳抑菌效果的菌株發(fā)酵液對植株進行灌根處理［18］，以正常生長的健株以及接種病原菌的植株作為對照。所有處理均在溫室中進行，7 d后觀察發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥劑對美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用

從表1可以看出，4種生防藥劑均對美洲南瓜枯萎病菌均有抑制作用，以推薦濃度為基礎(chǔ)，稀釋倍數(shù)越小，藥劑的抑菌效果越好。其中1.3%苦參堿水劑、5%香芹酚水劑、20%乙蒜素乳油在對應(yīng)的最高濃度時抑菌率分別為48.7%、33.8%、15.9%，均未超過50%。0.3%丁子香酚可溶性液劑在250倍濃度下抑菌率高達82.6%，菌落直徑只有1.48 cm；稀釋1 500倍濃度下抑菌率只有59.0%，菌落直徑3.48 cm（圖1）。0.3%丁子香酚可溶性液劑250倍液抑菌率為82.6%，與50%多菌靈可濕性粉劑300倍液抑菌率91.20%相比無顯著性差異。

2.2 不同生防菌株對美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用

從表2可看出，4種生防菌株對美洲南瓜枯萎病菌均具有抑制作用。多粘芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、木霉T6菌株4種菌株在最高濃度時，對美洲南瓜枯萎病菌的抑制率分別為50.8%、55.4%、63.1%、85.7%，均超過50%。其中5倍木

霉T6菌株發(fā)酵液的抑菌效果最佳，高達85.7%（圖2），其余3種菌株對美洲南瓜枯萎病菌的抑制效果維持在28.7%～63.1%，不同菌株之間抑制效果存在差異。

表1 不同藥劑對美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用

表2 不同生防菌株對美洲南瓜枯萎病菌的抑制作用

2.3 生防菌株對美洲南瓜枯萎病的室內(nèi)防效

如圖3A所示，對照美洲南瓜苗生長健康，莖稈挺直，葉片舒展；接種病原菌的美洲南瓜苗萎蔫倒伏，莖基部變黃萎縮，葉片皺縮變褐（圖3B）。接種病原菌后，用稀釋5倍的木霉T6菌株發(fā)酵液處理的美洲南瓜苗，葉片漸漸舒展，莖基部變白（圖3C），可以看出木霉T6菌株對美洲南瓜枯萎病具有明顯防效。

3 結(jié)論與討論

木霉菌可作為防治植物病害理想的生防因子［19］。畢卉等［20］篩選出對黃瓜枯萎病菌抑制效果達80%以上的4株高效木霉菌株，分別是哈茨木霉、綠色木霉、長枝木霉和康氏木霉，對黃瓜枯萎病的防治效果最高可達66.57%，對黃瓜根系和植株的生長起到促進作用。本研究表明，生防木霉T6菌株5倍稀釋發(fā)酵液對美洲南瓜枯萎病菌的抑制率可達85.7%。

何培青等［21］的研究發(fā)現(xiàn)，4 μmol/L 的丁子香酚會使番茄灰葡萄孢菌絲生長畸形，李敏［22］發(fā)現(xiàn)天然植物源農(nóng)藥百里香酚會對西瓜枯萎病菌菌絲的生長產(chǎn)生抑制作用。本研究中0.3%丁子香酚可溶性液劑250倍液對美洲南瓜枯萎病菌的抑菌率為82.6%，與50%多菌靈可濕性粉劑300倍液抑菌率相比，無顯著性差異。

肖榮鳳等［23］使用5%哈茨木霉FJAT-9040生防菌劑和10%哈茨木霉FJAT-9040生防菌劑分別處理苦瓜苗，能顯著促進植株根系與藤蔓的增長，并證明該作用是哈茨木霉FJAT-9040菌體成分為主發(fā)揮的作用。本研究表明，在用長枝木霉T6菌株發(fā)酵液處理發(fā)病的美洲南瓜枯萎病苗后，具有明顯的防治效果，植株發(fā)病情況得到了明顯的改善。

本研究表明，稀釋5倍的生防木霉T6菌株發(fā)酵液對美洲南瓜枯萎病菌具有明顯的抑制作用，對美洲南瓜枯萎病亦具有一定的防治效果。0.3%丁子香酚可溶性液劑250倍液對美洲南瓜枯萎病菌的生長具有明顯的抑制作用，生產(chǎn)上可以考慮用0.3%丁子香酚可溶性液劑代替50%多菌靈可濕性粉劑用于防治美洲南瓜枯萎病。