擴張型心肌病相關(guān)基因的生物信息學(xué)研究

栗瑞蘭，閆玉清，張年萍·2*，朱壯彥

（1.山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山西大同 037009；2.山西大同大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心血管病研究所，山西大同 037000）

心肌病是一種異質(zhì)性的心臟疾病，由于其心肌結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，導(dǎo)致心力衰竭和死亡[1]。擴張型心肌?。―ilated Cardiomyopathy，DCM）是最常見的心肌病形式，其特征是左或雙心室擴張和收縮功能降低，患者左心室的射血分數(shù)降低。隨著病情的發(fā)展，發(fā)生心律不齊和心源性猝死的風(fēng)險增加[1]。30%～50%的患者可以檢測到基因突變[2-3]。有報道表明，在大約1/3 的病例中，DCM 是心力衰竭的根本原因[4]，而且，擴張型心肌病可以發(fā)生在任何年齡[5]。致病原因有很多，包括毒性物質(zhì)、代謝、風(fēng)濕病、內(nèi)分泌疾病以及感染等，然而其根本原因仍未明確。本研究擬通過系統(tǒng)性分析DCM 患者的高通量測序芯片，構(gòu)建心肌病的差異性基因表達譜，進行生物信息學(xué)注釋，從而發(fā)現(xiàn)與DCM 相關(guān)的關(guān)鍵基因和信號通路，擬找出DCM 相關(guān)的生物標(biāo)志物，并進一步闡明其潛在的分子機制，為更好地診斷和治療DCM 提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 資料來源

高通量測序數(shù)據(jù)集（GSE42955）來自美國國家生物信息中心（NCBI）公共數(shù)據(jù)平臺基因表達數(shù)據(jù)庫（GEO）。下載心肌病相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)集（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo），該數(shù)據(jù)集基于GLP6244平臺，Affymetrix 公司使用微陣列[HuGene-1_0-st]Human Gene 1.0 ST Array，檢測29 例人心臟組織獲得數(shù)據(jù)，包括5 例正常，12 例擴張型心肌病患者和12 例缺血性心肌病患者。我們選擇正常組和擴張型心肌病患者數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析。

1.2 方法

利用GEO2R在線分析工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/? acc=GSE42955）對原始數(shù)據(jù)進行DCM和正常心肌組織的差異基因篩選，篩選條件為P＜0.05，其中Log2FC≥1.0 為上調(diào)，Log2FC＜-1.0 為下調(diào)，對數(shù)據(jù)進行篩選；之后利用GraphPad Prism 8 軟件繪制差異基因火山圖。

利用在線生物信息學(xué)資源庫DAVID 6.7 對差異基因進行GO 分析和KEGG 通路富集，以P＜0.05 為顯著富集，P值從小到大列出排名前10 的GO 功能族和KEGG 信號通路，分析差異基因富集的生物功能、細胞組分、分子功能以及信號通路。

利用在線數(shù)據(jù)庫STRING（https：//string-db.org/）對篩選所得差異基因進行蛋白網(wǎng)絡(luò)互作（PPI）分析。在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，一個節(jié)點代表一個蛋白質(zhì)，節(jié)點間的連線代表蛋白間的相互作用。使用Cytoscape軟件（3.8.0）對蛋白質(zhì)互相作用的結(jié)果進行可視化，并使用軟件中的MOCDE 和CytoHubba 插件通過12 種方法篩選出連接度最高的前10 個關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 擴張型心肌病差異基因篩選

通過GEO2R 分析，篩選出57 個與擴張型心肌病相關(guān)的差異基因，其中25個下調(diào)、32個上調(diào)。差異基因火山圖中綠色表示下調(diào)基因、紅色表示上調(diào)基因，灰色表示無差異基因，如圖1。

圖1 GSE42955數(shù)據(jù)集差異基因火山圖

2.2 差異基因的GO富集和KEGG通路富集

通過DAVID 6.7 分析結(jié)果，GO 富集顯示，差異基因主要涉及的生物學(xué)功能包括對細胞因子的反應(yīng)、對脂質(zhì)的反應(yīng)、對細菌來源分子的反應(yīng)、節(jié)律過程、細胞對有機物的反應(yīng)、細胞表面受體信號通路、細胞因子介導(dǎo)的信號通路等（圖2-A）。細胞組分富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異基因主要存在于細胞外，涉及雙加氧酶活性、受體結(jié)合、核啟動子結(jié)合等分子功能（圖2-B）。KEGG 富集結(jié)果顯示，與心肌病相關(guān)的差異基因主要在非洲錐蟲病、瘧疾、TNF信號通路上（圖2-C）。

圖2 差異基因的GO和KEGG分析結(jié)果

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選出來的差異基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），得到差異表達基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，共有55 個節(jié)點，184 條邊（如圖3）。使用Cytoscape3.8.0 軟件對蛋白互作的結(jié)果進行可視化，隨后使用軟件中的MCODE 插件篩選子網(wǎng)絡(luò)，最后利用CytoHubba插件，通過12種算法篩選連接度最高的前10 位的基因作為關(guān)鍵基因（圖4），分別為ICAM-1(細胞間黏附分子-1)、VCAM-1(血管細胞黏附分子-1)、FCGR-1A/B（免疫球蛋白-Fc 受體IA/B）、IFI-30(干擾素γ 誘導(dǎo)蛋白-30)、GBP-1/3/4(干擾素誘導(dǎo)鳥苷酸結(jié)合蛋白-1/3/4)、SEL-E（E 選擇素）、CCL-2（趨化因子C-C基序配體-2）。

圖3 差異基因編碼蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 節(jié)點度值排序前10位差異性基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

3 討論

擴張型心肌病的臨床表現(xiàn)有不同的方式:75%～85%的患者有心衰的體征和癥狀，86%的患者運動時呼吸困難，30%的患者心悸，29%的患者外周水腫。在發(fā)病過程中，95%的患者出現(xiàn)心力衰竭癥狀。在4%～13%的患者中，開始表現(xiàn)為無癥狀的心臟肥大[6]。其他形式初始表現(xiàn)為心律失常、傳導(dǎo)障礙、血栓栓塞并發(fā)癥或猝死。目前對不同形式的心肌病已有大量的研究，然而參與DCM 發(fā)病基因的表達仍不清楚。Molina-Navarro等利用基因表達微陣列分析發(fā)現(xiàn)離子通道相關(guān)基因在DCM 的發(fā)展中具有重要作用；通過分析DCM基因表達譜，對進一步探索DCM的發(fā)病機制、預(yù)防、治療及預(yù)后具有重要作用[7]。

本研究通過生物信息學(xué)方法從GEO 數(shù)據(jù)庫中搜索得到芯片數(shù)據(jù)集GSE42955，包括GO 分析、KEGG通路富集分析和PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，利用GEO2R 在線分析工具對該芯片數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果表明，DCM 患者的心肌組織與正常人的心肌組織間的基因表達確實存在差異。

為系統(tǒng)性分析DCM 的分子網(wǎng)絡(luò)機制，本研究利用在線數(shù)據(jù)庫DAVIDE 對差異基因進行GO 富集分析，發(fā)現(xiàn)其生物過程、分子功能及信號通路主要富集在炎癥反應(yīng)過程中，細胞通過對細胞因子的反應(yīng)、對脂質(zhì)的反應(yīng)、對細菌來源分子的反應(yīng)、對有機物的反應(yīng)、細胞表面受體信號通路、細胞因子介導(dǎo)的信號通路產(chǎn)生炎性因子，調(diào)節(jié)雙加氧酶活性、受體結(jié)合、核啟動子結(jié)合等。KEGG 富集結(jié)果顯示，與心肌病相關(guān)的差異基因主要在非洲錐蟲病、瘧疾、TNF 信號通路上。通過STRING 進行PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，Cytoscape插件MCODE 和CytoHubba計算，篩選出10個關(guān)鍵基因為ICAM-1、VCAM-1、FCGR-1A/B、IFI-30、GBP-1/3/4、SEL-E、CCL-2。

在擴張型心肌病中，免疫異常長期持續(xù)存在，并可能導(dǎo)致心肌的慢性炎癥。細胞黏附分子是在細胞表面表達的糖蛋白，使細胞之間互相接觸。ICAM-1、VCAM-1 和SEL-E 在炎癥早期的免疫過程具有重要的作用。有研究表明在DCM心肌組織中發(fā)現(xiàn)ICAM-1和VCAM-1[8]。VCAM-1 是一種炎癥介質(zhì)，介導(dǎo)白細胞與血管內(nèi)皮的黏附，VCAM-1 和VLA-4 之間的相互作用增強了骨髓衍生細胞的遷移并起抗凋亡作用，從而改善了CVB-3 誘導(dǎo)的DCM 的心臟功能。通過心肌再灌注可增強VCAM-1 的表達，而NF-kB 抑制劑治療可抑制VCAM-1 的表達，進而降低心肌細胞纖維化和凋亡[9]。在本研究中，DCM 左心室組織中VCAM-1 顯著下降，與之前的研究一致[10]，VCAM-1的表達可能與DCM 發(fā)病原因有關(guān)。另在小鼠心肌缺血模型的研究中發(fā)現(xiàn)，ICAM-1 和SEL-E 參與心肌損傷過程[11]。綜上所述，這些黏附分子的檢測在臨床慢性心肌病診斷中可能具有重要價值。

在小鼠病毒性心肌炎(VMC)模型研究中發(fā)現(xiàn)，心肌細胞通過上調(diào)GBP-1，通過抑制巨噬細胞從而抑制炎癥反應(yīng)和心肌細胞凋亡，進而保護心肌細胞的損傷，同時增加心肌細胞的活力[12]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，DCM患者的GBP-1表達下降，這表明GBP-1可能對心肌病的治療過程具有重要作用。

IFI-30在免疫應(yīng)答中具有重要的生物學(xué)作用，通過刺激哺乳動物的二硫鍵還原參與II類MHC 限制性抗原的反應(yīng)過程。在豬的研究中發(fā)現(xiàn)IFI-30 在脾、肝、肺、心、腸、血液和腎等組織均有表達，而且在脂多糖誘導(dǎo)脾和血液中IFI-30 表達明顯上調(diào)。這些結(jié)果表明IFI-30 極有可能在豬的先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用[13]。

CCL-2是C-C趨化因子家族的一個成員，與C-C趨化因子受體-2（CCR-2）結(jié)合。CCL-2 通常由巨噬細胞分泌，對傳染性病原體反應(yīng)，是白細胞、T 淋巴細胞和白細胞的有效趨化因子[14]。有研究表明，在治療病毒性心肌炎過程中，IL-17 可以通過Act1/TRAF6/p38MAPK 依賴的AP-1 通路，激活刺激心肌細胞中CCL-2的表達[15]。本研究中發(fā)現(xiàn)在DCM 左心室組織中CCL-2表達顯著下降。

FCGR1A/B 主要分布于單核-巨噬細胞、樹突狀細胞、嗜堿性粒細胞和中性粒細胞等表面。活化的FcγRs 在抗原遞呈細胞表面介導(dǎo)免疫復(fù)合物的吞噬作用并促進TNF-α、IL-6 等多種細胞因子釋放等效應(yīng)功能[16]。

FCGR-1A/B、IFI-30、GBP-3/4 基因均參與免疫系統(tǒng)的作用過程，我們推測在心肌細胞中由于炎癥因子刺激細胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)時，這些基因可能發(fā)揮重要的作用，具體的作用機制還需進一步驗證，但我們的結(jié)果為DCM的發(fā)病機制提供了理論基礎(chǔ)。