苗藥血人參總黃酮的分離及體外抑菌研究*

傅 建，付慧曉，張永萍▲，李友露，童 玲，楊 姍，吳靜瀾

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2貴陽市第一人民醫(yī)院，貴州 貴陽 550002)

苗藥血人參為豆科木藍(lán)屬植物茸毛木藍(lán)IndigoferastachyoidesLindl.的干燥根，為貴州少數(shù)民族地區(qū)用藥，又以苗族地區(qū)使用最為廣泛，主要分布在貴州省的六枝特區(qū)、盤縣、水城、紫云和貴陽等25個(gè)地區(qū)[1]，云南、廣西和湖北等地也有分布[2]。血人參收載于2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，具有滋陰補(bǔ)虛、活血舒筋、調(diào)經(jīng)攝血的功效，主治肝硬化、崩漏、體虛久痢、跌打損傷、腸風(fēng)下血等癥[1]。目前關(guān)于血人參的資源調(diào)查、化學(xué)成分及藥理活性評(píng)價(jià)有研究報(bào)道[3-5]。在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)方面，課題組前期發(fā)現(xiàn)血人參中富含大量的黃酮類化合物[6-7]，但是目前血人參黃酮類化合物的活性研究較少[8]，且在抑菌方面筆者未見國內(nèi)(外)文獻(xiàn)報(bào)道。黃酮類化合物素來在抑菌作用方面都表現(xiàn)出良好的開發(fā)潛力，已經(jīng)成為近年來研究的熱點(diǎn)之一[9-10]。一些學(xué)者從植物中分離得到的黃酮提取物具有很強(qiáng)的抑菌活性，最低抑菌濃度(MIC)已達(dá)到0.25 μg·mL-1，有望成為抗菌藥物的先導(dǎo)化合物[11]。本實(shí)驗(yàn)采用硅膠、聚酰胺柱層析法富集得到含量較高的血人參總黃酮，并對其進(jìn)行了體外抑菌活性研究，以期為該藥用資源的充分、合理開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥材及其對照品

血人參藥材由貴陽德昌祥藥業(yè)提供，并鑒定為豆科木蘭屬植物茸毛木藍(lán)IndigoferastachyoidesLindl.的根；環(huán)丙沙星(含量98%，薩思化學(xué)技術(shù)有限公司)；蘆丁(含量92%，中國藥品生物制品檢定所)；表兒茶素(含量93%，中國藥品生物制品檢定所)。

1.2 試劑

營養(yǎng)瓊脂、氯化鈉、酵母膏、胰蛋白(杭州微生物試劑有限公司)；硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉均為分析純(上海泰坦科技股份有限公司)；濾紙片(通用電氣生物科技有限公司)。

1.3 菌株

大腸桿菌(Escheriechiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色念球菌(Candidaalbicans)均為貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 主要儀器設(shè)備

YJ13/2B-G型密閉二連體煎藥機(jī)(北京東華原醫(yī)療設(shè)備有限責(zé)任公司)；RE-5210A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器有限公司)；TDL-5A型離心機(jī)(湖南星科科學(xué)儀器公司)；UV-5900紫外可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；移液器(德國Eppendorf公司)；LDZX-50KBS立體壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；HZQ-F160A恒溫振蕩器(上海一恒儀器有限公司)。

2 方法

2.1 血人參提取物的制備

稱取9 kg血人參藥材干燥根經(jīng)粉碎成粗粉(過40目篩)，充分浸漬后，依次用90%、60%乙醇在79 ℃下分別高壓煎煮2次，每次2 h，合并濾液，于60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，加入兩倍體積的水分散，離心，藥渣經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，真空干燥，備用。

2.2 血人參中總黃酮含量測定[8]

2.2.1 線性關(guān)系考察

稱取蘆丁對照品4.43 mg，加60%甲醇溶解定容至25 mL量瓶中，搖勻，制成0.2953 g·L-1溶液。精密吸取對照品溶液1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，6 mL，置于25 mL具塞比色管中，加入60%甲醇至6 mL，搖勻，加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，再加入10%Al(NO3)3溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，最后加入4%NaOH溶液10 mL，60%甲醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min，以60%甲醇為空白，在510 nm波長處測定吸光度。以含有量為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得回歸方程為Y=5.6568X-0.0062 (R2=0.9994)，線性關(guān)系良好。

2.2.2 含量測定方法

取待測組分適量，精密稱定，加入60%甲醇定容至5 mL，搖勻，吸取1 mL置于25 mL具塞比色管中，按“2.2.1”項(xiàng)下方法加入顯色劑，以60%甲醇和顯色劑為空白，測定吸光度，計(jì)算總黃酮含量。

2.3 純度測定

參照邵金華等[12]的方法，將總黃酮粗提物、硅膠洗脫組分及純化后的黃酮均配成1 g·L-1溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法測定吸光度，計(jì)算純度。

2.4 硅膠柱層析分離血人參總黃酮

稱取500 g血人參總黃酮提取物用適量乙醇溶解，拌入500 g硅膠，揮去溶劑后上樣于處理好的層析柱，用洗脫劑二氯甲烷-甲醇(100∶10，100∶25，100∶50，100∶100，0∶100)梯度洗脫，每50 mL收集一份，以表兒茶素作對照品，經(jīng)薄層層析(TLC)檢測洗脫液，合并相似組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，真空烘干，得到血人參不同極性的總黃酮組分6份，測定其中總黃酮含量，計(jì)算純度，記為SC-1～SC-6，備用。

2.5 聚酰胺柱層析富集血人參總黃酮

對于抑菌活性較好的硅膠洗脫組分，再上樣于聚酰胺柱層析柱純化。稱取SC-1組分適量，用乙醇溶解稀釋成質(zhì)量濃度2.80 g·L-1(按浸膏量計(jì))，作為上柱樣品溶液。上柱樣品溶液拌入2 g干燥聚酰胺粉末，揮去溶劑后上樣于處理好的層析柱，依次用蒸餾水和體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%的乙醇洗脫，收集各部分洗脫液，測定總黃酮含量，合并含總黃酮高的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，即得到較高純度總黃酮，測定總黃酮含量，計(jì)算純度，備用。

2.6 血人參總黃酮抑菌活性的測定[13]

2.6.1 培養(yǎng)基的配制

LB固體培養(yǎng)基：NaCl 5.0 g，酵母提取物5.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂粉20.0 g，去離子水定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min；LB液體培養(yǎng)基：NaCl 10.0 g，酵母提取物5.0 g，蛋白胨10.0 g，去離子水定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min。

2.6.2 菌懸液及濾紙圓片制備

每次實(shí)驗(yàn)前預(yù)先對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌4種供試菌進(jìn)行活化，用接種環(huán)分別挑取一環(huán)活化后的菌種，接種到10 mL滅菌營養(yǎng)瓊脂液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，于37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h后作為原菌液。采用比濁法用0.5麥?zhǔn)媳葷峁軐Ρ扰渲凭w懸浮液，用滅菌生理鹽水將各原菌液稀釋，配制菌體懸液的菌數(shù)1×107～1×108cfu/mL，備用。用打孔器打出直徑為6 mm的濾紙小圓片121 ℃滅菌15 min后烘干，備用。

2.6.3 血人參總黃酮抑菌活性測定

采用K-B紙片擴(kuò)散法。在無菌條件下將“2.4”項(xiàng)下不同組分用無菌二甲基亞砜溶液(DMSO)溶解，配制成高低總黃酮濃度分別為10.0 g·L-1、5.0 g·L-1的供試樣品。另設(shè)有環(huán)丙沙星(0.1 g·L-1)和10%DMSO溶液作對照，將濾紙片置于上述溶液浸泡10 h。將滅菌后的培養(yǎng)基傾入無菌培養(yǎng)皿凝固后，吸取0.1 mL的3種供試菌懸液于培養(yǎng)基平板上，用涂布棒涂布均勻。用無菌鑷子夾取出浸泡過的濾紙圓片，瀝干，均勻置于培養(yǎng)基表面，每個(gè)培養(yǎng)皿均勻放置6片濾紙，編號(hào)標(biāo)記，將含細(xì)菌的培養(yǎng)皿置于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，含有真菌的培養(yǎng)皿置于28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察濾紙圓片周圍是否出現(xiàn)抑菌圈，十字交叉法量取抑菌圈直徑，每組試驗(yàn)平行3次，求平均值。

2.6.4 最低抑菌濃度(MIC)的測定

采用平板二倍稀釋法。將抑菌活性較好的組分SC-1及其富集黃酮后的組分，分別配制0.3125～5 g·L-16個(gè)濃度梯度，吸取各濃度的溶液1 mL置于培養(yǎng)皿內(nèi)，注入50 ℃無菌培養(yǎng)基后充分混勻，待培養(yǎng)基凝固后，分別滴加4種供試菌的菌懸液各0.1 mL，用涂布棒涂布均勻，對含細(xì)菌培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)。將完全無菌生長的平板所對應(yīng)的濃度記為最低抑菌濃度，每組試驗(yàn)平行測定3次，求平均值。

2.7 數(shù)據(jù)處理

SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，測定結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同總黃酮濃度的抑菌圈直徑測定結(jié)果

采用硅膠柱層析二氯甲烷-甲醇梯度洗脫，所得黃酮組分極性逐漸增加，對其配制了高低總黃酮濃度(10.0g·L-1、5.0 g·L-1)進(jìn)行了抑菌活性測定。由表1可知，對于產(chǎn)生抑菌效果的各受試菌株，供試組分總黃酮濃度增加，抑菌圈直徑亦增加；隨著供試組分的黃酮極性的增加，其抑菌活性反之逐漸降低或無抑菌活性。

上述6種組分對枯草芽孢桿菌無抑菌效果。SC-1和SC-2僅在高濃度下對白色念珠菌表現(xiàn)低敏。各組分對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑菌活性，總體上對金黃色葡萄球菌的抑菌活性強(qiáng)于大腸桿菌。對于大腸桿菌，SC-1抑菌活性最佳，為中敏；相同濃度下的SC-2與SC-3抑菌活性接近稍強(qiáng)于SC-4，均為低敏；SC-5在高濃度下才具有抑菌活性，SC-6組分幾乎無抑菌活性。對于金黃色葡萄球菌，SC-1在低濃度條件下為中敏，但在高濃度條件下表現(xiàn)為高敏；相同濃度下的SC-2～SC-4抑菌活性逐漸減弱，高、低濃度下分別表現(xiàn)為中敏和低敏；SC-5在高低濃度均為低敏，強(qiáng)于SC-6，其在高濃度下為低敏。由此可知，血人參總黃酮具有抑菌活性，在大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌活性基本均以組分SC-1的效果最佳，因此進(jìn)一步采用聚酰胺富集總黃酮。

3.2 純度測定結(jié)果

用聚酰胺層析柱對抑菌活性較好的SC-1進(jìn)行總黃酮富集，富集前黃酮純度僅為(17.8±0.2)%，富集后達(dá)到(64.2±0.3)%，提高了3.6倍，表明聚酰胺對黃酮的富集效果良好。

3.3 最低抑菌濃度(MIC)測定結(jié)果

對富集前的組分SC-1和富集后的組分進(jìn)行MIC測定。由表2結(jié)果可知，富集前黃酮對3種供試菌的MIC由高到低依次是：白色念珠菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，富集后的黃酮MIC降低趨勢更加明顯，兩者對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑菌效果更好，MIC分別達(dá)0.625 g·L-1、0.3125 g·L-1。

表1 硅膠柱層析不同極性組分的抑菌圈直徑(x±s，n=3)Tab.1 Bacteriostatic circle diameter of each component bysilica gel column chromatography

表2 血人參總黃酮的MIC測定Tab.2 Determination of MIC of total flavonoids of Indigofera stachyoides

4 結(jié)論

本文采用硅膠以不同比例二氯甲烷-甲醇洗脫，有效地分離出6種黃酮類組分SC-1～SC-6，K-B紙片法分別比較了總黃酮濃度為5.0g·L-1、10.0 g·L-1的組分對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌)、革蘭氏陽性桿菌金黃色葡萄球菌及真菌白色念珠菌的抑菌活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌均對上述供試組分無抑菌活性，白色念珠菌對SC-1～SC-2組分低度敏感，其余受試菌均表現(xiàn)一定抑菌活性。實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)，血人參黃酮中極性較小的組分，抑菌活性較強(qiáng)，與羅曉韻等[14]對水辣蓼總黃酮不同極性部位抑菌活性研究的結(jié)果相一致，說明血人參總黃酮抑菌活性成分集中在極性較小的部位；相較于低濃度黃酮而言，高濃度的黃酮的抑菌圈直徑均有明顯增加，總黃酮濃度與抑菌活性呈正相關(guān)，表明總黃酮濃度也是影響抑菌效果的重要因素之一[15]。進(jìn)一步用聚酰胺對所得高抑菌活性的黃酮組分進(jìn)行富集，結(jié)果顯示總黃酮純度由17.8%提高到64.2%，顯示聚酰胺樹脂純化血人參總黃酮效果良好。對4種受試菌株采用平板二倍稀釋法，將富集前后的黃酮組分的MIC進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，與其純度呈正相關(guān)，表明提高血人參黃酮純度可以增強(qiáng)抑菌活性；對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌有更明顯的抑制作用，與革蘭氏陽、陰性菌的抑菌活性強(qiáng)弱并無一致，這可能與植物來源和黃酮結(jié)構(gòu)有關(guān)[16-17]。

以上研究結(jié)果證實(shí)血人參中富含的黃酮類化合物是其潛在抑菌活性成分。鑒于此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可利用植化手段并對血人參化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定和組分分析，進(jìn)一步明確血人參中抑菌的主要活性成分，并探究其作用機(jī)制。