黔東南道地黃精總黃酮的超聲輔助提取工藝研究*

龍杰鳳，胡秀虹，周邦華，韋國蘭，王 翔，2

(1凱里學(xué)院，貴州 凱里 556011；2黔東南民族藥綜合利用工程技術(shù)研究中心，貴州 凱里 556011)

黃精為百合科(Liliaceae)黃精屬(PolygonatumMill.)多年生草本植物，其根狀莖入藥[1]。在第四次全國中藥資源普查中發(fā)現(xiàn)，貴州黔東南黃精蘊藏量大，野生植物資源豐富，藥用價值高，黃精是2015版《中國藥典》收錄的重點藥材[2]，貴州苗族用其根莖主治發(fā)熱感冒咳嗽，民間藥用種類大約有十幾種[3]；中醫(yī)常用黃精降血糖、降血脂、抗炎抗菌、延緩衰老、調(diào)節(jié)免疫力等[4]。現(xiàn)代研究表明黃精富含黃精多糖、皂苷、黃酮、蒽醌類等藥用成分[5-8]，Yu H S等[9]從黃精中分離鑒定了甘草素、新異甘草苷、異甘草素等多種黃酮類成分，何蘭香等人[10]用酶法-超聲提取黃酮的最佳提取條件：纖維素酶的用量為0.75%，乙醇濃度為40%，液料比為20∶1，超聲時間30 min，總黃酮含量為1.595%；雖然貴州黔東南的黃精蘊藏量大且藥用歷史悠久，但是對該藥材藥用成分及提取工藝研究尚不充分，黔東南黃精總黃酮的超聲提取及含量測定未見相關(guān)報道，基于黔東南豐富的黃精野生資源及黃酮的重要作用，對其提取工藝的研究勢在必行。本文主要對黔東南黃精中總黃酮的超聲提取工藝進行試驗探究，選出最佳提取工藝，測定其含量。

1 材料與試劑

1.1 實驗材料

實驗用黃精藥材采集于貴州省黔東南州的鎮(zhèn)遠縣、黃平縣、丹寨縣、黎平縣、雷公山，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)王波老師鑒定為黃精的根狀莖，黃酮對照品蘆丁采購于成都華康生物工程有限公司。

1.2 實驗試劑與儀器

亞硝酸鈉、氯化鋁、無水乙醇(重慶川江化學(xué)試劑廠)；硝酸鋁、氫氧化鈉(廣東汕頭市西隴化工廠)；高速萬能粉碎機(北京科偉永興儀器有限公司)；暗箱三用紫外線分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)；紫外-可見光光譜儀2550(日本島津)；超聲儀(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)；循環(huán)水真空泵(上海申光儀器儀表有限公司)。

2 實驗方法

2.1 黃精藥材的處理

將黃精根狀莖洗凈切片后，置于恒溫干燥箱60 ℃保持24 h除去水分烘干，待冷卻后取出，粉碎過40目篩，備用。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

精密稱量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品50.0 mg，置于25 mL的容量瓶中，加適量乙醇溶液溶解，室溫放冷，再加乙醇定容，搖勻，再精密量取10 mL蘆丁溶液至100 mL 的容量瓶中，加水搖勻定容，得到0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。參照《中國藥典》，準(zhǔn)確量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL置于10 mL的容量瓶中，分別在標(biāo)簽上寫上1到6組，每個量瓶中加入0.4 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻，放置6 min后；加入0.4 mL 10%硝酸鋁，搖勻，放置6 min，最后加入4 mL 40%氫氧化鈉，加水定容至刻度，搖勻，放置15 min。

2.3 樣品的提取制備

稱定黃精粉末2.0 g置入圓底燒瓶中，加入60%乙醇，料液比1∶10，溫度50 ℃ ，保鮮膜封口，超聲時間25 min，經(jīng)冷卻、過濾、收集濾液，作為樣品溶液。

2.4 黃酮薄層色譜的制備

取硅膠G薄層板在120 ℃活化2 h，冷卻待用，黃精提取液為供試液，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液為對照液，以V(三氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶1為展開劑，在紫外光燈365 nm下檢視。

2.5 紫外波長的選擇

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液在紫外分光光度儀(島津UV-2550)下進行3次光譜測定，均在512 nm處出現(xiàn)最大吸收峰。

2.6 提取工藝設(shè)計

用超聲輔助提取法，對黃酮提取的影響因素主要有以下4種：提取溫度、料液比、體積分?jǐn)?shù)、提取時間，通過單因素實驗設(shè)計正交實驗，考察4種因素的影響。首先實驗設(shè)定提取溶劑為無水乙醇，提取溫度為60 ℃，提取時間為1 h，料液比為1∶10，溶劑體積分?jǐn)?shù)60%，改變其中的某一個因素，固定其他因素。

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性關(guān)系與薄層色譜

3.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁的吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品各濃度的吸光度測定結(jié)果見表1，在512 nm處蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=56.686x-0.0018，R2=0.9996。結(jié)果表明，在0.002～0.010 mg/mL的范圍內(nèi)，吸光度與總黃酮濃度呈良好的線性關(guān)系，見圖1。

表1 512nm處蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品各含量的吸光度測定結(jié)果Tab.1 Absorbance determination results ofstandard rutin at 512 nm

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Rutin standard curve

3.1.2 薄層色譜結(jié)果

分別用毛細管蘸取對照品與供試品樣品液各10 mL，點樣于在120 ℃活化2 h的硅膠G薄層板，點樣編號為1至6，其中1、2為對照品，3、4、5、6為供試品，以V(三氯甲烷)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶1為展開劑，展開約至8 cm時取出，用吹風(fēng)機吹干，噴三氯化鋁試液，吹干，在紫外光燈365 nm下檢視，可以看見對照品與供試品在相應(yīng)的位置下顯示相同的黃綠色斑點，但供試品黃綠色斑點較淡，說明總黃酮含量較低，其結(jié)果見圖2。

圖2 蘆丁薄層色譜圖Fig.2 Thin layer chromatogram of rutin

3.2 單因素實驗結(jié)果與分析

3.2.1 不同料液比對黃精總黃酮提取率的影響

精密稱取2.0 g黃精粉末5份，在溫度60 ℃、體積分?jǐn)?shù)60%條件下提取15 min，共設(shè)置5個分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的料液比，固定其他因素不變，計算總黃酮的含量，結(jié)果見表2和圖3。

表2 料液比對總黃酮提取率的影響Tab.2 Effect of material liquid ratio on the extractionrate of total flavonoids

圖3 料液比對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of material liquid ratio on theextraction rate of total flavonoids

3.2.2 不同體積分?jǐn)?shù)對黃精總黃酮提取率的影響

精密稱取2.0 g黃精粉末5份，在溫度60 ℃、料液比1∶10、提取時間15 min條件下，共設(shè)置5個分別為60%、70%、80%、90%、100%的乙醇體積分?jǐn)?shù)，固定其他因素不變，計算總黃酮的提取率，結(jié)果見表3和圖4。

表3 體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響Tab.3 Effect of volume fraction on the extractionrate of total flavonoids

圖4 體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of volume fraction on the extractionrate of total flavonoids

3.2.3 不同超聲提取時間對黃精總黃酮提取率的影響

精密稱取2.0 g黃精粉末5份，在溫度60 ℃、料液比1∶10、體積分?jǐn)?shù)60%的條件下，分別提取15 min、30 min、45 min、60 min、75 min，固定其他因素不變。計算總黃酮的提取率，結(jié)果見表4和圖5。

表4 超聲時間對總黃酮提取率的影響Tab.4 Effect of ultrasonic time on the extractionrate of total flavonoids

圖5 超聲時間對總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the extractionrate of total flavonoids

3.2.4 不同提取溫度對黃精總黃酮提取率的影響

分別精密稱取2.0 g黃精粉末5份，在料液比為1∶10、體積分?jǐn)?shù)60%、提取時間15 min條件下，分別設(shè)定提取溫度為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃，固定其他因素不變。計算總黃酮的提取率，結(jié)果見表5和圖6。

表5 提取溫度對總黃酮提取率的影響Tab.5 Effect of extraction temperature on the extractionrate of total flavonoids

圖6 提取溫度對總黃酮提取率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on theextraction rate of total flavonoids

3.3 黃精總黃酮提取工藝的正交試驗

由上述單因素實驗結(jié)果可知，對每一個實驗變量選定3個水平4個因素，進一步探討在相近的實驗條件下更加精準(zhǔn)的控制實驗變量，以求最佳得率，優(yōu)選最優(yōu)工藝，即水平與因素表見表6。

表6 水平與因素表Tab.6 Table of levels and factors

根據(jù)上述所設(shè)計的因素水平，設(shè)計以L9(34)為正交試驗方案提取黃精總黃酮，且每組實驗都在相同的條件下重復(fù)3次提取，操作步驟與單因素實驗步驟一樣，優(yōu)選出黃精總黃酮提取工藝的優(yōu)化條件，其正交實驗結(jié)果見表7。

表7 L9(34)正交試驗結(jié)果Tab.7 Results of L9(34) orthogonal test

根據(jù)正交試驗表R值可知，影響黃精總黃酮提取率的因素強度為：料液比(D)>提取溫度(A)>體積分?jǐn)?shù)(C)>提取時間(B)，故以超聲波提取黃精總黃酮最佳的提取工藝為A2B2C3D1，即提取溫度70 ℃、超聲時間45 min、乙醇濃度80%、料液比1∶5，則總黃酮的提取率為1.23%，含量為2.46 mg/g。

3.4 正交試驗的驗證實驗

按照優(yōu)化得到的提取工藝，進行驗證實驗。結(jié)果顯示，驗證實驗的均值含量均高于正交實驗表中的各個實驗號，說明提取工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好。見表8。

表8 驗證實驗結(jié)果Tab.8 Verification of experimental results

3.5 穩(wěn)定性實驗驗

取正交實驗A2B2C3D1所得的供試品溶液，分別在0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h測定其濃度與吸光度，計算RSD=0.97%，其結(jié)果表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

4 結(jié)論與討論

本實驗研究利用超聲波法從黃精中提取總黃酮化合物的工藝，考察了提取溫度(A)、提取時間(B)、體積分?jǐn)?shù)(C)、料液比(D)4個因素對總黃酮提取率的影響，并通過正交試驗得出最佳工藝。結(jié)果表明，4個因素對黃精總黃酮得率的影響強度為D>A>C>B，最佳工藝以料液比為1∶5、提取溫度為70 ℃、乙醇濃度為80%、提取時間為45 min，此時總黃酮含量為2.46 mg/g。