α-黑素細胞刺激素對烏骨雞黑色素合成影響研究進展

熊江燕，鄭娟霞，王琤韡＊

（江西科技師范大學生命科學學院，南昌 330013）

烏骨雞別稱泰和雞、烏雞等，具有毛腳、烏皮、烏骨和烏肉等眾多特點，是傳統(tǒng)中醫(yī)藥認為的我國特有的藥食兩用雞種。臨床試驗證明，烏骨雞能提高機體腎上腺皮質(zhì)、垂體組織的機能，提高血細胞的含量并增強血紅素的相關(guān)性能，其主要原因在于其存在的黑色素，黑色素分為脫黑色素、真黑色素以及異黑色素三類，是一種在主體吲哚環(huán)四周連接著芳香化合物及烯烴化合物或基團的化合物，烏骨雞體內(nèi)色素為真黑色素。烏骨雞黑色素具備眾多生理功效，如可以清除自由基達到抗氧化效果，并可以減緩機體衰老以及防紫外線、防誘變等[1-3]。且黑色素沉積越深，藥用價值越佳。黑色素以絡氨酸作底物通過一系列復雜的化學反應合成，α-黑素細胞刺激素（α-MSH）是一類可與黑素細胞表面受體結(jié)合作用，促進絡氨酸的合成分泌，并促進黑素細胞產(chǎn)生樹突的神經(jīng)內(nèi)分泌激素。此外，α-MSH還能促進黑素細胞增殖，在黑色素合成過程中具有重要作用[4]。本文綜述了α-MSH 對黑色素合成的影響，以期為烏骨雞黑色素相關(guān)研究提供一定理論依據(jù)。

1 α-MSH概況

1.1 α-MSH的產(chǎn)生及結(jié)構(gòu)

阿黑皮素原（POMC）激素是α-MSH 的前體，垂體是初次檢測出含POMC 的部位，近年來研究者在免疫細胞、皮膚、腦等組織器官也檢測到存在POMC。POMC 主要在腦垂體分泌，促腎上腺皮質(zhì)素（ACTH）通過釋放因子誘導POMC mRNA在細胞和組織中表達，而后ACTH 在促腎上腺皮細胞中表達并發(fā)生水解作用，促腎上腺皮細胞位于垂體前葉，其反應一條途徑水解為ACTH，另一條途徑水解產(chǎn)物先是β-促脂解素（LPH）而后經(jīng)轉(zhuǎn)化為β-內(nèi)啡肽最終生成β-MSH[5]。酶繼續(xù)催化ACTH，直至其降解為α-MSH（見圖1）。目前已知三類不同構(gòu)型的MSH神經(jīng)內(nèi)分泌激素，其表達與功能均不盡相同，包括α、β以及γMSH。其中由絲-酪-絲-蛋-谷-谷-苯丙-精-色-甘-賴-脯-纈等13 個氨基酸構(gòu)成的α-MSH 含量最高，這13 個氨基酸又來源于POMC分子中39個氨基酸的第1至13 位氨基酸，且研究發(fā)現(xiàn)，在促黑色素細胞中α-MSH 具備黑素活性的最小單位是其中的第4至10 位氨基酸[7]。當α-MSH 的某幾位氨基酸被替換后，會產(chǎn)生多種與α-MSH 有著相同作用，而對受體親和性不同的α-MSH類似物。

1.2 α-MSH受體

在近年來α-MSH的研究中，發(fā)現(xiàn)并克隆出了5種α-MSH的受體（MCR家族），α-MSH在不同組織中通過其特異性以Ca2+依賴方式發(fā)揮作用。MCR家族均為G蛋白偶聯(lián)受體，該受體共同特點為其立體結(jié)構(gòu)中都有七個跨膜α 螺旋，包括MC1R-MC5R[8]。其中MC2R 是ACTH 的受體，分布于腎上腺皮質(zhì)，只對ACTH有親和力，能結(jié)合大部分的粗黑激素肽[9]，而其余受體均對MSH 表現(xiàn)出不同程度的親和力，且在腦內(nèi)均有表達。MC1R 主要分布在中性粒細胞、單核巨噬細胞及外周的黑素細胞，具有與α-MSH和ACTH同等的親和力；MC3R、MC4R的表達主要于腦組織進行，且MC4R 對MSH 具 有 特 異 性；MC5R 則 結(jié) 合ACTH、α-MSH 主要分布在腎上腺、胃及脾臟等。研究發(fā)現(xiàn)，黑皮素類受體MC1R 對皮膚黑色素沉著有調(diào)控作用，其含有317 個氨基酸和7 個跨膜蛋白，且MC1R 的遺傳突變因子決定了MC1R 的功能，MC1R 在不同細胞上的表達存在差異。MC1R 可在黑素細胞中進行表達，當MC1R 作為相關(guān)受體與α-MSH 進行連接，MC1R 即可受到一定刺激而被活化，且和G 蛋白偶聯(lián)能提升環(huán)磷酸腺苷（cAMP）含量[10]。

圖1 α-MSH合成具體過程[6]

2 α-MSH與黑色素合成

黑色素的結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)一致，Raper 等最先提出其合成具體生化反應過程，而后科學家們進一步將簡單理論系統(tǒng)地完善[11]。第一步反應是絡氨酸被決定該反應速度的關(guān)鍵酶絡氨酸酶（TYR）催化，作用后產(chǎn)物氧化為多巴（Dopa），TYR 繼而使Dopa氧化為多巴醌（DQ），DQ通過多聚化反應產(chǎn)生活性極高的無色多巴色素，多聚化反應物包括DQ、無機離子、氨基化合物及還原劑等。而余下的DQ易將活性高的無色多巴色素催化氧化為多巴色素（DC），這一過程非?？焖賉12]。而后與多巴色素異構(gòu)酶反應，反應有羥化和脫羧兩條途徑，羥化產(chǎn)生5，6-二羥基吲哚羧酸（DHICA）可與自身或與醌、醇結(jié)合產(chǎn)生真黑素，而脫羧不會直接合成真黑色素，而是合成一個前體，反應先產(chǎn)生5，6-二羥基吲哚（DHI），經(jīng)過TYR的作用即合成IQ，IQ 也稱5，6-吲哚醌。在黑色素合成過程中，體內(nèi)的細胞因子、各類激素及外界環(huán)境均會對其生物合成產(chǎn)生影響。研究證明，α-MSH可調(diào)控黑素細胞增生與合成，通過激活MC1R 后參與cAMP/PKA信號轉(zhuǎn)導途徑。首先在α-黑素細胞刺激素作用下黑素細胞特異性連接MC1R，再通過G 蛋白耦聯(lián)環(huán)磷酸腺苷信號通路，一方面可激活腺苷酸增加cAMP含量并提高絡氨酸酶的分泌水平促進合成黑色素的反應效率。Busca等[13]表明，cAMP在促進黑素生成的途徑中涉及到了磷酸化轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶A，反應過程可上調(diào)TYR 的表達水平，提高MITF含量，且反應時優(yōu)先推進真黑素的產(chǎn)生。而與此同時α-MSH 會使蛋白脂酶的C 細胞信號途徑激活，從而在黑素合成時調(diào)控信號通路與信號蛋白的多酶級聯(lián)作用。

3 α-MSH對黑色素合成的調(diào)控

3.1 介導紫外線的誘導作用

大量實驗表明，紫外線（UV）在誘導黑色素沉積方面非常關(guān)鍵，主要通過cAMP 通道的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物MC1R介導發(fā)揮作用。一方面α-MSH可以作為UV 誘導黑色素合成的旁分泌介導物，同時對UV對于黑素細胞樹突的影響有調(diào)節(jié)作用；另一方面UV 能促進黑素細胞及角朊細胞上MC1R 的功能表達，從而增加α-MSH 與MC1R 的協(xié)同性[14]。此外，UV會介導黑素細胞停滯于G1期，而α-MSH可促使其克服，并引起G2期變長細胞數(shù)目變多，而G2時期的黑素細胞可分泌MC1R，促進α-MSH的作用，并介導UV合成黑色素。黑素細胞、角質(zhì)形成細胞在UV 誘導下均能刺激分泌α-MSH 和ACTH 等，從而促進MC1RmRNA 的表達，上調(diào)細胞對POMC 相關(guān)肽的反應性；同時MC1R 被α-MSH 及ACTH 激活后可擴增UV 的生物信號。亦有學者分析，UV 照射可促進α-MSH 與細胞表面的受體結(jié)合，提高絡氨酸酶的活性，此外UV照射能使α-MSH 細胞內(nèi)在結(jié)合位點下降而外在結(jié)合位點上升。其機制存在兩種可能，其一，UV加強細胞內(nèi)MC1R 再分布于細胞外，阻止細胞表面受體內(nèi)在化；其二，紫外線能促進α-MSH 及其它蛋白結(jié)合自身靶細胞的作用，且細胞經(jīng)UV 照射由于其內(nèi)在MC1R 閉合使得其與α-MSH、相關(guān)蛋白的結(jié)合受到阻礙，或者UV對細胞內(nèi)MC1R具有無特異性蛋白水解作用[15]。以上表明，α-MSH與MC1R 及UV 在參與調(diào)節(jié)合成黑色素時具有協(xié)同作用，且在角質(zhì)形成細胞及表皮細胞中不僅具備自分泌網(wǎng)絡，還具有旁分泌網(wǎng)絡，其調(diào)節(jié)機制同時擁有正反饋和負反饋。

3.2 促進黑色素細胞增殖

合成黑色素的反應在黑色素細胞黑素體中進行，神經(jīng)嵴是黑素細胞生長發(fā)育的場所，成黑素細胞需先經(jīng)過神經(jīng)嵴再遷移至特定靶位點。就皮膚色素而言，成黑素細胞在表皮和發(fā)囊分化成熟，后黑色素細胞延伸形成樹突，合成黑色素所需的黑素體由樹突頂供給，黑素體進入表皮細胞后產(chǎn)生黑色素[16]。近來研究表明，α-MSH能調(diào)控黑素細胞樹突增生，在黑素細胞和角質(zhì)形成細胞之間樹突作為轉(zhuǎn)運黑素小體的橋梁并刺激其加速，此外樹突伸長的黑素細胞具有更高的存活率，而接著經(jīng)反饋調(diào)節(jié)亦可促進黑色素的分泌[17]。其機制普遍接受的是，α-MSH 可上調(diào)細胞內(nèi)能與GTP-結(jié)合蛋白Rho及Rac發(fā)生反應的cAMP的含量，從而使黑素細胞肌動蛋白纖維重新組合改善其無序性，促進黑素細胞樹突形成，且與此同時，cAMP 還發(fā)揮了阻礙PI3K 信號通路傳導的作用[18]。亦有學者分析，對形成樹突及合成黑素細胞有促進作用的因子活化下游信號，是首先結(jié)合有關(guān)糖蛋白到達細胞中再介導相關(guān)結(jié)合位點，進而促進黑素細胞的生長發(fā)育[19]。Hiramoto 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)α-MSH 處理后TYR 活性有顯著提高，并提高了TPR1和TPR2蛋白表達水平，且α-MSH的劑量與黑色素細胞的增值率呈線性相關(guān)，隨α-MSH 濃度增加黑色素細胞的增值率先升高后下降。然而，Halaban[21]表明，當含有促分裂劑，α-MSH 僅是在短時間內(nèi)促進正常黑色素細胞基因的表達，而對增加黑素細胞的數(shù)量并無效果。

3.3 保護黑素細胞

α-MSH在促進黑素合成的同時，也是一種具有抗炎性細胞因子效應的內(nèi)源性神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)肽，能緩解細胞受到毒性的損傷，此外還可促使黑素細胞分泌NO以阻礙有害因子對細胞個體之間粘連的促進作用。已知α-MSH 除與外周炎性細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞表面的MCR 受體直接結(jié)合調(diào)節(jié)外周炎癥和控制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥外，α-MSH還可在中樞神經(jīng)系統(tǒng)對炎癥的調(diào)節(jié)下，進一步對外周神經(jīng)發(fā)揮抗炎效果。除通過調(diào)控炎癥保護黑素細胞外，α-MSH還能保護黑素細胞免受超氧化物的損害。由于絡氨酸酶合成黑色素底物需利用超氧化物，然表皮黑素細胞抗氧化酶水平較低，且產(chǎn)生的超氧化物較多，易受到氧化損害。實驗發(fā)現(xiàn)，在羊駝黑色素細胞培養(yǎng)基中添加含量有差異的α-MSH，結(jié)果顯示其與MC4R 作用后可下調(diào)NOS2 的水平，下調(diào)程度和α-MSH 含量呈線性關(guān)系[22]。α-MSH和NO均對黑色素產(chǎn)生有誘導作用，NO是一類活性分子，由黑素細胞經(jīng)α-MSH誘導產(chǎn)生，但NO同時與超氧化物反應，產(chǎn)生的羥基基團及過氧亞硝酸鹽會對細胞造成損害，可誘導細胞凋亡[23]。而當α-MSH分泌水平提高，可下調(diào)NOS2的產(chǎn)生，從而使NO含量減少，抑制細胞發(fā)生病變及死亡。

3.4 與刺鼠信號蛋白相互拮抗

刺鼠信號蛋白（ASIP）由乳頭狀細胞所分泌的信號蛋白，而乳頭狀細胞與黑色素細胞相鄰近，其編碼通過刺鼠基因位點完成，基因表達后可合成具有131個氨基酸的ASIP，而ASIP的表達可合成暗黑素[24]。因MC1R同時是α-MSH和刺鼠信號蛋白的受體，故對其親和力類似。Swope等[25]向培養(yǎng)液添加利用重組DNA 技術(shù)并除去其余雜質(zhì)與其它蛋白的ASIP 刺激黑素細胞，發(fā)現(xiàn)ASIP可直接作用于受體MC1R，使培養(yǎng)液中cAMP含量降低，進一步導致TYR 活性下調(diào)，其下調(diào)程度與ASIP 劑量呈明顯相關(guān)；此外，絡氨酸酶相關(guān)蛋白1、2活性受到抑制，且暗黑色素合成顯著增多，而真黑色素顯著降低，暗黑素約占總黑素的91%。由此可知，α-MSH對ASIP有拮抗作用，ASIP可與α-MSH競爭結(jié)合MC1R，降低cAMP的含量，進而通過級聯(lián)反應抑制真黑色素的合成，最終影響真黑素與褐黑素水平的比例，影響動物皮膚的顏色和毛色。同時，刺鼠信號蛋白會阻礙α-MSH 和MC1R 的聯(lián)結(jié)反應，同理α-MSH 對刺鼠信號蛋白和MC1R 之間的連接也有抑止作用，即刺鼠信號蛋白、α-黑素細胞刺激素及MC1R之間的聯(lián)結(jié)是相互排斥的。有學者推測其可能是受體結(jié)合某一配基后，該受體的立體異構(gòu)將會產(chǎn)生差異，從而阻礙了另一配基結(jié)合受體，這種排斥作用導致其生物學作用的發(fā)揮無法正常進行。然而，即使ASIP刺激黑素細胞后弱化了TYR的表達，但TYR的合成分泌能力并沒有完全喪失，因為暗黑素的合成也離不開TYR的催化作用，故從另一個角度看，ASIP結(jié)合受體MC1R后具有減弱α-MSH過度促進黑色素合成的效果，使生成黑色素的類型發(fā)生變化，以減弱黑色素的沉積。

3.5 提高MC1R、MITF和TYR基因表達量

MC1R 受體可被α-MSH 激活，TYR 是產(chǎn)生黑色素的反應限速酶，而小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）基因定位于3號染色體上，其表達過程有多個啟動子共同調(diào)控，DNA可轉(zhuǎn)錄形成眾多蛋白異聚體復合物，其中MITF-M 對黑色素細胞質(zhì)的表達具有特異性[26]。于志慧等[27]研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的TYR、MC1R 及MITF 基因表達水平隨α-MSH濃度增高而上升，且黑素細胞形成樹突與α-黑素細胞刺激素和MC1R的連接、參與TYR途徑及調(diào)控小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等均密切相關(guān)。小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和酪氨酸酶mRNA在皮膚中的表達量最高，而在肌肉組織中表達含量最低，其中腎臟表達含量又高于肌胃，肌胃高于肝臟，此結(jié)果大致與烏骨雞各組織黑色素沉積含量的規(guī)律相符合。在黑色素細胞生長過程中涉及轉(zhuǎn)錄因子MITF 的參與并發(fā)揮關(guān)鍵作用，α-MSH 刺激MC1R、MITF 的表達有上調(diào)cAMP 信號通路及MAPK 級聯(lián)反應兩種方式，后者可推進相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子磷酸化后經(jīng)MITF轉(zhuǎn)錄因子作為媒介與轉(zhuǎn)導，最后作用于TYR基因家族的啟動子特定區(qū)域，參與調(diào)控黑色素的合成。鄭嫩珠等[28]也指出促進黑素生成的cAMP 途徑，這一連串反應有磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶A 的參與，促進了MITF 及TYR 的合成與分泌。由此可知，α-MSH 在黑色素合成過程中刺激MC1R 與G 蛋白耦聯(lián)經(jīng)cAMP信號途徑，可上調(diào)MITF基因和蛋白表達水平，而MITF 在調(diào)節(jié)TYR 的合成與分泌過程中具有重要作用，進而通過調(diào)控TYR在黑色素細胞的表達介導黑色素合成。

4 抑制α-MSH作用的因素

4.1 姜黃酮

芳香（ar）姜黃酮是一種天然的姜黃油，最初是從姜黃龍眼中分離出來的，幾個世紀以來在東南亞一直被用作藥物和食物。研究證明，芳香（ar）-姜黃酮對B16F10 黑色素瘤細胞中α-MSH和3-異丁基-1-甲氧基-氨酸（IBMX）誘導的黑色素生成和信號通路有抑制作用[29]。其結(jié)果顯示α-MSH 和（IBMX）可刺激B16F10 細胞中絡氨酸酶及其多種相關(guān)蛋白如TRP-1 的表達，而芳香（ar）-姜黃酮對其表達水平有抑制作用。且ar-姜黃酮可通過抑制α-MSH刺激的B16F10細胞中環(huán)腺苷酸反應元件結(jié)合蛋白的活性，強烈抑制了α-MSH 和IBMX 誘導的微鄰苯二甲酸鹽相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。Bonhee 等[30]指出，四氫姜黃素也可減弱α-MSH在B16F10細胞中對黑素合成的促進作用，下調(diào)絡氨酸蛋白和MITF表達水平，并使絡氨酸酶活性降低。此外，與姜黃素相比，ar-姜黃酮具有更佳的抑制作用。

4.2 乙醇提取物

近年來，海洋自然資源因其成分多樣化和綠色安全特性，已經(jīng)被廣泛應用開發(fā)到藥物、食品及畜牧等行業(yè)。褐藻是已知的具有豐富化合物的藻類，從褐藻中提取的乙醇提取物（ESS）可顯著減少黑色素合成α-MSH 刺激B16F10 細胞。Mohammed等[31]分析，ESS可通過環(huán)磷腺苷小分子在細胞內(nèi)傳遞相關(guān)信息，下調(diào)CREB蛋白的表達，CREB 可參與介導的小鄰苯二甲酸基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)其表達水平，從而減弱促黑素酶、TYR、TRP-1 的表達，同時抑制cAMP 的積累、抑制CREB 磷酸化。并且，EPK 是細胞外表達的調(diào)節(jié)信號傳導的相關(guān)酶，ESS 可使ERK 活化，而不能使Akt 和其它蛋白激酶得以活化，后者負責翻譯后降低MITF 表達水平。因此，ESS 減弱α-MSH刺激B16F10 細胞色素沉著過的是通過調(diào)制分子ERK信號通路[32]。

4.3 lpa-miR-nov-66

MicroRNAs(miRNAs)為一種參與調(diào)控生物體合成的內(nèi)部因素合成的非編碼核糖核酸，普遍分布于真核生物中，其中最新研究發(fā)現(xiàn)的miRNAs對機體分泌黑色素非常關(guān)鍵，在黑色素的產(chǎn)生及沉積為顆粒過程中亦發(fā)揮重要功能。姬凱元等[33]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中單獨添加α-MSH可降低內(nèi)源性lpa-miR-nov-66的表達水平。可溶性鳥氨酸環(huán)化酶（sGC）對GTP 轉(zhuǎn)化為cGMP 有催化作用，是lpa-miR-nov-66 的靶基因之一，并提供了一個重要的第二信使cAMP 參與調(diào)解蛋白激酶、磷酸二脂酶和離子通道[34]。研究表明，lpa-miR-nov-66導入外源DNA 轉(zhuǎn)化后結(jié)合α-MSH 較于只用α-MSH 處理，TYRP2 的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平升高，而TYR、MITF 在編碼合成過程中的表達都較弱，使得cAMP的產(chǎn)量及黑色素合成含量下降。并得出結(jié)論，miRNAs 抑制α-MSH 在推進合成黑色素的表達是通過調(diào)節(jié)黑色素細胞中重要的cAMP路徑實現(xiàn)的。

5 結(jié)語與展望

在烏骨雞體內(nèi)，α-MSH 可與MC1R 結(jié)合、介導黑色素合成相關(guān)信號傳導過程，通過與紫外線協(xié)同作用、促進黑色素細胞增殖、保護黑素細胞、與刺鼠信號蛋白相互拮抗等多種途徑參與調(diào)控烏骨雞黑色素的合成，姜黃酮、乙醇提取物及l(fā)pa-miR-nov-66 等可抑制α-MSH 的促進作用。而烏骨雞黑色素是滋補、防衰老及強身健體的物質(zhì)，研究α-MSH對烏骨雞黑色素合成機制的影響有利于促進黑色素沉積，但目前烏骨雞黑色素的合成與作用機制尚未完全明確，對烏骨雞黑色素的加工水平還停留在酶解技術(shù)。若未來從其分子量、結(jié)構(gòu)及功能等分子理論水平著手對烏骨雞黑色素合成過程、沉積機制及提取技術(shù)開展更深入地研究，相信會更有利于發(fā)掘利用其入藥功效及食用價值。烏骨雞黑色素不僅可以用于別的黑色食品中為其提高色澤效果，而且還能加工成新興的具有保健功效的食品與飲料，推動黑色食品的發(fā)展。