大孔樹(shù)脂純化密花香薷總黃酮工藝研究

石子林，李軍喬，王雅瓊，馬新虎，侯 琴

(1.青海民族大學(xué)a.青藏高原蕨麻研究中心,b.生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院,c.經(jīng)濟(jì)與管理學(xué)院,中國(guó) 西寧 810000; 2.青海省特色經(jīng)濟(jì)植物高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó) 西寧 810000 )

密花香薷(ElsholtziadensaBenth.)為唇形科(Labiatae)香薷屬植物，又稱咳嗽草、蟋蟀巴等，民間常作為茶葉以及草藥使用，為藥食兩用植物[1]。其主要分布于甘肅、青海、四川、云南、西藏等海拔2 800～4 100 m 的地區(qū)[2]。密花香薷利水消腫，具有治療胃病、發(fā)熱無(wú)汗等功效，富含揮發(fā)油、黃酮、多糖等化學(xué)成分[3，4]。目前，對(duì)密花香薷揮發(fā)油類(lèi)研究較多，但總黃酮類(lèi)報(bào)道較少，尚無(wú)對(duì)密花香薷全草總黃酮分離純化的報(bào)道。

目前常用超臨界流體色譜(SFC)[5]、制備型高效液相色譜(HPLC)[6]、高速逆流色譜[7]、分子蒸餾技術(shù)[8]以及大孔樹(shù)脂吸附等來(lái)分離純化中藥材中的各類(lèi)化學(xué)成分。其中大孔樹(shù)脂吸附相較于其他幾種而言，有吸附時(shí)間較短、吸附樣品較多、純化效果較好、可再生、操作較為簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)[9，10]，被廣泛運(yùn)用于中藥材中黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、萜類(lèi)以及皂苷等物質(zhì)的分離純化[11-14]。

密花香薷在田間常被當(dāng)做雜草，但含有豐富的黃酮類(lèi)物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)基于包錦淵提出的密花香薷全草總黃酮提取的最優(yōu)工藝條件[15]，對(duì)提取物進(jìn)行分離純化，以提高密花香薷全草提取液中總黃酮的含量，為密花香薷全草總黃酮類(lèi)成分的藥理活性的研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Neofuge23R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(上海力申科學(xué)儀器有限公司)、UV-5500型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)、HZQ-X160恒溫震蕩培養(yǎng)箱(蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、BT102S微型蠕動(dòng)泵(保定雷弗流體科技有限公司)、EPED-20TH實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器(南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司)、eppendorf移液槍(EPPENDORF)。

密花香薷于2019年7月采自青海省西寧市湟源縣牧場(chǎng)村蕨麻種植基地，經(jīng)青海民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院李軍喬教授鑒定為唇形科香薷屬植物密花香薷。B20771-蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%)；乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、鹽酸(天津市大茂化學(xué)試劑廠，均為分析純)；D101，AB8-8，NKA-9，S-8，HPD-100及DM130型大孔樹(shù)脂(廊坊淼陽(yáng)化工有限公司)；純水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

2 方法

2.1 密花香薷全草總黃酮的測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱量干燥到恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用70%乙醇(體積分?jǐn)?shù))溶解定容至50 mL，搖勻即得0.4 g·L-1蘆丁對(duì)照品溶液。

2.1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密移取1，2，4，6，8，10 mL對(duì)照品溶液于25 mL容量瓶中，分別加入70%乙醇6 mL及5%亞硝酸鈉溶液1 mL,搖勻，靜置6 min后加10%硝酸鋁溶液1 mL ，搖勻，靜置6 min后加4%氫氧化鈉溶液10 mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻靜置15 min。以空白樣做對(duì)照，于510 nm處測(cè)吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為：y=0.007x+0.008 7,r2=0.999 6，線性范圍為0.016～0.160 g·L-1。

2.1.3 上樣液的制備 將密花香薷全草自然風(fēng)干至恒重，粉碎后過(guò)0.42 mm篩，精密稱取適量樣品粉末，轉(zhuǎn)移至250 mL燒瓶中，按照包錦淵的最佳提取工藝操作[15]。提取液冷卻后抽濾，濃縮，加純水溶解，離心后取上清液即得。冷藏放置，備用。

2.1.4 總黃酮質(zhì)量濃度的測(cè)定 用70%乙醇稀釋上樣液，并移取1 mL滴加于25 mL容量瓶?jī)?nèi)，按2.1.2的方法顯色后，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線即得溶液中黃酮含有量。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 精密移取5份1.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按2.1.2的方法顯色后，測(cè)得溶液吸光度RSD值為1.18%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取1.0 mL上樣液,按2.1.2的方法顯色后，分別于0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h測(cè)吸光度，測(cè)得其吸光度的RSD值為1.45%，表明上樣液在3.0 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密移取 5份1.0 mL上樣液,按2.1.2的方法顯色后測(cè)其吸光度，測(cè)得溶液吸光度的RSD值為1.54%，說(shuō)明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取 5份1.0 mL上樣液，加入1 mL對(duì)照品試液,搖勻，按2.1.2 的方法顯色，測(cè)完吸光度后得平均回收率為98.68%，RSD值為0.89%。

2.2 樹(shù)脂的篩選

2.2.1 大孔樹(shù)脂預(yù)處理 將各型號(hào)的大孔樹(shù)脂用95%乙醇浸泡24 h，待充分吸脹后，除去小顆粒上浮物，將樹(shù)脂倒入色譜柱(內(nèi)徑30 mm×600 mm)中，用純水淋洗至流出液與水混合無(wú)白色渾濁現(xiàn)象，繼續(xù)用大量純水洗至流出液無(wú)醇味；再分別用4%鹽酸和4%氫氧化鈉溶液洗脫浸泡5 h，用純水洗至中性，備用。

2.2.2 靜態(tài)吸附-解析試驗(yàn) 稱取2.0 g(濕重)已預(yù)處理好的6種型號(hào)大孔樹(shù)脂于150 mL錐形瓶中，加入3.80 g·L-1的上樣液15 mL,封口。在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，于25 ℃，60 r·min-1下吸附24 h。抽濾，取濾液測(cè)其吸光度，計(jì)算吸附率和吸附量。濾出的樹(shù)脂用蒸餾水清洗掉表面殘留的未被吸附黃酮后，置于150 mL錐形瓶中，加25 mL 70%乙醇,封口，其余操作同吸附。測(cè)吸光度，計(jì)算其解吸量和解吸率：

吸附量=(c0-c1)Vy/Ws,吸附率=(c0-c1)/c0，

解吸量=c2·Vx/Ws， 解吸率=c2·Vx/(c0-c1)·Vy。

其中，c0和c1分別為吸附前后樣品溶液中總黃酮質(zhì)量濃度(g·L-1)；c2為解吸后樣品溶液中總黃酮質(zhì)量濃度 (g·L-1)；Vy為上樣液體積 (mL);Vx為解吸液體積(mL);Ws為樹(shù)脂質(zhì)量(g)。

2.2.3 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線 取2.0 g DM130型大孔樹(shù)脂于150 mL錐形瓶中，精密加入2.16 g·L-1上樣液50 mL,在25 ℃，60 r·min-1下吸附24 h，于1，2，3，4，5，6，12，18，24 h時(shí)分別取樣，測(cè)吸附率，平行實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。

2.2.4 靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線 將2.2.3中吸附完全的樹(shù)脂抽濾，純水清洗至流出液無(wú)色后，置于150 mL錐形瓶?jī)?nèi)，加入70%乙醇50 mL，震蕩吸附。后續(xù)操作同2.2.3。

2.3 單因素靜態(tài)吸附試驗(yàn)

2.3.1 上樣液濃度考察 稱取6份處理好的DM130型樹(shù)脂5 g濕法裝柱(色譜柱規(guī)格：內(nèi)徑20 mm×300 mm)，吸取總黃酮質(zhì)量濃度分別為1.19，2.51，3.51，4.61，5.56，6.63 g·L-1且pH為7的上樣液2 BV(18 mL)，流速為2 mL·min-1，測(cè)溶液吸附后吸光度，得最佳上樣液質(zhì)量濃度為3.51 g·L-1。

2.3.2 上樣液pH考察 固定上樣液質(zhì)量濃度3.51 g·L-1，流速2 mL·min-1，加入pH值分別為3，4，5，6，7，8的上樣液2 BV。上樣后，測(cè)溶液吸光度，得最佳上樣液pH值為4。

2.3.3 上樣液流速的考察 固定上樣液質(zhì)量濃度3.51 g·L-1，pH為4,分別以0.5，1，2，3，4，5 mL·min-1流速上樣2 BV后，測(cè)溶液吸光度并結(jié)合實(shí)際操作，取最佳上樣流速為1 mL·min-1。

2.3.4 上樣量的考察(泄露曲線的繪制) 固定上樣液質(zhì)量濃度3.51 g·L-1, pH為4,流速1 mL·min-1上樣7 BV，每1 BV收集一管，測(cè)定每管吸光度，計(jì)算樹(shù)脂吸附率，以流出液濃度達(dá)上樣液濃度的10%左右為泄漏點(diǎn)[16]，得泄漏點(diǎn)為3 BV，從而得出最佳上樣量為3 BV。

2.4 單因素靜態(tài)解析試驗(yàn)

2.4.1 洗脫劑濃度的考察 稱取5份在最佳上樣條件下已吸附完全的樹(shù)脂5 g，裝柱，先用純水洗滌樹(shù)脂上沾有的未被吸附的溶劑，待流出液至無(wú)色后，固定流速4 mL·min-1，洗脫量3 BV，分別以 50%，60%，70%，80%及90%的乙醇洗脫過(guò)柱，收集流出液測(cè)吸光度，計(jì)算其解吸率，得最佳洗脫劑為70%乙醇。

2.4.2 洗脫劑流速的考察 固定洗脫劑為70%乙醇3 BV，以0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL·min-1流速洗脫，收集流出液，測(cè)其吸光度，計(jì)算其解吸率，結(jié)合實(shí)際操作，從而得出最佳流速為1.0 mL·min-1。

2.4.3 洗脫量的考察(洗脫曲線的繪制) 取1份在最佳上樣條件下已吸附完全的樹(shù)脂5 g，裝柱(樹(shù)脂吸附的總黃酮為378.81 mg)，固定洗脫劑為70%乙醇，流速1.0 mL·min-1，每1 BV收集一管，測(cè)其吸光度，計(jì)算洗脫率并繪制洗脫曲線，結(jié)合實(shí)際，確定最佳洗脫量為4 BV。

2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以樹(shù)脂的吸附率為響應(yīng)值，分別選取上樣液濃度(A)，上樣液流速(B)，上樣液pH(C)，3因素為自變量，進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)純化工藝進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)方案如表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表

2.6 數(shù)據(jù)分析

響應(yīng)面試驗(yàn)用Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)，圖形均用Origin 2017制作，表格用Excel 2013處理。

3 結(jié)果

3.1 大孔樹(shù)脂型號(hào)的篩選

大孔樹(shù)脂不同的理化性質(zhì)可顯著影響其吸附、解吸效果，本實(shí)驗(yàn)選用6種不同性質(zhì)的大孔樹(shù)脂試驗(yàn)(吸附和解吸情況見(jiàn)表2)。其中DM130型大孔樹(shù)脂吸附率最高達(dá)87.02%，解吸率達(dá)87.50%，AB-8型大孔樹(shù)脂解吸率最高達(dá)90.06%，但其吸附率只有84.19%。結(jié)合實(shí)際，本實(shí)驗(yàn)選取DM130型大孔樹(shù)脂作為密花香薷全草總黃酮純化的最佳大孔樹(shù)脂。

表2 大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附/解吸能力

3.2 靜態(tài)吸附/解析動(dòng)力學(xué)曲線

3.2.1 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線 由圖1可知，加入樣品溶液后，樹(shù)脂在0～6 h吸附率上升較快，在6～24 h內(nèi)上升較平緩，結(jié)合實(shí)際操作，選擇最佳靜態(tài)吸附時(shí)間為6 h，此時(shí)吸附率為73.47%。

3.2.2 靜態(tài)解吸動(dòng)力學(xué)曲線 由圖2可知，解吸時(shí)間在0～5 h時(shí)樹(shù)脂解吸速率較快，在6～12 h時(shí)樹(shù)脂解吸速率較平緩，結(jié)合實(shí)際操作，靜態(tài)解吸選擇的最佳解吸時(shí)間為5 h，解吸率為80.70%。

圖1 DM130型大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig. 1 Static adsorption kinetics curve of DM130 macroporous resin

圖2 DM130型大孔樹(shù)脂靜態(tài)解析動(dòng)力學(xué)曲線Fig. 2 DM130 macroporous resin static analytical kinetics curve

3.3 最佳上樣液質(zhì)量濃度的確定

當(dāng)上樣液總黃酮濃度逐漸升高時(shí)，吸附率也隨之升高；當(dāng)上樣液中總黃酮質(zhì)量濃度>3.51 g·L-1后，吸附率反而下降，結(jié)果如圖3。證明樹(shù)脂在3.51 g·L-1時(shí)已達(dá)其最大吸附率(88.85%)。

3.4 最佳上樣液pH的確定

當(dāng)上樣液pH為4時(shí)，樹(shù)脂的吸附率達(dá)最高值(89.36%)，當(dāng)pH>4后，吸附率反而下降，結(jié)果如圖4。說(shuō)明上樣液酸性較強(qiáng)時(shí)有利于樹(shù)脂對(duì)密花香薷全草中總黃酮的吸附，當(dāng)酸性偏高或偏低以及偏堿性時(shí)，吸附率也隨之降低。因此上樣液最佳pH值為4,此時(shí)吸附率為89.36%。

圖3 上樣液濃度對(duì)DM130型樹(shù)脂吸附率的影響Fig. 3 Effect of concentration on adsorption rate of DM130 resin

圖4 pH值對(duì)DM130型樹(shù)脂吸附率的影響Fig. 4 Effect of pH value on adsorption rate of DM130 resin

3.5 最佳上樣液流速的確定

當(dāng)上樣液流速逐漸加快時(shí)，吸附率也隨之降低，當(dāng)流速達(dá)0.5 mL·min-1，吸附率到最大值91.24%，考慮到實(shí)際操作，選擇最佳上樣流速為1 mL·min-1。結(jié)果見(jiàn)圖5。

3.6 泄露曲線的繪制

由圖6可知，當(dāng)上樣量為1 BV時(shí)開(kāi)始泄露，當(dāng)上樣量為3 BV時(shí)，泄露的總黃酮質(zhì)量濃度為0.33 g·L-1,即約達(dá)上樣液質(zhì)量濃度3.31 g·L-1的10%，可認(rèn)為此點(diǎn)即為上樣的泄漏點(diǎn)，過(guò)此點(diǎn)后，上樣液泄漏量逐漸上升，結(jié)合實(shí)際操作等情況，選擇最佳上樣量為3 BV。

圖5 上樣液流速對(duì)DM130型樹(shù)脂吸附率的影響Fig. 5 Effect of loading velocity on adsorption rate of DM130 resin

圖6 DM130型大孔樹(shù)脂吸附泄露曲線Fig. 6 Adsorption leakage curve of DM130 macroporous resin

3.7 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)的確定

當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)由50%依次增加到90%時(shí)，洗脫液中總黃酮濃度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)70%時(shí)，出現(xiàn)最大值，即為88.04%，由此可見(jiàn)，70%乙醇即為最佳的密花香薷全草中總黃酮洗脫劑。其結(jié)果見(jiàn)圖7。

3.8 洗脫劑流速的確定

當(dāng)洗脫劑流速逐漸加快時(shí)，洗脫率逐漸降低，當(dāng)洗脫劑流速為0.5 mL·min-1時(shí)，洗脫液中總黃酮達(dá)最大值為91.57%，但結(jié)合實(shí)際操作，選擇1 mL·min-1為最佳洗脫流速，此時(shí)解吸率為90.65%(圖8)。

圖7 洗脫劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)DM130型樹(shù)脂解吸率的影響Fig. 7 Effect of eluent concentration on the resolution of DM130 resin

圖8 洗脫劑流速對(duì)DM130型大孔樹(shù)脂解吸率的影響Fig. 8 Effect of eluent velocity on the resolution of DM130 macroporous resin

3.9 洗脫曲線的繪制

由圖9可知，當(dāng)洗脫量為1 BV時(shí)，洗脫液中總黃酮達(dá)5.669 g·L-1,為洗脫總量的40.41%；當(dāng)洗脫量為2 BV時(shí)，此時(shí)樹(shù)脂已趨近淡黃色，大部分黃酮已被洗脫出，洗脫率為77.43%。出于回收率以及成本的考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇洗脫劑用量為4 BV，此時(shí)的洗脫率為91.85%。

圖9 DM130型大孔樹(shù)脂洗脫曲線 Fig. 9 DM130 macroporous resin elution curve

3.10 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果

通過(guò)軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得吸附率與各因素水平之間的二次多項(xiàng)式方程，吸附率=8.33+32.56A+6.20B+12.44C-0.39AB+0.07AC+0.94BC-4.80A2-5.63B2-1.71C2。

對(duì)上述回歸方程進(jìn)行方差分析，由表4可知，各因素對(duì)吸附率的影響從大到小為：B(上樣液流速)、A(上樣液濃度)、C(pH)?；貧w模型的P=0.003 9 (P<0.01)，說(shuō)明該模型極顯著且響應(yīng)值與試驗(yàn)的各因素存在顯著的線性相關(guān)性，回歸決定系數(shù)R2=0.922 4,說(shuō)明響應(yīng)值的變化有92.24%來(lái)源于所選擇因素的變化。同時(shí)失擬差P=0.191 3 (P>0.05)，影響不顯著，進(jìn)一步表明該回歸方程可較好地描述響應(yīng)值與各因素之間的關(guān)系。綜上，可確定該回歸方程為總黃酮的優(yōu)化提供了一個(gè)較為合適的模型。

通過(guò)響應(yīng)面分析得出，最佳吸附條件為：上樣液質(zhì)量濃度3.51 g·L-1, 流速0.76 mL·min-1,pH值3.92，此時(shí)吸附率為90.22%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，選取上樣液質(zhì)量濃度3.50 g·L-1，流速1 mL·min-1，pH為4。

3.11 驗(yàn)證性試驗(yàn)

根據(jù)上述響應(yīng)面吸附試驗(yàn)結(jié)果，確立最優(yōu)工藝條件，在此條件下進(jìn)行吸附-解吸，測(cè)完溶液吸光度后，再將洗脫液旋干至浸膏，烘干后稱定其質(zhì)量，計(jì)算總黃酮吸附率、解吸率、純度及回收率：

總黃酮純度=ca·Va/ma,總黃酮回收率=mb/mc。

式中，ca為洗脫液中總黃酮質(zhì)量濃度(g·L-1)，Va為洗脫液體積(mL)，ma為洗脫液干燥后的質(zhì)量(g),mb為洗脫液中總黃酮的質(zhì)量(g)，mc為上樣液中總黃酮的質(zhì)量(g)。

上述實(shí)驗(yàn)平行3次。結(jié)果顯示，用上述方法吸附解吸后，吸附率達(dá)89.20%，解吸率達(dá)89.66%，純度由之前的40.96%增至87.94%，回收率為77.85%。

為了更好地反映各因素對(duì)提取率的影響，繪制三維曲面圖(圖10，彩圖見(jiàn)封三)。曲面圖坡度的陡峭程度說(shuō)明該因素對(duì)提取率影響的顯著性，越陡則越顯著。由圖10可知，B(流速)對(duì)提取率的影響最大，A(濃度)次之，C(pH)則最小。

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)結(jié)果

表4 方差分析

4 討論與結(jié)論

黃酮類(lèi)化合物有諸多藥理及生理學(xué)活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗骨質(zhì)疏松、保肝護(hù)肝等。密花香薷全草中黃酮含量較高，具有良好的開(kāi)發(fā)價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)DM130型大孔樹(shù)脂對(duì)密花香薷全草總黃酮進(jìn)行純化，為后續(xù)對(duì)密花香薷深度加工和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

圖10 各因素相互作用對(duì)吸附率影響的響應(yīng)面圖Fig. 10 Response surface polts showing the mutual effects of different factor on the yield of adsorption

本實(shí)驗(yàn)考察了S-8，HPD-100，NKA-9，DM130，AB-8及D101共6種大孔吸附樹(shù)脂對(duì)密花香薷全草中總黃酮的吸附-解吸性能，發(fā)現(xiàn)DM130型大孔樹(shù)脂具有較好的純化效果，最佳工藝參數(shù)為上樣液質(zhì)量濃度3.50 g·L-1，上樣液pH為4，體積為3 BV，流速為1 mL·min-1。洗脫前先用純水將殘留的黃酮洗除干凈，待流出液至無(wú)色時(shí)再加洗脫劑洗脫。洗脫劑為70%乙醇，體積為4 BV，流速為1 mL·min-1。在該工藝下，其純度由原先的40.96%提升至87.94%，回收率為77.85%，說(shuō)明該純化工藝行之有效，具有良好的分離純化密花香薷全草中總黃酮的效果。