UPLC-MS/MS 法測定糕點中安賽蜜的不確定度評定

莫禮艷，唐明華

（玉林市食品藥品檢驗檢測中心，廣西 玉林 537000）

安賽蜜是一種人工合成甜味劑，化學名稱為乙酰磺胺酸鉀［1］，又稱AK 糖，廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，若超量使用，則可能引起不同程度的中毒表現(xiàn)［2］，因此必須對其使用量進行嚴格管理。GB2760 食品安全國家標準《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》［3］對安賽蜜在糕點中的應(yīng)用范圍有明確的規(guī)定。因此對糕點中安賽蜜的監(jiān)管不僅關(guān)系到產(chǎn)品的品質(zhì)，更關(guān)系消費者的安全與健康［2］。在實際檢測中，當安賽蜜的檢出值在限量值附近時，實驗室出具的檢測結(jié)果直接關(guān)系到樣品是否合格的判定［4］。因此，為確保結(jié)果的可信度，必須進行不確定度的評估。本研究對SN/T 3538—2013［5］糕點中安賽蜜的檢測方法進行了不確定度評定，識別試驗過程中不確定度的來源，量化各分量的不確定度，分析各分量的不確定度對檢測結(jié)果的影響，以期優(yōu)化檢測過程，減少檢測誤差，保證檢測結(jié)果的準確性［6］，為UPLC-MS/MS 法測定糕點中安賽蜜不確定度的評定提供參考依據(jù)［7］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 ACQUITY UPLC I-Class 超高效液相色譜儀、Waters Xevo TQ-S 三重四極桿質(zhì)譜儀，美國Waters 公司；BSA822-CM 型電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；ROATNTA 460R 型離心機，德國SIGMA 公司；541-10000-00-1 型渦旋混勻器，德國海道夫公司。

1.1.2 試劑 安賽蜜標準品，DR. 公司，批號為G129941，含量以99.18% 計，擴展不確定度U=0.56%；甲醇，默克股份兩合公司，色譜純。

1.2 方法

1.2.1 標準工作溶液制備

1）標準貯備溶液（1 mg/mL）的制備。精密稱取安賽蜜標準品約25 mg，置于25 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1∶1）溶液溶解并定容至刻度，搖勻，4 ℃保存。

2）標準中間溶液（1 μg/mL）的制備。精密吸取安賽蜜標準品貯備液（約1 mg/mL）0.10 mL 于100 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1∶1）溶液定容至刻度，搖勻，4 ℃保存。

3）系列標準工作溶液的制備。分別精密吸取安賽蜜標準中間溶液（約1 μg/mL）0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL 于10 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1∶1）溶液定容至刻度，搖勻，即得。濃度分別為2、5、10、20、50、100 ng/mL。

1.2.2 供試品溶液的制備 稱取2.00 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL 塑料管中，加入20 mL 甲醇∶水（1∶1）溶液，超 聲提 取20 min，4 600 r/min 離 心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中。重復提取1 次，合并上清液，用甲醇-水（1∶1）溶液定容至50 mL。過0.45 μm 有機濾膜，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測定［5］。

1.2.3 儀器條件

1）色譜條件。色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流動相為0.1% 甲酸-5 mmol/L 甲酸銨溶液-乙腈（10∶90）；流速為0.25 mL/min；進樣量為2 μL。

2）質(zhì)譜條件。離子源為電噴霧離子（ESI）源，負離子模式；毛細管電壓3.0 kV；離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣溫度300 ℃；RF 透鏡電壓0.5 V；脫溶劑氣流速600 L/h；錐孔氣流速50 L/h；采集模式為多反應(yīng)離子監(jiān)測（MRM）。監(jiān)測離子參數(shù)見表1。

表1 安賽蜜離子對信息

1.2.4 不確定度分量的來源分析

2）不確定度分量。根據(jù)數(shù)學模型及測量過程，測定結(jié)果的不確定度分量主要來自標準貯備液的制備、系列標準工作溶液的配制、樣品（前處理、回收率和測量重復性）和標準曲線擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準貯備液制備過程引入的不確定度urel（m）

2.1.1 由電子天平稱量引入的不確定度u1，r（elm） 天平檢定證書給出的示值允許誤差±0.05 mg，服從均勻分布，k =，其標準不確定度為：u1(m) =

2.1.2 標準物質(zhì)的純度引入的不確定度u2，r（elm） 證書給出的標準不確定度U=0.56%，純度為99.18%，相對標準不確定度為10-3。

2.1.3 標準貯備液定容引入的不確定度u3，rel（m） JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》［8］規(guī)定，25 mL A 級量瓶容量的允許誤差為±0.03 mL，按三角形分布，由此產(chǎn)生的不確定度為10-2mL。試驗環(huán)境溫度為（20±5）℃，甲醇在20 ℃的體積膨脹系數(shù)為1.19×10-3/℃，按矩形分布，由此產(chǎn)入 的 相 對 標 準 不 確 定 度 為 u3,rel(m) =

2.1.4 由標準貯備液制備過程引入的相對標準不確定度

2.2 系列標準工作溶液配制過程引入的相對不確定度urel（v）

系列標準工作溶液配制過程的不確定度主要由移液槍移取的體積、玻璃量器定容的體積、實驗室的溫度等引起。

2.2.1 標準工作溶液引入的不確定度u1，rel（v） 精密吸取安賽蜜標準品貯備液（1.0 mg/mL）0.10 mL 于100 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1∶1）溶液定容至刻度，配制后濃度約為1.0 μg/mL。 按照JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》［9］100 μL 移液器吸取100 μL溶液允許誤差為±2.0%，按三角形分布，由此產(chǎn)生的不確定度為驗環(huán)境溫度為（20±5）℃，甲醇在20 ℃的體積膨脹系數(shù)為1.19×10-3/℃，按矩形分布，由此產(chǎn)生的不確定度 為

吸液引入的相對標準不確定度為：u1-1,rel(v)=

JJG196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》［8］規(guī)定，100 mL A 級量瓶容量的允許誤差為±0.10 mL，按三角形分布，由此產(chǎn)生的不確定度為：u1-3(v) =

2.2.2 標準曲線溶液配制引入的不確定度u2，rel

（v） 標準曲線繪制時所使用移液器的量程有0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL。 按JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》［9］規(guī)定，容量允許誤差分別為±4.0%、±3.0%、±2.0%、±1.5%、±0.6%、±0.6%，則由體積校準引入的相對標準不確定度分別為：

試驗環(huán)境溫度為（20±5）℃，甲醇在20 ℃的體積膨脹系數(shù)為1.19×10-3/℃，按矩形分布，由此產(chǎn)生的不確定度為：

JJG196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》［8］規(guī)定，10 mL A 級量瓶容量的允許誤差為±0.020 mL，按三角形分布，由此產(chǎn)生的不確定度為：u2-3(v) =

試驗環(huán)境溫度為（20±5）℃，甲醇在20 ℃的體積膨脹系數(shù)為1.19×10-3/℃，按矩形分布，由此產(chǎn)生

2.2.3 由標準系列工作溶液配制引入的相對標準不確定度urel（v）為：

2.3 樣品引入的相對不確定度u1，rel（r）

2.3.1 樣品前處理引入的相對不確定度ure（lr） 50 mL A 級單標線吸量管容量允許誤差為±0.05，按三角形分布，其標準不確定度為2.04 × 10-2。 試 驗 環(huán) 境 溫 度 為（20±5）℃，甲 醇 在20 ℃的體積膨脹系數(shù)為1.19×10-3/℃，按矩形分布，則由溫度效應(yīng)引入的標準不確定度為：u1-2(r) =0.172 mL。由以上2 項引入的合成樣品定容引入的相 對 標 準 不 確 定 度 ： u1,rel(r) =

2.3.2 樣品重復性引入的相對不確定度u2，rel（r）取陽性樣品8 份進行測定，計算其平均值和標準偏差，平均值為0.940 9 mg/kg，標準偏差為1.9%。測量重復性標準不確定度為10-3。則測量重復性引入的相對標準不確定度為：重 復 性 結(jié) 果 見表2。

2.3.3 回收率引入的相對不確定度u3，rel（r） 試驗設(shè)置高、中、低3 個濃度水平，各濃度水平分別準確稱取空白樣品2.0 g，分別精密加入“1.2.1”項下的標準品中間液0.4、1.0、2.0 mL ，按照供試品溶液的制備加標回收樣品溶液，每個平行制備2 份，分別進樣測定，計算加標回收率和相對標準偏差（RSD），平均回收率為96.42%，RSD 為1.2%?；厥章蕵藴什淮_定度為入的相對標準不確定度為5.08 × 10-3。加標回收結(jié)果見表3。

表2 重復性結(jié)果

表3 加標回收結(jié)果

2.3.4 樣品引入的相對不確定度 綜合以上3 個分量的不確定度，樣品引入的相對不確定度為：

2.4 標準曲線擬合與測量重復性引入的相對不確定度urel（c）

安賽蜜的標準曲線方程與相關(guān)系數(shù)為：Y=262.631X-16.404 7，r=0.999 7，標準曲線結(jié)果見表4，平均值為32.018 ng/mL。根據(jù)《化學分析中不確定度的評估指南》［10］，由標準曲線擬合引入標準不確定度由下式計算：

SR=，式中，SR為標準曲線殘差標準差；B 為斜率；C 為待測樣品平均質(zhì)量濃度；n 為標準曲線點數(shù)；p 為待測樣品重復測定次數(shù)；C0為回歸曲線各點質(zhì)量濃度的平均值；C0j為回歸曲線各點質(zhì)量濃度；Yj為各標準溶液實際響應(yīng)值；Y理論值為回歸曲線所測理論值。

表4 標準曲線結(jié)果

3 擴展不確定度U

3.1 合成相對標準不確定度urel

3.2 相對擴展不確定度Urel

取 置 信 概 率P=95%，k=2，Urel= 0.206 × 2 =0.412。

3.3 擴展不確定度U

U = 0.940 9 × 0.412 = 0.39 (mg/kg)

4 討論

通過分析和評估不確定度來源發(fā)現(xiàn)，對于結(jié)果不確定度影響為：系列標準工作溶液的配制＞標準曲線擬合＞標準儲備液的制備＞樣品（前處理、回收率和測量重復性），標準工作溶液的配制過程是不確定度的最主要來源［11］。因此，可以通過改進標準溶液配制，采用高精度的移液器和容量瓶，提升儀器設(shè)備的穩(wěn)定性等措施來修正［12］。該試驗根據(jù)CNASGL006：2019《化學分析中不確定度的評估指南》［10］分析UPLC-MS/MS 法測定糕點中安賽蜜的不確定度來源，建立科學的數(shù)學模型并量化各個影響分量，得出安賽蜜測定結(jié)果的擴展不確定度為0.39 mg/kg（k=2）。當測量結(jié)果接近限量值時，為檢品判定提供依據(jù)，同時也為實驗室日常質(zhì)量控制提供參考［7］。