精氨酸代琥珀酸合成酶1在肝細(xì)胞癌進(jìn)展中的作用和潛在價(jià)值

羅 霞，史青苗，余祖江

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染性疾病科，河南 鄭州 450052

原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)第六大常見癌癥，也是第四大癌癥相關(guān)死亡原因，每年新增病例約84.1萬例，年死亡病例約78.2萬人[1]，而我國原發(fā)性肝癌患者的人數(shù)約占全球的一半[2]。肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原發(fā)性肝癌的75%～85%。手術(shù)切除是早期HCC治療的首選方法及主要治療方式，但多數(shù)患者在就診時(shí)已經(jīng)發(fā)生肝內(nèi)和肝外轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)。只有不到30%的患者適合采用手術(shù)切除、肝移植、動(dòng)脈栓塞等治療方案[3-4]。而目前獲得批準(zhǔn)的治療HCC的一線分子靶向藥物索拉非尼和侖伐替尼、二線藥物瑞戈非尼以及免疫檢查點(diǎn)抑制劑等雖為HCC患者帶來了福音，但因不良反應(yīng)大以及耐藥問題等存在很多局限性[5-7]。因此，探討HCC的發(fā)生、發(fā)展及其轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的分子機(jī)制，尋找潛在的特異性分子生物靶點(diǎn)對于HCC診斷治療有著極其重要的意義。

尿素循環(huán)是將劇毒氨轉(zhuǎn)化為尿素排出體外的氨解毒代謝途徑[8-9]。通過同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)技術(shù)以及Western blotting等技術(shù)對大血管侵犯肝癌患者的腫瘤組織及臨近正常組織進(jìn)行蛋白組學(xué)定量差異分析顯示，尿素循環(huán)中的5種關(guān)鍵酶氨基甲酰磷酸合成酶1(carbamoyl phosphate synthetase 1，CPS-1)、鳥氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶(ornithine carbamoyl transferase，OCT)、精氨酸代琥珀酸合成酶1(argininosuccinate synthetase 1，ASS1)、精氨酸代琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase，ASL)、精氨酸酶(arginase)在HCC組織中均異常下調(diào)，而尿素循環(huán)中關(guān)鍵酶的異常下調(diào)可通過促進(jìn)HCC大血管的侵襲和轉(zhuǎn)移而降低HCC患者的總體生存期[10]。其中，ASS1可催化天冬氨酸和瓜氨酸轉(zhuǎn)化為精氨酸代琥珀酸，后在ASL的作用下裂解生成精氨酸。精氨酸是一種半必需氨基酸，是合成多種影響癌細(xì)胞生長、增殖、侵襲、免疫和轉(zhuǎn)移的代謝物的底物。HCC患者由于ASS1低表達(dá)或表達(dá)缺失不能從頭合成精氨酸，極度依賴外源性精氨酸維持必要的生物學(xué)過程，因此，HCC呈現(xiàn)出明顯的精氨酸依賴現(xiàn)象。最近的研究證明，ASS1的過表達(dá)可明顯抑制肝癌細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)移潛能和體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移率，相反，敲除ASS1可顯著提高體內(nèi)外肝癌細(xì)胞的侵襲能力[11]。本文結(jié)合該領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展，從ASS1的生化結(jié)構(gòu)、功能調(diào)節(jié)及其在HCC進(jìn)展中的作用和潛在價(jià)值，以期為HCC的精準(zhǔn)治療提供新的特異性分子治療靶點(diǎn)及新的治療策略提供理論依據(jù)。

1 ASS1的生化結(jié)構(gòu)及功能調(diào)節(jié)

ASS1是哺乳動(dòng)物體內(nèi)普遍存在的酶，主要在腎臟和肝臟門脈周圍肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，其表達(dá)水平因細(xì)胞的種類、分化程度和作用而異。ASS1也是一種高度保守的肝細(xì)胞胞漿酶，主要參與精氨酸的合成代謝。人類ASS1蛋白的生化結(jié)構(gòu)主要由三部分組成，分別為核苷酸結(jié)合域、合成酶帶和多聚螺旋C端，構(gòu)成同源四聚體結(jié)構(gòu)。ASS1基因位于人類第9號染色體上即9q34.11～9q34.12，有16個(gè)外顯子和1 236個(gè)堿基對組成的開放閱讀框。在ASS1的第1個(gè)內(nèi)含子和啟動(dòng)子中有大量富含CpG的區(qū)域，通常不受甲基化保護(hù)的區(qū)域被稱為“CpG島”，在腫瘤發(fā)生過程中易發(fā)生高甲基化。在進(jìn)行甲基化特異性PCR檢測及甲基化測序時(shí)顯示，肝癌組織中ASS1的甲基化水平明顯高于正常肝組織和癌旁組織，同時(shí)存在很多從C到T的突變。肝癌組織中ASS1缺失的機(jī)制可能是DNA編碼ASS1的甲基化所致，也導(dǎo)致了腫瘤對外源性精氨酸的依賴[12]。DNA甲基化模式的異常破壞與癌變發(fā)生有關(guān)，可能導(dǎo)致基因沉默和惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化[13]。因此，通過利用甲基化抑制劑5-氮雜胞苷(5’AZA)逆轉(zhuǎn)甲基化狀態(tài)，使細(xì)胞重新表達(dá)ASS1。

ASS1表達(dá)的調(diào)控是復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)的。肝臟中的ASS基因高度表達(dá)，其中細(xì)胞外激素、營養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸、細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子等主要在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)ASS1基因表達(dá)，如(1)糖皮質(zhì)激素、胰高血糖素和胰島素，特別是在發(fā)育和成年期控制該基因的表達(dá)；(2)飲食蛋白攝入刺激ASS基因的表達(dá)，對谷氨酰胺等特定氨基酸具有特異性；(3)轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子，ASS1的基因表達(dá)是由結(jié)合在ASS1近端啟動(dòng)子上E-box的正性轉(zhuǎn)錄因子c-Myc與Sp4和負(fù)性轉(zhuǎn)錄因子HIF-1α交互作用調(diào)控的。(4)ASS1在缺氧和酸性狀態(tài)下的表達(dá)下調(diào)，ASS1在腫瘤中的表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致上游代謝物如谷氨酰胺和氨(來源于谷氨酰胺)的積累，這些代謝產(chǎn)物可以堿化腫瘤細(xì)胞內(nèi)的pH，維持腫瘤細(xì)胞膜兩側(cè)pH的梯度，對腫瘤細(xì)胞的存活、侵襲和遷移至關(guān)重要，從而為腫瘤細(xì)胞提供了氧化還原和pH值的優(yōu)勢，提高了其存活率[14]。

2 ASS1在腫瘤中的作用

腫瘤細(xì)胞中尿素循環(huán)酶的表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致了腫瘤中普遍存在尿素循環(huán)障礙，隨后激活了CAD復(fù)合酶體(包括氨基甲酰磷酸合成酶Ⅱ、天門冬氨酸氨基甲酰轉(zhuǎn)移酶和二氫乳清酸酶)的活性使氮源流傾向于嘧啶的合成，使細(xì)胞核中嘧啶與嘌呤的不平衡，增加了嘌呤突變?yōu)猷奏さ娘L(fēng)險(xiǎn)，這與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[9]。CAD復(fù)合酶體是指位于同一條肽鏈的一種多功能復(fù)合酶，有利于以均勻的速度參與嘧啶核苷酸的合成。胞漿中的天冬氨酸不僅作為ASS1的底物提供氨基，同時(shí)也是CAD復(fù)合酶體的底物。在ASS1缺乏或低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中，胞漿中的天冬氨酸異常積累，導(dǎo)致CAD異?；罨?，同時(shí)增加了底物的可用性,促進(jìn)了CAD催化嘧啶核苷酸的合成，為腫瘤細(xì)胞的增殖提供了原料[15]。因此，對于ASS1表達(dá)缺陷或低表達(dá)的腫瘤，尤其是那些對精氨酸降解酶產(chǎn)生耐藥性的腫瘤，可將天冬氨酸剝奪作為一種額外的治療干預(yù)策略。

隨著對ASS1在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中作用的研究不斷深入，越來越多的證據(jù)表明，ASS1與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。ASS1的低表達(dá)與骨肉瘤患者術(shù)后肺轉(zhuǎn)移和不良臨床結(jié)局顯著相關(guān)，臨床前試驗(yàn)中ASS1的過表達(dá)在體外抑制了腫瘤生長，因此，ASS1可能為骨肉瘤患者轉(zhuǎn)移和不良反應(yīng)的預(yù)測生物標(biāo)志物[16]；另外，ASS1作為黏液纖維肉瘤的抑癌基因，具有抗血管生成、抗增殖、抗氧化及抗侵襲的特性，與黏液纖維肉瘤的分級和分期的增加密切相關(guān)，并且可以獨(dú)立的預(yù)測腫瘤的無轉(zhuǎn)移生存期和疾病特異性生存期[17]。與這些結(jié)果一致，約51.6%(64/124)的鼻咽癌患者存在ASS1表達(dá)缺失，與晚期鼻咽癌分期、DNA甲基化和臨床侵襲性相關(guān)，ASS1的表觀失活與顯著降低的總體生存期和無轉(zhuǎn)移生存期相關(guān)，也表明該ASS1具有腫瘤抑制功能[18]。

然而，值得我們關(guān)注的是在不同類型的腫瘤中，ASS1在臨床結(jié)果中的作用可能不同。已有研究表明，ASS1在胃癌中呈高表達(dá)，并與胃癌侵襲性及預(yù)后不良呈正相關(guān)[19]。另外，ASS1在結(jié)直腸腫瘤中也呈高表達(dá)，可以作為人類原發(fā)性結(jié)直腸腫瘤的上調(diào)靶點(diǎn)，應(yīng)用ASS1抑制劑或敲除ASS1時(shí)會(huì)削弱結(jié)直腸腫瘤的致病性[20]。腫瘤細(xì)胞中ASS1的基礎(chǔ)表達(dá)差異可能導(dǎo)致相反的臨床結(jié)果。ASS1在腫瘤中的雙重作用機(jī)制尚不清楚，因此，需要進(jìn)一步深入研究，以探索其潛在機(jī)制。

3 目前ASS1在HCC進(jìn)展中的作用機(jī)制的研究進(jìn)展

腫瘤轉(zhuǎn)移是癌細(xì)胞進(jìn)入血管系統(tǒng)向遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移和侵襲的復(fù)雜過程，是各種癌癥發(fā)病和死亡的主要原因。HCC轉(zhuǎn)移定義為經(jīng)門靜脈播散的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，或肝外轉(zhuǎn)移到其他器官，包括肺、淋巴結(jié)、骨骼和腎上腺。肝內(nèi)和肝外轉(zhuǎn)移發(fā)生在半數(shù)以上的HCC切除患者中，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移更為常見。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過程，包括原發(fā)腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和血管內(nèi)灌注，循環(huán)腫瘤細(xì)胞的存活，新的微小轉(zhuǎn)移瘤的形成，以及隨后這些腫瘤細(xì)胞向臨床可檢測到的轉(zhuǎn)移病灶的增殖，是由復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)級聯(lián)調(diào)控的，因此，腫瘤轉(zhuǎn)移仍是腫瘤進(jìn)展機(jī)制中最不為人知的部分[21]。肝癌細(xì)胞的血管侵犯、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)導(dǎo)致了患者的預(yù)后不良。HCC的侵襲轉(zhuǎn)移發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，多種信號通路參與其中。其中，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithlial mesenchymal transition,EMT)是腫瘤侵襲過程中的關(guān)鍵事件，上皮細(xì)胞層失去極性和細(xì)胞間的相互作用導(dǎo)致細(xì)胞骨架重塑[22]。腫瘤細(xì)胞分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一類鋅依賴性內(nèi)源性蛋白酶，通過降解基底膜啟動(dòng)血管生成[23]。這改變了細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞通過所形成的間隙向腫瘤細(xì)胞的聚集遷移，導(dǎo)致新血管的增殖和形成[24]。

在研究人類磷酸激酶陣列探索ASS1調(diào)控的蛋白磷酸化參與HCC的轉(zhuǎn)移時(shí)，發(fā)現(xiàn)pSTAT3Ser727是ASS1調(diào)控的最特異的下游激酶。當(dāng)敲除ASS1時(shí)，pSTAT3Ser727水平升高；當(dāng)ASS1過表達(dá)時(shí)，pSTAT3Ser727水平下降，證明了STAT3蛋白表達(dá)與ASS1的表達(dá)有關(guān)。在HCC中，STAT3的缺失可能會(huì)顯著損害通過下調(diào)ASS1而增加的轉(zhuǎn)移能力，表明ASS1通過STAT3調(diào)節(jié)HCC的侵襲[11]。信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)因含有SH2和SH3結(jié)構(gòu)域，故可與特定的含磷酸化酪氨酸的肽段結(jié)合。在絲氨酸蛋白激酶的作用下，位于絲氨酸(Serine,Ser)727位點(diǎn)的STAT3被磷酸化后形成pSTAT3Ser727，pSTAT3Ser727蛋白有三個(gè)方面作用：(1)可發(fā)生聚合成為同源或異源二聚體形式的活化轉(zhuǎn)錄激活因子，進(jìn)入胞核內(nèi)與靶基因啟動(dòng)子序列的特定位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄；(2)pSTAT3Ser727蛋白可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)生成，促進(jìn)血管生成；(3)激活MMPs等轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)，MMPs通過激活生長因子、抑制細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)血管生成、增強(qiáng)組織再生等多種途徑促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[25]。其中，MMP-9是STAT3通路激活后產(chǎn)生的下游蛋白因子，幾乎能夠降解基質(zhì)中的各種蛋白質(zhì)成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵性作用。

在進(jìn)行全人類基因組微陣列分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)STAT3信號通路中識(shí)別ASS1調(diào)控的差異基因的合適靶點(diǎn)是分化抑制蛋白-1(ID1)[11]。ID1又稱DNA結(jié)合抑制因子，是一種螺旋—環(huán)—螺旋(HLH)結(jié)構(gòu)的負(fù)性轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控蛋白，這類蛋白不具有與特定DNA結(jié)合的能力，可與堿性HLH家族成員形成異二聚體，抑制轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活能力。ID1在人和小鼠肝臟腫瘤及HCC細(xì)胞系中均有較高表達(dá)，可通過MAPK/ERK通路在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控ID1的表達(dá)。敲除ID1基因抑制了好氧糖酵解和谷氨酰胺分解，使代謝向有氧糖酵解方向轉(zhuǎn)變，促進(jìn)了HCC細(xì)胞的代謝重新編程[26]。而在敲除ASS1時(shí)，HCC細(xì)胞中的ID1水平升高；當(dāng)ASS1過表達(dá)時(shí)，ID1水平下降[11]。而STAT3是ID1表達(dá)的又一重要調(diào)控因子[27]，pSTAT3Ser727在HCC患者中表達(dá)與ID1呈正相關(guān)。因此，ASS1過表達(dá)可能通過抑制pSTAT3Ser727通路負(fù)向調(diào)控ID1表達(dá),從而抑制HCC進(jìn)展[11]。但ASS1調(diào)控HCC進(jìn)展的具體分子機(jī)制仍需繼續(xù)探討。

4 ASS1在HCC進(jìn)展中的潛在價(jià)值

大血管浸潤(macrovascular infiltration,MVI)是HCC患者預(yù)后差的因素之一。MVI主要是指腫瘤侵犯門靜脈或肝靜脈主干或分支[28]。利用iTRAQ等技術(shù)對大血管侵犯HCC患者的腫瘤組織及鄰近正常組織進(jìn)行蛋白組學(xué)定量差異分析顯示，尿素循環(huán)中的五種關(guān)鍵酶(CPS1、OTC、ASS1、ASL、ARG1)在大血管侵犯的HCC組織中均呈異常下調(diào)，尿素循環(huán)失調(diào)通過促進(jìn)HCC大血管的侵襲和轉(zhuǎn)移抑制HCC總生存率。尤其是尿素循環(huán)中的關(guān)鍵酶失調(diào)可能成為進(jìn)一步研究大血管侵犯HCC患者的潛在治療靶點(diǎn)[10]。在使用比較蛋白組學(xué)研究HCC患者轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物時(shí)，發(fā)現(xiàn)三種生物標(biāo)志物(HSP70、ASS1、UGP2)聯(lián)合應(yīng)用對HCC轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的預(yù)測比單獨(dú)甲胎蛋白(AFP)具有更高的靈敏性和特異性，轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)性HCC組中ASS1的表達(dá)明顯低于非復(fù)發(fā)性HCC組，亦表明ASS1可作為轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)性HCC的預(yù)測生物標(biāo)志物[29]。最新的研究表明，ASS1的穩(wěn)定沉默促進(jìn)了HCC細(xì)胞的遷移和侵襲，而過表達(dá)則抑制了HCC細(xì)胞在體內(nèi)和體外的轉(zhuǎn)移[11]。

5 ASS1與HCC的治療

HCC由于ASS1低表達(dá)或表達(dá)缺陷失去獨(dú)立合成精氨酸的能力，只能利用細(xì)胞外精氨酸維持其生長代謝需要，因此，可通過剝奪細(xì)胞外精氨酸靶向殺傷這類腫瘤。癌癥模型的臨床前研究已經(jīng)證明了精氨酸剝奪會(huì)導(dǎo)致線粒體功能障礙、活性氧積累、DNA和染色質(zhì)損傷，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡[30]。精氨酸脫氨酶是催化精氨酸轉(zhuǎn)化為瓜氨酸的酶，經(jīng)聚乙二醇修飾的聚乙二醇化精氨酸脫亞胺酶(ADI-PEG 20)抗原性減弱、半衰期延長。之前的研究[31]證實(shí)了ADI-PEG 20在肝癌患者的Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)中取得了顯著進(jìn)展，但最近的ADI-PEG 20應(yīng)用于既往治療失敗的晚期肝癌患者中的Ⅲ期隨機(jī)對照臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，ADI-PEG 20單一療法未顯示出中位生存期的益處，但具有很好的耐受性，目前旨在延長精氨酸耗竭時(shí)間和協(xié)同ADI-PEG 20效應(yīng)的策略臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中[32]。

前文已經(jīng)闡述了尿素循環(huán)障礙導(dǎo)致的嘧啶合成增加不僅會(huì)促進(jìn)腫瘤增殖也會(huì)由于嘧啶與嘌呤比例失調(diào)而引起DNA、RNA甚至是蛋白水平的突變，使腫瘤細(xì)胞對免疫療法更敏感[9]，同時(shí)，使用ADI-PEG20治療對正常細(xì)胞影響并不明顯，因此，ADI-PEG20可以嘗試與化療或免疫療法聯(lián)合使用治療HCC。近來的研究數(shù)據(jù)也已證實(shí)了ADI-PEG20與5-氟尿嘧啶(5-FU)的聯(lián)合治療比單一治療更能導(dǎo)致ASS1陰性的肝癌細(xì)胞死亡[33]。另外，ADI-PEG 20和改良的FOLFOX6(mFOLFOX6)聯(lián)合治療難治性HCC和其他進(jìn)展期胃腸道腫瘤的Ⅰ期臨床試驗(yàn)顯示出令人鼓舞的初步療效，且是安全的、可耐受的,目前的Ⅱ期多中心的臨床研究亦正在進(jìn)行中[34]。

6 未來展望

本文聚焦尿素循環(huán)關(guān)鍵限速酶ASS1在HCC中的進(jìn)行情況，分析HCC患者中ASS1的異常表達(dá)對HCC惡性表型的調(diào)控機(jī)制及其在HCC進(jìn)展中的作用和潛在價(jià)值，通過靶向腫瘤細(xì)胞的異常代謝為HCC臨床的精準(zhǔn)治療提供新靶點(diǎn)及理論支持。但由于目前對ASS1如何具體調(diào)控HCC進(jìn)展的分子機(jī)制尚不清楚，未來需結(jié)合基礎(chǔ)生物學(xué)研究和大型臨床試驗(yàn)進(jìn)一步探討ASS1調(diào)控HCC進(jìn)展的具體分子機(jī)制。