生草烏和訶子制草烏細胞毒性及抗炎作用的比較研究

支美汝 韓舒 劉凱洋 韓喜桃 唐雅楠 劉子琴 王宏月 李飛 杜紅

摘 要 目的：比較生草烏和訶子制草烏的細胞毒性及抗炎作用。方法：以大鼠心肌細胞H9c2為對象，采用CCK-8法檢測0.5、1、2、4、6、8、10 mg/mL生草烏和訶子制草烏作用4、8、12、24 h對細胞抑制率的影響，采用Hoechst 33258染色法觀察2、4、6 mg/mL生草烏和訶子制草烏作用24 h對細胞形態(tài)學(xué)特征的影響。以小鼠巨噬細胞RAW264.7為對象，采用CCK-8法檢測0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2 mg/mL生草烏和訶子制草烏作用24 h對細胞存活率的影響，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測0.05、0.1、0.25、0.5 mg/mL生草烏和訶子制草烏對LPS致RAW264.7炎癥細胞中一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）釋放的影響。結(jié)果：當質(zhì)量濃度為0.5、1 mg/mL時，生草烏和訶子制草烏對H9c2細胞幾乎均無抑制作用;當質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，訶子制草烏在各時間點對H9c2細胞的抑制率均顯著高于生草烏（P<0.05或P<0.01），且作用24 h的細胞熒光強度雖強于生草烏，但其細胞核完整;當質(zhì)量濃度為4～10 mg/mL時，訶子制草烏在各時間點（除8、10 mg/mL作用24 h外）對H9c2細胞的抑制率均顯著低于生草烏（P<0.05或P<0.01），且4、6 mg/mL生草烏組細胞的熒光強度強于訶子制草烏組，同時生草烏組的細胞核破碎現(xiàn)象更為嚴重。0.05～0.5 mg/mL的生草烏和訶子制草烏對RAW264.7細胞均無毒性，0.25、0.5 mg/mL的生草烏和0.1、0.25、0.5 mg/mL的訶子制草烏對RAW264.7炎癥細胞中NO的釋放以及0.05、0.1、0.25、0.5 mg/mL的生草烏和訶子制草烏對RAW264.7炎癥細胞中TNF-α、IL-6的釋放均有顯著的抑制作用（P<0.05或P<0.01），其中相同質(zhì)量濃度下訶子制草烏對NO釋放的抑制作用優(yōu)于生草烏，對TNF-α、IL-6釋放的抑制作用弱于生草烏。結(jié)論：草烏經(jīng)訶子湯炮制后毒性有所降低，尤其是以中或高濃度、短期內(nèi)使用的毒性低于生草烏。同時，訶子制草烏的抗炎作用與同濃度生草烏相當。

關(guān)鍵詞 生草烏;訶子制草烏;毒性;抗炎;H9c2細胞;RAW264.7細胞

中圖分類號 R28 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）22-2701-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.22.03

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To compare cytotoxicity and anti-inflammatory effects of raw Aconitium kusnezoffii and A. kusnezoffii processed with Terminalia chebula. METHODS： Using H9c2 cardiomyocytes isolated from rat as subjects， CCK-8 assay was used to detect the effects of 0.5， 1， 2， 4， 6， 8， 10 mg/mL raw A. kusnezoffii and A. kusnezoffii processed with T. chebula on cell inhibition rate after cultured for 4， 8， 12， 24 h. Hoechst 33258 staining was used to observe the effects on cell morphology characteristics after treated with 2， 4， 6 mg/mL raw A. kusnezoffii and A. kusnezoffii processed with T. chebula. Using macrophages RAW264.7 cells as subjects， CCK-8 assay was used to detect the effects of 0.05， 0.1， 0.25， 0.5， 0.75， 1， 1.5， 2 mg/mL raw A. kusnezoffii and A. kusnezoffii processed with T. chebula on cell survival rate after cultured for 24 h. ELISA assay was used to detect the effects of 0.05， 0.1， 0.25， 0.5 mg/mL raw A. kusnezoffii and A. kusnezoffii processed with T. chebula on the release of NO， TNF-α and IL-6 in RAW264.7 inflammation cells induced by LPS. RESULTS： When the mass concentration was 0.5， 1 mg/mL， neither raw A. kusnezoffii and A. kusnezoffii processed with T. chebula had no inhibitory effect on H9c2 cells. When the mass concentration was 2 mg/mL， the inhibitory effects of A. kusnezoffii processed with T. chebula on H9c2 cells was higher than that of raw A. kusnezoffii （P<0.05 or P<0.01）; fluorescence intensity of cells treated for 24 h was stronger than that of raw A. kusnezoffii， but its nucleus was intact. When the mass concentration was 4-10 mg/mL， the inhibitory rate of A. kusnezoffii processed with T. chebula on H9c2 cells at different time points （except for 24 h culture of 8， 10 mg/mL） was significantly lower than raw A. kusnezoffii （P<0.05 or P<0.01）. The characteristics of cell morphology also showed that the fluorescence intensity of raw A. kusnezoffii group at 4， 6 mg/mL was stronger than that of A. kusnezoffii processed with T. chebula group， and the cell nucleus fragmentation was more serious in the raw A. kusnezoffii group. 0.05-0.5 mg/mL raw A. kusnezoffii and A. kusnezoffii processed with T. chebula had no toxicity to RAW264.7 cells. 0.25， 0.5 mg/mL raw A. kusnezoffii and 0.1， 0.25， 0.5 mg/mL A. kusnezoffii processed with T. chebula showed significant inhibitory effect on the release of NO， 0.05， 0.1， 0.25， 0.5 mg/mL raw A. kusnezoffii and A. kusnezoffii processed with T. chebula showed significant inhibitory effect on the release of TNF-α and IL-6 in RAW264.7 cell （P<0.05 or P<0.01）. The inhibitory effects of A. kusnezoffii processed with T. chebula at the same concentration on the release of NO was better than that of raw A. kusnezoffii， but poorer than raw A. kusnezoffii in the inhibitory effects on the release of TNF-α and IL-6.? CONCLUSIONS： The toxicity of A. kusnezoffii can be reduced after processed with T. chebula， especially the toxicity of it in medium or high concentration and short-term use is lower than that of raw A. kusnezoffii. At the same time， the anti-inflammatory effect of A. kusnezoffii processed with T. chebula is comparable to that of raw A. kusnezoffii at the same concentration.

KEYWORDS? ?Raw Aconitium kusnezoffii; Aconitium kusnezoffii processed with Terminalia chebula; Cytotoxicity; Anti- inflammatory effects; H9c2 cell; RAW264.7 cell

草烏Aconiti Kusnezoffii Radix為毛茛科植物北烏頭Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥塊根，具有祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)止痛的功效，可用于風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛及麻醉止痛，有大毒[1]。草烏是毒效并存的藥材，其在發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛等作用的同時，往往會因使用不當或者劑量過大而產(chǎn)生較強的毒副作用，其主要毒性靶器官為心臟，以心律失常等癥狀最為常見[2]。因此，臨床上常通過炮制或者配伍以達到減毒的目的[3-4]。草烏有多種炮制方法，訶子湯制為蒙醫(yī)炮制草烏的特色方法[5]，蒙醫(yī)中有“訶子解草烏毒”的說法[6]。訶子Chebulae Fructus為使君子科植物訶子Terminalia chebula Retz.或絨毛訶子Terminalia chebula Retz.var. tomentella Kurt.的干燥成熟果實[1]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，訶子中的鞣質(zhì)類成分可以有效避免草烏中雙酯型生物堿的水解或流失，進而減緩雙酯型生物堿的水解速度，使其緩慢地發(fā)揮毒性作用，故訶子制草烏的半數(shù)致死濃度（LD50）高于生草烏[7-8]。可見，訶子湯炮制能降低草烏的毒性，但并不是通過降低劇毒草烏中雙酯型生物堿的含量來實現(xiàn)的。為了進一步明確生草烏經(jīng)訶子湯炮制后減毒存效的原理，本研究比較了不同濃度生草烏和訶子制草烏作用不同時間對H9c2細胞的毒性，同時利用經(jīng)典炎癥細胞模型[脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細胞炎癥模型]探討生草烏和訶子制草烏的抗炎作用，從量-毒-時關(guān)系的角度探討訶子湯制法對草烏的減毒作用，以期進一步明確訶子制草烏炮制前后的藥效變化，為該炮制方法及炮制品的開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Thermo 3111型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）;SPECTROstar Nano型全波長酶標儀（上海微百科技發(fā)展有限公司）;BY-R20型低溫高速離心機（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）;Nikon Eclipse Ts2型常規(guī)倒置顯微鏡（日本Nikon公司）;MTN-5800型氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）;ISO9001型電子分析天平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

生草烏飲片（批號：311271）購自北京華邈中藥工程技術(shù)開發(fā)中心，訶子肉飲片（批號：180231）購自北京鶴延齡藥業(yè)發(fā)展有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與鑒定系王晶娟教授鑒定分別為毛茛科植物北烏頭A. kusnezoffii Reichb.的干燥塊根和使君子科植物訶子T. chebula Retz.的干燥成熟果實的去核品。青鏈霉素混合液（美國Caisson Labs公司，批號：12181006）;DMEM高糖培養(yǎng)基（批號：0032019）、胎牛血清（批號：AB20171102S）、胰蛋白酶（批號：0052419）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.4，批號：0012819）、LPS（批號：L2880）均購自美國Sigma公司;CCK-8試劑（批號：NV547）、二甲基亞砜（批號：1101G031）均購自北京索萊寶科技有限公司;Griess試劑盒（北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司，批號：106012）;腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測試劑盒（批號：A282H91224）、白細胞介素6（IL-6）ELISA檢測試劑盒（批號：A206H91042）、Hoechst 33258染色液（批號：C1018）均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細胞

大鼠心肌細胞H9c2和小鼠巨噬細胞RAW264.7均購自于北京協(xié)和細胞資源中心。

2 方法

2.1 訶子制草烏的制備

參考《內(nèi)蒙古蒙成藥標準》，按本課題組前期制定的參數(shù)制備訶子制草烏[9-10]。按照草烏-訶子質(zhì)量比2 ∶ 1的比例稱取藥材，先取訶子肉，加適量水浸泡1 h，回流煎煮1 h，濾過得訶子湯（每克訶子肉可得訶子湯約0.8 mL）;再取生草烏，用上述訶子湯浸泡3 d，至口嘗微有麻舌感時取出，陰干，即得訶子制草烏。

2.2 樣品預(yù)處理

分別將生草烏、訶子制草烏粉碎后，過三號篩，稱取粉末約2 g，精密稱定，分別置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，在25 ℃下超聲（功率：300 W，頻率：40 kHz）處理60 min，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，將濾液用氮氣流吹至干，即得。

2.3 生草烏和訶子制草烏對H9c2細胞的毒性

2.3.1 細胞抑制率 采用CCK-8法檢測。取對數(shù)生長期的H9c2細胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”）調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL。在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h（培養(yǎng)條件下同）后，將細胞隨機分為空白組和生草烏/訶子制草烏不同濃度給藥組。棄去上清液，各給藥組細胞分別加入不同質(zhì)量濃度的生草烏培養(yǎng)液或訶子制草烏培養(yǎng)液（均用完全培養(yǎng)基稀釋，下同），質(zhì)量濃度均分別為0.5、1、2、4、6、8、10 mg/mL（以生藥量計，給藥濃度按預(yù)試驗結(jié)果設(shè)置）;空白組細胞加入完全培養(yǎng)基;加入量均為100 μL。另設(shè)無細胞、無藥物的調(diào)零組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。分別培養(yǎng)4、8、12、24 h后，各孔加入CCK-8試劑10 μL，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育1 h。使用酶標儀在450 nm波長處測定光密度（OD值）并計算細胞抑制率：細胞抑制率（%）=[1-（給藥組OD值-調(diào)零組OD值）/（空白組OD值-調(diào)零組OD值）]×100%。試驗重復(fù)3次。

2.3.2 細胞形態(tài) 采用Hoechst 33258染色法觀察。取對數(shù)生長期的H9c2細胞，按“2.3.1”項下方法調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，接種于24孔板中，每孔500 μL。培養(yǎng)24 h后，將細胞隨機分為空白組和生草烏/訶子制草烏不同濃度給藥組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。棄去上清液，各給藥組細胞分別加入不同質(zhì)量濃度（根據(jù)“2.3.1”CCK-8試驗結(jié)果選擇對H9c2細胞有明顯抑制作用的濃度為給藥濃度）的生草烏培養(yǎng)液或訶子制草烏培養(yǎng)液;空白組細胞加入完全培養(yǎng)基;加入量均為100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次;每孔加入Hoechst 33258染色液300 μL，避光孵育20～30 min;棄去染色液，再用PBS洗滌2次。置于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

2.4 生草烏和訶子制草烏對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞的影響

2.4.1 細胞存活率 采用CCK-8法檢測。取RAW264.7細胞，加入完全培養(yǎng)基適量，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。取上述處于對數(shù)生長期的細胞，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后，將細胞隨機分為空白組和生草烏/訶子制草烏不同濃度給藥組。棄去上清液，各給藥組細胞分別加入不同質(zhì)量濃度的生草烏培養(yǎng)液或訶子制草烏培養(yǎng)液，質(zhì)量濃度分別均為0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2 mg/mL（以生藥量計，給藥濃度按預(yù)試驗結(jié)果設(shè)置）;空白組細胞加入完全培養(yǎng)基;加入量均為100 μL。另設(shè)無細胞、無藥物的調(diào)零組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，各孔加入CCK-8試劑10 μL，按“2.3.1”項下方法處理后測定OD值并計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（試驗組OD值-調(diào)零組OD值）/（空白組OD值-調(diào)零組OD值）×100%。細胞存活率≥90%即為無毒[11]。試驗重復(fù)3次。

2.4.2 細胞中NO、TNF-α、IL-6的釋放量 采用ELISA法檢測。取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞，按“2.4.1”項下方法調(diào)整細胞密度為1×106個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后，將細胞隨機分為空白組、模型組和生草烏/訶子制草烏不同濃度給藥組，每組設(shè)置3個復(fù)孔。棄去上清液，各給藥組細胞分別加入含1 ?g/mL LPS和不同質(zhì)量濃度（根據(jù)“2.4.1”CCK-8試驗結(jié)果選擇對RAW264.7細胞無毒性的濃度為給藥濃度）生草烏培養(yǎng)液或訶子制草烏培養(yǎng)液;空白組和模型組細胞加入不含或含1 ?g/mL LPS的DMEM高糖培養(yǎng)基;加入量均為100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取上清液，采用ELISA法以酶標儀檢測其中NO、TNF-α、IL-6的釋放量，嚴格按相應(yīng)試劑盒說明書操作。試驗重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad 8.0、SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料均以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 H9c2細胞抑制率的變化

當給藥濃度為0.5、1 mg/mL時，生草烏和訶子制草烏對H9c2細胞幾乎均無抑制作用，個別時間點還表現(xiàn)出一定的促進生長作用;當質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，訶子制草烏在各時間點對H9c2細胞的抑制率均顯著大于生草烏（P<0.05或P<0.01）;當質(zhì)量濃度為4、6、8、10 mg/mL時，訶子制草烏在各時間點（除8、10 mg/mL作用24 h外）對H9c2細胞的抑制率均顯著低于生草烏（P<0.05或P<0.01）。隨著質(zhì)量濃度的增加、作用時間的延長，生草烏和訶子制草烏對H9c2細胞抑制作用的差異有縮小的趨勢。各組細胞不同作用時間的細胞抑制率檢測結(jié)果見圖1。參考上述結(jié)果，本研究將后續(xù)試驗生草烏和訶子制草烏的給藥濃度分別均設(shè)置為2、4、6 mg/mL。

3.2 H9c2細胞形態(tài)學(xué)特征的變化

與空白組比較，當質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，生草烏組細胞的熒光強度無明顯變化，細胞核形態(tài)完整;訶子制草烏組細胞的熒光強度增強，但細胞核完整;當質(zhì)量濃度為4、6 mg/mL時，生草烏組和訶子制草烏組細胞的熒光強度均明顯增強且細胞核面積縮小，其中生草烏組的熒光強度強于訶子制草烏組，且生草烏組的細胞核破碎現(xiàn)象更為嚴重，而訶子制草烏組的細胞核相對完整。各組細胞形態(tài)學(xué)特征的熒光顯微圖見圖2。

3.3 RAW264.7細胞存活率的變化

與空白組比較，生草烏質(zhì)量濃度在0.05～1 mg/mL范圍內(nèi)對RAW264.7細胞無毒性，但達到1.5 mg/mL以后有明顯的細胞毒性;訶子制草烏質(zhì)量濃度在0.05～0.5 mg/mL范圍內(nèi)對RAW264.7細胞無毒性，甚至有一定的促增殖作用，但達到0.75 mg/mL以后有明顯的細胞毒性。各組細胞存活率的檢測結(jié)果見圖3。參考上述結(jié)果，本研究將后續(xù)試驗生草烏和訶子制草烏的給藥濃度分別均設(shè)置為0.05、0.1、0.25、0.5 mg/mL。

3.4 RAW264.7細胞中NO、TNF-α、IL-6釋放量的變化

與空白組比較，模型組細胞中NO、TNF-α、IL-6的釋放量均顯著升高（P<0.01），提示造模成功。與模型組比較，0.25、0.5 mg/mL生草烏組細胞中NO的釋放量，0.1、0.25、0.5 mg/mL訶子制草烏組細胞中NO的釋放量以及0.05、0.1、0.25、0.5 mg/mL生草烏組和訶子制草烏組細胞中TNF-α、IL-6的釋放量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。其中，訶子制草烏對NO釋放量的抑制作用優(yōu)于生草烏，而對TNF-α、IL-6釋放量的抑制作用弱于生草烏。各組細胞中NO、TNF-α、IL-6釋放量的檢測結(jié)果見圖4。

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，訶子制草烏可延緩草烏的毒性，并維持其抗炎療效，起到“減毒存效”的作用。當質(zhì)量濃度較小時，訶子制草烏對心肌細胞增殖無抑制作用，甚至還有一定的促生長作用，這可能與訶子本身的強心作用有關(guān)[6]。已有研究表明，訶子制草烏的減毒作用，可能與訶子中的成分抑制草烏中雙酯型生物堿的水解和釋放有關(guān)[7-8]。本研究結(jié)果與文獻結(jié)果一致。

2 mg/mL是訶子制草烏毒性作用的轉(zhuǎn)折點，該劑量下，訶子制草烏對心肌細胞的抑制作用強于生草烏。本課題組前期研究表明，用清水浸泡的生草烏中雙酯型生物堿的含量低于訶子制草烏[6]，說明在水浸泡過程中，雙酯堿仍可少量水解，而訶子湯有明顯抑制生物堿水解的作用。當給藥濃度≤2 mg/mL時，生草烏中的雙酯型生物堿在培養(yǎng)基中部分水解成低毒的單酯堿，而訶子制草烏大部分仍以雙酯堿原型存在，加之劑量較小，其緩釋作用得不到體現(xiàn)（劑量小于單位時間內(nèi)的釋放量），表現(xiàn)為毒性大于生草烏。

而當劑量開始增加至4 mg/mL以上（此劑量遠超過草烏產(chǎn)生毒性的臨界劑量）時，生草烏中即使有部分雙酯堿水解，其剩余的雙酯堿含量仍可致顯著毒性，表現(xiàn)為短期內(nèi)毒性急劇上升，達到峰值后維持穩(wěn)定;而訶子制草烏由于訶子抑制雙酯堿釋放的特點，在短時間內(nèi)，只能部分雙酯型生物堿被釋放，使藥材毒性以比較緩慢的速度增長，12 h左右方能達到峰值，而后趨于穩(wěn)定。因此，訶子制草烏的毒性整體上低于生草烏。同時，大于4 mg/mL的劑量又可以分為兩部分，其中4～6 mg/mL可視為中劑量，8～10 mg/mL可視為高劑量。中劑量下，訶子制草烏24 h的累積釋放量仍然低于生草烏，隨著時間延長，二者毒性差距逐漸增大;高劑量下，訶子制草烏24 h的累積釋放量可與生草烏相當，二者毒性趨于一致。

本研究結(jié)果表明，生草烏和訶子制草烏均能抑制炎癥因子NO、TNF-α、IL-6的釋放，但生草烏對NO的抑制作用弱于訶子制草烏，對TNF-α、IL-6的抑制作用強于訶子制草烏，故結(jié)合毒性結(jié)果，可以很好的證明生草烏經(jīng)訶子湯炮制后可達到“減毒存效”的目的。

綜上，訶子可顯著抑制生草烏的心肌細胞毒性，尤其是中劑量（4～6 mg/mL）使用時，其訶子炮制品能表現(xiàn)出比生草烏更高、更持久的安全性;而當劑量過高（8～10 mg/mL）時，如果持續(xù)作用時間較長，其累積毒性作用也能達到與生草烏相當?shù)乃?，但在短時間內(nèi)（4 h以內(nèi)）的毒性仍明顯低于同劑量生草烏。訶子制草烏除能達到減毒作用以外，其抗炎作用也不低于生草烏，但二者對不同炎性指標的抑制作用表現(xiàn)不同，這可能與二者生物堿的組成不同[12]有關(guān)。

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（收稿日期：2020-07-05 修回日期：2020-10-28）

（編輯：鄒麗娟）