響應面法優(yōu)化馬克斯克魯維酵母干燥保護劑的研究

周 櫻，王紹云，陳祺琛，陳新偉，詹志春，呂 紅

（1.復旦大學生命科學學院，上海 200433；2.武漢新華揚生物股份有限公司，湖北武漢 430206）

馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）被認為是一種安全可食用的酵母，2013 年被批準為新食品原料。同時有大量研究表明，馬克斯克魯維酵母能改善腸道菌落環(huán)境，抑制有害菌生長（Nooraee 等，2010），提高機體免疫力（Kurtzman等，1997）；其酵母細胞壁中的葡甘露聚糖具有吸附排除毒素的作用（Piotrowska 和Masek，2015）；能消耗腸道中的乳糖，從而降低動物乳糖不耐癥（Rubio，2006）；提高動物對飼料中纖維素、脂質等營養(yǎng)物質的消化吸收（Hong 等，2007 ；Deive 等2003）。同時，馬克斯克魯維酵母還具備一般酵母菌不具有的獨特優(yōu)勢，如其具有較快的 生 長 速 率（Groeneveld 等，2009 ；Fonseca 等，2008）和較高的生物量（Lane 等，2011），從而有利于降低生產成本；另外，其最高可在48℃的高溫下正常生長（Flores 等，2000），而其他酵母菌（如釀酒酵母等）則難以耐受35℃以上的溫度，這使得馬克斯克魯維酵母具有較強的適應能力，更適合于工業(yè)生產中的熱風干燥，同時也更能抵抗飼料加工過程中的加熱、干燥、擠壓和振動而保持活性。因此，馬克斯克魯維酵母十分適合于用作飼料添加劑。

目前，關于馬克斯克魯維酵母的分子生物學、發(fā)酵工藝、應用開發(fā)等方面的研究都已有研究人員開展了相應研究，而關于其后處理制備工藝方面的研究基本沒有。本研究主要對馬克斯克魯維酵母在熱風干燥過程中的保護劑進行選擇，采用響應面法對保護劑的組成進行優(yōu)化，為以后的工業(yè)生產提供數據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 馬克斯克魯維酵母CGMCC 10621，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

（1）YEPD 培養(yǎng)基：由酵母浸出物10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，定容至1 L。固體培養(yǎng)基需添加20 g 瓊脂。

（2）發(fā)酵培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基中含40 g 酵母粉和50 g 葡萄糖，pH 調為5.0。

所有培養(yǎng)基的滅菌條件為115 ℃下滅菌15 min。

（3）主要試劑：海藻糖購自河北林康生物科技有限公司，司盤60（Span 60）和吐溫80（Tween 80）購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 試驗儀器 IS-RDH1 臥式恒溫振蕩器，FUS30 發(fā)酵罐，XA2/500-UK 廂式壓濾機，E50 單螺桿擠出機，XYT-3 流化制粒包衣機，AR2140精密分析天平，SPX-250B Ⅲ生化培養(yǎng)箱，YM100立式壓力蒸汽滅菌器，SF-CF-1A 超凈工作臺。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程 試管斜面菌種→三角瓶菌種→30 L 發(fā)酵罐→廂式壓濾機→鮮酵母泥→加保護劑→制?！骰哺稍?/p>

1.2.2 活菌數的測定 以YEPD 培養(yǎng)基為計數培養(yǎng)基，采用梯度稀釋平板計數法進行測定。

1.2.3 Box-Behnken 優(yōu)化試驗設計 采響應面法優(yōu)化由司盤60、吐溫80 和海藻糖3 種保護劑組成的復合保護劑。以三者的添加量為試驗因子，以干酵母活菌數為響應值，采用Design Expert 8.0.6 軟件進行Box-Behnken 響應面試驗設計和分析，試驗因子水平及編碼表如表1 所示，具體的試驗設計如表2 所示。

表1 Box-Behnken 設計試驗因子水平及編碼

1.2.4 數據統(tǒng)計及分析 試驗數據采用Design Expert 8.0.6 軟件進行響應面試驗數據分析、回歸模型建立及圖形分析。

2 結果與分析

2.1 復合保護劑的響應面法優(yōu)化酵母干燥過程中常見的保護劑主要有司盤60、吐溫80 等乳化劑（Suryabhan 等，2019 ；Camara 等，2018 ；周亞男等，2017 ；王華和賀金梅，2013 ；張建峰等，2011 ；陳毛清和趙華，2006），海藻糖、蔗糖等小分子糖類，抗壞血酸等抗氧化劑類，L-谷氨酸鈉、L- 半胱胺鹽酸鹽等氨基酸類。經過文獻對比分析和初步試驗篩選，確定以司盤60、吐溫80 和海藻糖為復合保護劑組分，采用響應面法對復合保護劑的配比進行優(yōu)化。

以干酵母活菌數（Y）為響應值，以司盤60（A）、吐溫80（B）和海藻糖（C）的添加量為試驗因子，根據表2 中的試驗設計方案進行試驗，所得試驗結果如表2 所示，相關的方差分析結果則見表3。

表2 馬克斯克魯維酵母復合保護劑的響應面優(yōu)化試驗設計方案及結果

根據表2 的數據進行分析，得到多元二次回歸方程：Y=-1636.65+883.89A+1230.48B+1025.09C+21.88AB+160.00AC-511.88BC-349.00A2-347.13B2-252.75C2。

如表3 所示，回歸模型的F 值為26.82，P 值=0.0001 ＜＜0.01，而失擬項P=0.7721 ＞0.05，說明上述回歸方程擬合良好，所建立的模型極顯著，因此，可用其對響應值Y（干酵母活菌數）進行分析和預測。此外，該模型的決定系數R2=0.9718 表示此模型能在97.18% 程度上解釋響應值Y 與各變量因子之間的關系；同時，調整決定系數R2adj=0.9356，與R2的值接近，且均接近于1，進一步說明兩者相關性很好，模型擬合程度高。模型變異系數（coefficient of variation，CV）是衡量模型精密度和可靠性的重要評價指標，數值越小表示模型精密度越高（肖懷秋等，2017），本模型CV=3.73%，表明此模型的精密度和可靠性較高，可用于分析響應值的變化。綜上可知，由該模型得到的預測值與實際值可保持較高的一致性。

表3 馬克斯克魯維酵母復合保護劑的回歸模型方差分析表

從P 值來看，模型中的一次項A、C、交互項BC 對干酵母活菌數的影響極顯著（P ＜0.01）；二次項A2、B2的影響顯著（P ＜0.05）；其他項的影響均不顯著。同時，各試驗因子的F 值反映了該試驗因子對響應值的影響程度，若F 值較高，該試驗因子對響應值的影響較大（Prabhu等，2017）。 由 表3 可 知，FA=12.79，FB=1.18，FC=182.83，因此，這3 個因素對干酵母中活菌數的影響大小順序為：C ＞A ＞B，即海藻糖對馬克斯克魯維酵母干燥影響最大，其次為司盤60，吐溫80 的影響最小。張建峰等（2011）在優(yōu)選釀酒活性干酵母（AADY）生產中所用的干燥保護劑時發(fā)現，海藻糖的保護效果最佳，吐溫80 和司盤60 其次。郭蓉（2013）采用單因素試驗篩選低高級醇刺葡萄酒酵母菌的干燥保護劑時也獲得了相同的試驗結果。

根據得到的回歸模型，利用Design-Expert 軟件繪制出不同因子的響應曲面圖，圖1 分別表示海藻糖（C）、吐溫80（B）、司盤60（A）取零水平時余下的兩個因子對干酵母活菌數的影響。

響應曲面的陡峭程度表示變量因子對響應值影響的大小，由圖1 可見，海藻糖對馬克斯克魯維干酵母活菌數的影響極顯著，司盤60 其次，而吐溫80 的影響不顯著。而從等高線圖來看，只有吐溫80 和海藻糖添加量的交互作用對干酵母活菌數的等高線圖為明顯的橢圓形，表明二者的交互作用顯著。

采用Design-Expert 軟件對該模型進行分析，得到馬克斯克魯維酵母熱風干燥復合保護劑的最 佳 配 比 為：1.44% 司 盤60、1.08% 吐 溫80 和1.00% 海藻糖，相應的最高活菌數為3.203×1010CFU/g。為實際應用方便，可將該保護劑的最佳添加比例調整為1.45% 司盤60、1.05% 吐溫80 和1.0%海藻糖。該比例與表3 中的第6 組試驗（1.4%司盤60、1.0% 吐溫80 和1.0% 海藻糖）的保護劑比例非常接近，試驗組6 的活菌數為3.188×1010CFU/g，與預測值基本相同，表明該試驗設計方法可用于馬克斯克魯維酵母熱風干燥中的復合保護劑的優(yōu)選。

圖1 海藻糖、吐溫80 和司盤60 添加量的交互作用對干酵母活菌數的影響的響應曲面圖和等高線圖

3 結論

通過對馬克斯克魯維酵母保護劑的研究發(fā)現，司盤60、吐溫80 和海藻糖在馬克斯克魯維酵母熱風干燥過程中具有較好的保護作用。采用響應面法優(yōu)化馬克斯克魯維酵母復合保護劑，得到最優(yōu)的復合保護劑為：司盤60 質量分數為1.45%，吐溫80 為1.05%，海藻糖為1.0%，在此保護劑作用下，馬克斯克魯維干酵母活菌數可達到3.2×1010CFU/g，與實際試驗結果相符，表明該模型具有應用意義，對馬克斯克魯維活性干酵母的工業(yè)化生產具有一定的指導作用。