模式生物斑馬魚模型在方藥研究中的應(yīng)用＊

岳勤霏，劉 默，范欣生＊＊，余 黎

（1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 南京 210023；2. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 南京 210023）

斑馬魚又稱藍條魚、花條魚，原產(chǎn)于印度、孟加拉國等地，是一種常見的熱帶淡水魚，體型小，成魚體長4-6 cm，易飼養(yǎng)，繁殖能力強，四季產(chǎn)卵，產(chǎn)卵量大且為體外受精，體外發(fā)育[1]。斑馬魚模型與其他哺乳動物模型的生理、生化特征相似，與人類基因同源性達到87%[2]。其胚胎及幼苗早期光學(xué)透明，易于直觀觀察其特定生理病理變化，且便于實驗操作，可用于觀察藥物對復(fù)雜生命過程的影響。作為整體實驗動物模型，斑馬魚從整體水平評估藥物的治療效果及毒副作用，不僅篩選周期短，實驗費用低，易于操作觀察，且具有高效、快速、大規(guī)模的特點，是目前生命科學(xué)研究中重要的模式脊椎動物之一[1,3]。

斑馬魚模型應(yīng)用于中醫(yī)藥研究，在毒理、活性成分篩選、藥效評價和代謝研究等方面發(fā)揮著重要作用。中藥或復(fù)方成分復(fù)雜，影響因素眾多，限制了細胞篩選體系和分子篩選體系的應(yīng)用，特別是在以有效部位、提取物甚至水煎劑為研究對象時則更加困難[4]。斑馬魚給藥方式多樣，可以通過皮膚和腮吸收小分子化合物，受精72小時的斑馬魚也可以通過吞咽吸收藥物[1]，成魚也可通過插管灌胃給藥[3]，對于成分復(fù)雜的中藥樣品具有很好的適應(yīng)性[5]，可用于中藥及復(fù)方等復(fù)雜成分體系的藥效評價及機制研究?；谝陨蟽?yōu)點，斑馬魚模型同樣適用于方劑配伍規(guī)律研究。目前，斑馬魚疾病模型涉及廣泛，包括血液疾病、心血管疾病、肌肉疾病、骨骼疾病、五官科疾病、傳染病以及腫瘤等[6]，用于抗炎與抗氧化損傷、調(diào)節(jié)血管新生、抗骨質(zhì)疏松以及抗神經(jīng)損傷等方藥的效應(yīng)機制及配伍規(guī)律研究。

1 斑馬魚模型在方藥研究中的應(yīng)用

1.1 抗炎與抗氧化損傷方藥研究

轉(zhuǎn)基因、誘導(dǎo)突變和反義morpholino knockdown及活體成像等技術(shù)的應(yīng)用，使得斑馬魚模型成為研究炎癥免疫疾病相關(guān)的病理生理學(xué)的良好模式生物[4]，如Tg（coro1α:eGFP;lyz:Dsred）中性粒細胞與巨噬細胞雙標(biāo)志轉(zhuǎn)基因斑馬魚[7]、巨噬細胞熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚(zlyz:egfp)[8]等基因型斑馬魚的建立。斑馬魚炎癥模型主要有細菌感染模型、病毒性感染模型、創(chuàng)傷性模型[7]以及硫酸銅溶液誘導(dǎo)模型。過氧化氫（H2O2）被廣泛用作誘導(dǎo)細胞和斑馬魚氧化損傷的氧化劑，研究表明，斑馬魚是研究H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的可用模型[9，10]。

Zhou J等以脂多糖（LPS）建立斑馬魚炎癥模型，測量5 種炎癥細胞因子和6 種靶向蛋白的基因表達并進行脂質(zhì)組學(xué)分析以鑒定潛在的脂質(zhì)標(biāo)記物以闡明黃連解毒湯（HLJDD）全面的抗炎活性機制。結(jié)果表明，HLJDD 改善了大多數(shù)脂類攝動，具有很強的抗炎功效。Toll 樣受體4/髓樣分化因子88 TLR4/MyD88 的激活在炎癥過程中起著至關(guān)重要的作用，而相應(yīng)的脂蛋白（例如PLA2，SGMS 和SMDP）為脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)與TLR4/MyD88 信號通路之間的重要中間體[11]。彭維兵等以硫酸銅溶液誘導(dǎo)巨噬細胞熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚炎癥模型，以斑馬魚側(cè)線炎癥病灶中巨噬細胞數(shù)量的影響評價昆海姜辛湯（褐藻多糖、昆布多糖、細辛脂素、姜辣素）及其組分配伍抗炎作用，結(jié)果表明昆海姜辛湯的合方組分配伍具有抗炎功效且寒熱組分配伍較寒寒配伍及熱熱配伍效應(yīng)明顯[8]。杜婷婷等復(fù)制硫酸銅誘導(dǎo)中性粒細胞熒光斑馬魚炎癥模型，冰乙酸、佛波酯誘導(dǎo)AB 系斑馬魚外周、中樞疼痛模型，定量評價如意珍寶丸（沉香、珍珠母、香旱芹、石灰華等）的抗炎鎮(zhèn)痛療效，結(jié)果表明如意珍寶丸具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用[12]。Li L 等利用硫酸銅溶液誘導(dǎo)斑馬魚炎癥模型評價衢州枳殼提取物（QFAE）的抗炎活性，顯示QFAE 能減少炎癥部位的中性粒細胞數(shù)量，有明顯的抗炎作用[13]。Ji M 等以H2O2誘導(dǎo)的氧化損傷斑馬魚研究發(fā)現(xiàn)菊苣酸可以減少活性氧（ROS）和丙二醛（MDA）的產(chǎn)生，激活抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）以及Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1/核因子E2 相關(guān)因子2/血紅素加氧酶1（Keap1/Nrf2/HO-1）抗氧化途徑，通過抗氧化而保護肝損傷[14]。

抗炎方藥藥效評價多應(yīng)用轉(zhuǎn)基因斑馬魚，以中性粒細胞、巨噬細胞定量為主。因斑馬魚幼魚身體透明，可直接使用顯微鏡觀察，此種方法較為直觀可靠。同時，斑馬魚也可用于試劑盒檢測，許多哺乳動物類實驗動物氧化損傷相關(guān)指標(biāo)，斑馬魚模型同樣適用，例如ROS、MDA、SOD 等。炎癥與氧化損傷是與許多人類疾病相關(guān)的復(fù)雜病理過程。許多疾病的發(fā)病機制與炎癥、氧化損傷密切相關(guān)，例如呼吸系統(tǒng)疾病哮喘、慢性阻塞性肺疾病以及特發(fā)性肺纖維化等。斑馬魚作為重要的模式脊椎動物之一，已經(jīng)建立了成熟的炎癥以及氧化損傷模型，其應(yīng)用對于深入研究方藥抗炎抗氧化作用機制以及配伍作用規(guī)律具有重要意義。

1.2 調(diào)節(jié)血管新生方藥研究

斑馬魚生長發(fā)育迅速，其心血管循環(huán)系統(tǒng)可在受精后48 小時完成發(fā)育，受精24 小時左右血液循環(huán)完成[15]。斑馬魚胚胎及幼體透明利于活體觀察。目前，研究中常用造模方式為VEGF 受體抑制劑（VRI）誘導(dǎo)、PTK87 誘導(dǎo)以及移植瘤等，以節(jié)間血管（SIV）以及腸下血管（SIVs）的生長情況等為觀測指標(biāo)。內(nèi)皮細胞標(biāo)記綠色熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(fli-1:EGFP)、TG（VEGFR2:GFP）系血管熒光轉(zhuǎn)基因斑馬魚和Tg（kdrl:mCherry）轉(zhuǎn)基因斑馬魚常用于調(diào)節(jié)血管新生方藥研究當(dāng)中。

LIN P 等研究表明當(dāng)歸補血湯可促進血管新生，且黃芪∶當(dāng)歸＝5∶1 時效果最佳，黃芪和黃芪甲苷Ⅳ的效果優(yōu)于當(dāng)歸和阿魏酸[16]。Hu F 等使用轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎模型研究丹參葛根湯（丹參、葛根）的血管新生作用，結(jié)果表明該方增強了斑馬魚胚胎的腸下血管（SIVs）的萌發(fā)[17]。陳錫強等采用血管熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎研究西黃丸（牛黃、麝香、乳香、沒藥）及其組方藥味對斑馬魚節(jié)間血管形成的影響，結(jié)果顯示西黃丸中抑制血管生成作用與單味中藥材的活性密切相關(guān)，其中乳香與人工牛黃是發(fā)揮作用的主要藥味[18]。黃志軍等將熒光標(biāo)記的人乳腺癌細胞移植入斑馬魚卵黃囊內(nèi)建立移植瘤模型，評價小金膠囊（麝香、木鱉子、制草烏等）的抗腫瘤作用；用血管熒光Fli-1 系斑馬魚觀察其對新生血管形成的抑制作用，結(jié)果表明小金膠囊能誘導(dǎo)細胞凋亡，抑制MCF-7 移植瘤生長和新血管形成，具有潛在的抗腫瘤作用[19]。周忠焱、朱思行等采用VRI 誘導(dǎo)Tg(Fli-1:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚建立血管損傷模型，結(jié)果表明通陽活血方（桂枝、三棱、莪術(shù)）、活血軟堅方（三棱、莪術(shù)、海藻、牡蠣）具有促血管新生的作用，其機制可能與其上調(diào) VEGF 受體 VEGFR-1、2、3(flt1、kdr、kdrl)的表達有關(guān)[20，21]。Wang Y 等采用 Tg(fli-1a:EGFP)y1 轉(zhuǎn)基因斑馬魚研究得出鹽酸川芎嗪和芍藥甙通過劑量依賴性方式恢復(fù)VRI 誘導(dǎo)的斑馬魚血管不足，二者協(xié)同作用更佳[22]。

因評價方式單一，斑馬魚在調(diào)節(jié)血管新生方藥研究中以篩選優(yōu)效方藥及機制研究為主，但配伍劑量比以及藥物協(xié)同作用也有研究。斑馬魚具有的獨特優(yōu)勢使得其在發(fā)育與相關(guān)疾病研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，但目前對于機制研究并不深入。

1.3 抗骨質(zhì)疏松方藥研究

斑馬魚是骨形成和骨吸收活動的完整體系[23]，骨骼結(jié)構(gòu)和遺傳學(xué)與人類有高度的相似性，是用于研究骨骼變形和發(fā)育異常的成熟動物模型[24]。斑馬魚在抗骨質(zhì)疏松藥物篩選中觀測指標(biāo)有斑馬魚脊椎骨的熒光強度、魚骨膠原蛋白馬松染色、魚鱗片鈣、磷含量測定、堿性磷酸酶、羥脯氨酸含量測定[25]，骨礦化程度[26，27]等，主要以糖皮質(zhì)激素地塞米松或潑尼松龍誘導(dǎo)建立斑馬魚骨質(zhì)疏松模型。

尹恒、錢哲等以糖皮質(zhì)激素建立斑馬魚骨質(zhì)疏松模型，研究表明龜鹿二仙膠（鹿角、龜板、人參、枸杞子）對骨質(zhì)疏松斑馬魚模型鱗片中鈣、磷含量均有上調(diào)作用，通過上調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）/Smad信號通路的上游蛋白TGF-β1、TGF-β2 及下游蛋白Smad3來實現(xiàn)通路的激活，從而促進I型膠原蛋白的合成與分泌，調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子?B（NF-κB）和活化蛋白（AP-1）抑制炎癥反應(yīng)以治療骨質(zhì)疏松[28，29]；左歸丸（熟地黃、菟絲子、牛膝、龜板膠、鹿角膠、山藥、山茱萸、枸杞子）可通過逆轉(zhuǎn)骨形成/骨吸收的不平衡和激活TGF-β/Smad 信號通路來預(yù)防骨質(zhì)疏松癥[30]。景莉君采用潑尼松龍誘導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松模型，研究得出接骨湯具有促進骨生成、防止骨丟失作用[31]。譚登等以潑尼松龍建立斑馬魚骨質(zhì)疏松模型，采用椎骨熒光面積、堿性磷酸酶（ALP）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2b（BMP-2b）、人類相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 2（Runx2）、組織蛋白酶K(CTSK)、抗酒石酸酸性磷酸酶5b（TRACP-5b）、活化T細胞的核因子，細胞質(zhì)1（NFATC-1)基因表達水平評價了補腎通絡(luò)方（骨碎補、淫羊霍、白芍、茯苓、續(xù)斷、全蝎、蜈蚣、炙甘草）干預(yù)骨質(zhì)疏松的效應(yīng)并進行拆方研究。結(jié)果表明，補腎通絡(luò)方具有抗骨質(zhì)疏松活性，且通絡(luò)方（全蝎、蜈蚣）可明顯改善骨質(zhì)疏松，而補腎通絡(luò)方逆轉(zhuǎn)骨量流失的作用則更為顯著，與大鼠模型具有一致性[32]。蔣蓉等人采用對糖皮質(zhì)激素復(fù)制斑馬魚骨質(zhì)疏松模型，評價桃紅四物湯（桃仁、紅花、熟地黃、當(dāng)歸、川芎、白芍）以及紅花主要成分羥基紅花黃A（HYA）的治療作用及其機制。結(jié)果表明，斑馬魚的骨礦化面積和累積光密度值有顯著性地升高,且呈劑量依賴性，ALP、I 型膠原蛋白 (type I)、Runx2、血清骨保護素(OPG)、TRACP-5b、骨鈣素(OCN)基因的表達也有明顯增加, Ca、P、K、Mg、Zn 和Fe 水平均顯著高于潑尼松龍組。桃紅四物湯通過增強成骨細胞活力,促進骨膠原表達和骨礦化，增加骨量，從而逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松且其君藥紅花主要成分HYA 具有促進骨礦化, 提高成骨細胞活性的作用，說明紅花作為君藥在桃紅四物湯抗糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松中發(fā)揮重要作用[33，34]。

斑馬魚骨質(zhì)疏松模型的建立，既保持了在體動物的完整性，又克服了體外實驗作用環(huán)節(jié)單一，難以體現(xiàn)整體模型綜合效應(yīng)的缺陷[35]。此外，有研究者提出基于斑馬魚模型采用M-Act/Tox 一體化評價（中藥的效應(yīng)/毒性產(chǎn)生與其在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化）高效篩選抗骨質(zhì)疏松中藥。該方法是關(guān)注體內(nèi)、外成分，兼顧有效性與安全性的抗骨質(zhì)疏松篩選新方法[36，37]。斑馬魚模型在抗骨質(zhì)疏松方藥研究中綜合展現(xiàn)了其高效、快速、大規(guī)模以及整體觀察的優(yōu)勢，不僅有對復(fù)方的研究，也有對復(fù)方拆方以及主要成分的研究，以闡述方劑配伍特點，對中醫(yī)藥抗骨質(zhì)疏松方藥研究具有一定的積極意義。

1.4 抗神經(jīng)損傷方藥研究

斑馬魚的整個神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)包括膽堿能多巴胺能和去甲腎上腺素能通路已經(jīng)被闡明，相比于其他無脊椎模型生物，斑馬魚出生后3 天就開始發(fā)育功能完好的血腦屏障[38]，且斑馬魚體型纖細，胚胎和幼魚時期透明，四天可形成完整的神經(jīng)系統(tǒng)，在胚胎時期可觀察到成熟完整的中樞神經(jīng)系統(tǒng)[39]，可通過特殊染色方法在完整的活體狀態(tài)下快速直觀檢測出神經(jīng)系統(tǒng)的器質(zhì)性損傷[40]。這些都說明了斑馬魚模型在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究上的優(yōu)勢。

王榮春等建立1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)誘導(dǎo)的斑馬魚神經(jīng)損傷模型，研究表明芪智消渴顆粒（黃芪、何首烏、益智仁、淫羊藿、雄蠶蛾、熟地、丹參、遠志、黃連等）能明顯逆轉(zhuǎn)MPTP 造成的游泳行為異常，提高斑馬魚的運動距離[41]。彭超寶等研究顯示桂枝甘草龍骨牡蠣湯類方對斑馬魚的運動行為有抑制作用，不同配伍對斑馬魚行為節(jié)律影響不同，其作用通路亦不盡相同[42]。Wang M 等建立6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷模型，結(jié)果表明谷精草提取物可以抑制6-羥基多巴胺在斑馬魚上引起多巴胺神經(jīng)元減少，其作用機制可能與降低一氧化氮（NO）的產(chǎn)生和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達量有關(guān)[43]。李曉穩(wěn)等蛋白組學(xué)分析斑馬魚神經(jīng)元模型損傷藥物干預(yù)前后總蛋白差異，尋找養(yǎng)血清腦顆粒（當(dāng)歸、川芎、鉤藤、白芍、夏枯草等）對斑馬魚神經(jīng)元損傷預(yù)后的生物標(biāo)記物及其作用機制，為養(yǎng)血清腦顆粒治療慢性腦供血不足篩選出預(yù)后標(biāo)志物[44]。

目前，組學(xué)已經(jīng)逐漸應(yīng)用到斑馬魚模型當(dāng)中，包括基因組學(xué)、蛋白組學(xué)以及代謝組學(xué)，從分子層面上揭示方藥多靶點多通路的復(fù)雜作用機制。

1.5 其他

除以上研究之外，斑馬魚模型還用于腦出血、脂質(zhì)代謝、色素研究等方面。如李瀟等以辛伐他汀誘導(dǎo)黑色素等位基因突變型Albino 品系斑馬魚建立腦出血模型，探索健脾益氣攝血方（黨參、白術(shù)、茯苓、炙甘草、黃芪、阿膠、茜草）及其拆方的防治效果，得出健脾方（黨參、白術(shù)、茯苓、炙甘草）和健脾益氣方（黨參、白術(shù)、茯苓、炙甘草、黃芪）對辛伐他汀誘導(dǎo)斑馬魚腦出血無防治效果；健脾益氣生血方（黨參、白術(shù)、茯苓、炙甘草、黃芪、阿膠）與健脾益氣攝血方顯示有良好防治效果，但高濃度具有毒性[45]。肖紅彥以肥胖斑馬魚為模型，從多方面證實地黃提取物可有效抑制斑馬魚的肥胖[46]。韓冰研究表明小檗胺對高血脂斑馬魚具有較好的降血脂效果，其分子機制可能是抑制膽固醇的合成和脂蛋白的組裝分泌，促進膽固醇的轉(zhuǎn)運和轉(zhuǎn)化[47]。王天晶研究表明菟絲子水提物對斑馬魚黑素細胞黑色素合成有抑制作用，且斑馬魚模型與其它模型具有較好的一致性[48]。

2 展望

斑馬魚幼魚是目前為止唯一適合高內(nèi)涵、高通量、微孔板的脊椎動物模型，適用于中藥復(fù)雜成分體系，既用于中藥物質(zhì)成分、提取物的研究，也用于單味藥、復(fù)方研究，在方藥研究中的應(yīng)用逐漸深入。方劑研究是方藥研究的重要組成部分，而配伍是方劑的重要環(huán)節(jié)。上述內(nèi)容表明斑馬魚模型也可應(yīng)用于方劑配伍規(guī)律研究當(dāng)中。斑馬魚模型可在應(yīng)用于方藥效應(yīng)評價和機制研究的基礎(chǔ)上，篩選方藥活性成分，分析方劑組方配伍特點，探討方劑最佳藥物組成配比等。此外，代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等也應(yīng)用到斑馬魚模型當(dāng)中，使得模式動物斑馬魚在方藥研究中的應(yīng)用更加豐富和深入。斑馬魚模型也有局限性，例如斑馬魚給藥方式以及藥物吸收方式與人或其他哺乳類動物模型存在差異，一定程度上可能影響藥物效應(yīng)評價結(jié)果；斑馬魚研究方法、檢測指標(biāo)較其他動物模型少，可用的抗體較少，蛋白水平研究存在一定困難。目前，盡管許多方藥通過建立斑馬魚模型證實其藥效，但研究結(jié)果多數(shù)局限于相應(yīng)的效應(yīng)指標(biāo)，而對于單體、提取物、復(fù)方的作用機制研究尚不深入，需進一步探索。

綜上，斑馬魚作為低成本、高效、快速的實驗動物模型，理應(yīng)在中醫(yī)藥發(fā)展中充分利用。斑馬魚生物模式處于發(fā)展階段，斑馬魚模型開展中藥復(fù)方的研究逐漸增多。結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論、臨床實踐及現(xiàn)代研究進展，未來應(yīng)用斑馬魚模式生物開展方藥配伍規(guī)律、劑量關(guān)系等研究將是中醫(yī)藥研究的方向之一，對指導(dǎo)中醫(yī)臨床用藥具有重要作用。