把握細節(jié)，提高豬場非洲豬瘟熒光PCR檢測結果的準確性

于新友，陳金龍，王金良，沈志強*

（1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600）

隨著非洲豬瘟在全國范圍內發(fā)生和流行，豬場引種、人員、車輛、入場物品、豬場環(huán)境等都需要進行非洲豬瘟病毒檢測，以防疾病傳入。雖有第三方檢測實驗室從事非洲豬瘟病毒核酸檢測工作，但一則收費高，二則因距離遠樣品不能及時送達，實驗室檢測樣本量不能及時出具結果，各豬場均有自建實驗室檢測的強烈需求。國家相關允許豬場自行檢測非洲豬瘟病毒政策的出臺，客觀上推動了非洲豬瘟病毒熒光PCR 在豬場實驗室的廣泛應用。影響熒光PCR 檢測因素眾多，涉及實驗室硬件、儀器、試劑、人員素質、技術水平、管理水平等方面，即使是豐富經驗的人員仍不免遇到各種問題，導致檢結果不準確，造成一定的損失。為獲得準確可靠的結果，需要從儀器選擇、試劑耗材等物品準備和操作細節(jié)上做好把控，筆者就熒光非洲豬瘟病毒核酸熒光PCR 檢測的各方面進行探討，希望能對基層實驗室非洲豬瘟病毒核酸檢測人員提供參考。

1 科學規(guī)劃設計實驗室

PCR 檢測實驗室選址要遠離豬場，做好分區(qū)，建設高標準實驗室，控制氣流方向。必備物理分區(qū)，樣本處理區(qū)、核酸制備區(qū)、擴增區(qū)，人員、物品單向流動。每個區(qū)域固定專用移液器、帶濾芯槍頭、離心管、一次性手套、工作服等，嚴禁帶出本區(qū)域[1]。

2 加強人員管理和培訓

嚴格控制人員進出，與檢測無關的人員不得隨意進出實驗室。檢測人員專人專崗，獲得相應資格后方可上崗，定期培訓和考核，以提升檢測人員的檢測技能[2]。盡量減少在實驗區(qū)內不必要的走動。在實驗操作過程中，嚴格遵守相關規(guī)程，穿戴一次性的防護服、頭套、口罩、手套和鞋套。離開實驗室時脫掉，與實驗廢棄物統(tǒng)一經高壓滅菌處理。

3 科學選擇設備儀器和試劑

選用的儀器設備會影響實驗結果的準確性，不同實驗室應根據(jù)自己需求選擇不同價格的儀器和設備。同有經驗的實驗室交流，購買優(yōu)質PCR儀器。在其他條件都相同的條件下，僅儀器的不同造成的結果差異就非常大。核酸自動提取儀器要可防氣溶膠污染。離心機要用轉速能達12000 r·min-1。儀器設備定期維護和保養(yǎng)，一旦發(fā)現(xiàn)異常應當及時維修，以保證儀器正常運轉，確保檢驗結果科學準確。

市場上非洲豬瘟檢測試劑盒品種繁多，價格和差別較大，即使經過農業(yè)部比對的公司生產的非洲豬瘟檢測產品也是種類多樣。僅核酸擴增部分試劑價格國產試劑一般每份20元，價格最低可到幾元，國外一般每份80 元。按試劑盒的要求妥善保存試劑，避免使用偽劣、過期或失效試劑。豬場為降低成本，也可根據(jù)一些OIE、國家或行業(yè)標準等權威資料公布的引物和探針，合成并購買試劑進行檢測，但對人員要求極高，一定要跟市場上口碑好的試劑盒充分比對，對各種反應條件進行優(yōu)化，否則會漏檢率增加，給豬場造成不必要的損失。

4 科學選擇樣品

與送樣人員保持溝通，提前了解要檢測樣本量，做好充分準備，以免試劑不足。樣本采集種類，運輸和保存條件，能否及時檢測都影響檢測結果的準確性。豬場檢測中應用較多的是非洲豬瘟病毒日常監(jiān)測及發(fā)病后精準清除，樣本涉及組織、血液、精液、口鼻拭子、唾液、環(huán)境樣本等多方面。樣本要新鮮，及時檢測，減少凍融次數(shù)[3]。采集抗凝血時抗凝劑選用EDTA，充分混勻，不要用肝素，肝素會抑制PCR 反應。制備血清時，采血靜置一段時間，不顛簸，不冷凍，防溶血。豬唾液樣本采集前4 h，停水、停料，保證樣品不含食物殘渣，不被稀釋，最好加核酸保護劑。人員、環(huán)境樣本可用棉拭子或紗布采集，盡量做到環(huán)境全覆蓋。飼料樣本生理鹽水浸泡后取上清，必要時透析袋濃縮后檢測。水樣為提高檢出率，也要濃縮，部分資料提出可用0.22 μm濾器濃縮濃度做法筆者并不認同，有待于進一步驗證。所采集樣本要冷鏈保存和運輸。為降低檢測工作量和檢測成本費用，可根據(jù)實際需要，將不同樣本混樣檢測?；鞓颖壤灰^高，否則容易導致假陰性?；鞓訖z出陽性者，需要不同樣品分開重新單獨檢測。檢測樣品要做好留樣備份，做好登記，標記清晰，防止樣品間交叉污染。檢測疑似陽性樣品，應單獨保存。在樣品復核和送檢完成后對樣品及時進行無害化處理。

5 提取高質量核酸

核酸制備的質量關系到檢測結果的準確性。核酸制備方式有傳統(tǒng)煮沸裂解法、柱式法和磁珠法三種。煮沸裂解法通過幾種組分快速處理樣本，快速釋放病毒核酸，操作速度快，能滿足組織及血樣本快速篩查，但制備核酸不純，干擾物質多。實驗室中不能常用，否則易形成氣溶膠污染。柱式法對實驗人員經驗要求高，適合少量樣本的高頻次提取操作，人為操作影響因素多。磁珠法機器操作，自動化程度高，適合大量樣本檢測，但儀器試劑成本高。無論哪種方式，不同廠家試劑盒優(yōu)劣不同，慎重選擇購買。核酸提取時動作輕柔，減少氣溶膠的產生，防止樣品間交叉污染。對環(huán)境樣本、飼料樣本、豬口鼻拭子等低病毒含量樣本需要采用磁珠法或柱式提取法提取核酸，樣本不要滅活，否則降低檢測敏感性，導致漏檢。核酸提取后，所有耗材及液體均要置于含消毒液的自封袋中，封口包裝，避免實驗室核酸氣溶膠污染。核酸提取后室溫防止易降解，最好直接用于擴增檢測或-20 ℃保存。

6 注意操作細節(jié)

柱式法核酸提取時，離心管標記清晰，以防洗滌時酒精流出，破壞樣品標記，最后一步，延長離心時間，去除殘留酒精，防止干擾PCR 反應。在生物安全柜內加樣前，紫外燈照射30 min，物品有規(guī)律擺放，合理分區(qū)，凈區(qū)在左邊，污區(qū)在右邊。廢棄槍頭打入帶蓋10%84 消毒液中，消毒液最好先用現(xiàn)配，最長使用時間≤3 d。PCR反應管選取質量好的，蓋子一定密封嚴格，以防擴增PCR產物揮發(fā)。移液器吸頭選擇細長、帶濾芯的以降氣溶膠污染風險。PCR反應試劑化凍后，先斡旋震蕩，再瞬時離心，根據(jù)檢驗需要，分裝成小份，減少反復凍融次數(shù)，以防降低試劑檢測效果。陽性對照每次使用前都要先斡旋震蕩，再離心，管蓋口朝上放置。減少各試劑在室溫中時間，不必冰上操作，因某些實驗室碎冰獲取不方便，且因疏忽可能或在試劑管中帶入水份，影響試劑性能。加樣時操作者需戴手套，動作輕柔，防止將模板吸入加樣器內或濺出離心管外，導致樣本間交叉污染。加樣時遵循從低濃度到高濃度的順序[4]，先加陰性對照，再加檢測樣品，最后加陽性對照。槍頭用完后，盒隨手關閉，吸取陽性樣本和待檢樣本后，嚴禁從槍頭上方經過。加樣用槍頭打入10% 84 消毒液瓶中，蓋上蓋子。加樣后，試劑管蓋和PCR 反應管蓋一定要蓋緊，避免多次開關蓋，避免熒光物質泄漏外漏，瞬時離心混勻，避免氣泡產生，致結果不準確，加上后盡快上機擴增，防止探針淬滅[5]。不要在管蓋或管體上做標記，以免影響試驗結果。

每次試驗設置陰性對照和陽性對照，必要時增加陰性對照設置數(shù)量，對不同操作節(jié)段進行監(jiān)控，隨機放于擴增樣品中間，陽性對照不要用強陽樣本，尤其不要用強陽性質粒做陽性對照，陽性對照包括提取陽性對照和擴增陽性對照，根據(jù)不同情況設置。PCR 結束后PCR 產物嚴禁開蓋，以防氣溶膠污染，檢測過程中用到的吸頭、離心管、PCR 反應管及時清理，放置于10%84 消毒液瓶中，蓋上蓋子，在遠離實驗室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應經消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，嚴禁高壓，因高壓并不能破壞核酸，反而有潛在實驗室核酸氣溶膠污染的風險。樣品處理過程中用過的廢棄槍頭、離心管等潛在被污染物品，要高壓處理，以防實驗室人為散毒。實驗結束后對實驗室內所有面、地面及墻面進行消毒，75%酒精空中噴霧，開啟紫外等照射4 h 以上。不用超過保質期的試劑盒，試劑盒保存合適的條件，忌多次反復凍融，儲存時將存放試劑的冰箱與病原或核酸存放冰箱分開，定期除霜，保證低溫。

7 結束語

非洲豬瘟病毒核酸檢測方法多種多樣，但目前來說，最適合豬大面積普及推廣使用的方法為熒光PCR 檢測法。當前市場上非洲豬瘟熒光PCR檢測試劑盒種類繁多，價格差別大，如何選擇對基層獸醫(yī)人員來說確實很困難，要向經驗豐富的同業(yè)人員請教，選擇口碑好，性價比高的試劑，或者自己開展一些性能評價工作，對比篩選，選取適合自己的最佳試劑盒。豬場實驗室也可以根據(jù)OIE 等權威單位公布的引物探針，自建檢測方法，但一定要購買質量好的PCR 試劑，充分做好比對驗證，經過確認后方可使用。

PCR檢測結果與臨床相結合，核酸檢測陽性只能表明樣本中有非洲豬瘟核酸，并不能說明有活病毒存在，病毒死亡時，核酸仍然能檢出，要結合臨床情況，盡管這樣一旦核酸檢測陽性也應該警惕，密切注意豬群狀態(tài)。對低拷貝樣本反復檢測時會出現(xiàn)時陰時陽的結果，如何判定結果常困擾檢測人員。根據(jù)核酸泊松分布原理，當核酸濃度低時可能會出現(xiàn)有時不能取到核酸，或取到的核酸不足以檢測出，因此，在保證環(huán)境管控良好的情況下只要出現(xiàn)一次陽性，判定為陽性。

實驗室進行非洲豬瘟病毒核酸檢測時要做好生物安全防控，嚴格遵守國家相關法律法規(guī)，防止一些潛在活性毒傳出，污染環(huán)境，對一些檢驗剩下的樣品及其他廢棄物，進行高壓滅菌處理。定期使用紫外線、臭氧、核酸去除劑等對生物安全柜、超凈臺、離心機及實驗室進行消毒。