快速溶劑萃取-GC-MS/MS法檢測(cè)可食淡水螺中5種常用殺蟲劑殘留量分析方法的建立

溫 韜 寧方堯 段玉林 李文奇 林 葵

(1.廣西壯族自治區(qū)工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南寧 530000；2.廣西壯族自治區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，南寧 530000; 3.廣西壯族自治區(qū)食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，南寧 530000;4.廣西壯族自治區(qū)輕工產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，南寧 530000; 5.廣西壯族自治區(qū)分析測(cè)試研究中心，南寧 530000)

我國(guó)有廣闊的淡水資源，據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前我國(guó)擁有淡水資源總量約為2.8萬億立方米，位列世界第四，約占全球水資源的6%[1，2]；淡水螺是指生活在淡水水域的軟體動(dòng)物，全世界約有近5000個(gè)品種，在我國(guó)，淡水螺目前主要分布在廣東、廣西、云南、福建等地，老百姓常食用的淡水螺有中華圓田螺、石螺、月光螺、耳河螺等[3-5]；我國(guó)不僅是殺蟲劑使用大國(guó)，也是殺蟲劑生產(chǎn)大國(guó)，啶蟲脒、噻蟲啉、辛硫磷、毒死蜱和異丙威是農(nóng)作物常使用的殺蟲劑，農(nóng)作物在施用殺蟲劑時(shí)，大部門的殺蟲劑散落到土壤中，隨著水系統(tǒng)循環(huán)而進(jìn)入到地表水，嚴(yán)重影響水生生物的生存環(huán)境[6-8]，淡水螺在受到殺蟲劑污染的水域生長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致淡水螺中毒，人們誤食用受到殺蟲劑污染的淡水螺肉時(shí)，可能導(dǎo)致頭暈、震顫等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可能導(dǎo)致惡心、嘔吐，甚至死亡[9，10]，因此，加強(qiáng)對(duì)可食淡水螺中常用殺蟲劑殘留的監(jiān)測(cè)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

關(guān)于食品中農(nóng)藥微量殘留的檢測(cè)方法主要有：色譜法[11-13](GC和HPLC)和質(zhì)譜法[14-16](HPLC-MSMS和GC-MSMS)兩種方法。色譜法(GC和HPLC)專屬性較差，出現(xiàn)假陽(yáng)性報(bào)告，且靈敏度較差，不適用于可食淡水螺中極微量殺蟲劑殘留的檢測(cè)；質(zhì)譜法中GC-MSMS法和HPLC-MSMS相比較，更適用沸點(diǎn)低的殺蟲劑檢測(cè)，靈敏度也更高；目前，關(guān)于可食淡水螺中殺蟲劑殘留檢測(cè)的報(bào)道較少，本實(shí)驗(yàn)研究建立了快速溶劑萃取-GC-MSMS法檢測(cè)可食淡水螺中5種常用殺蟲劑殘留量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

GC-MSMS儀：Shimadzu GC-2010 Pro型氣相色譜儀，配備自動(dòng)進(jìn)樣器、TQ-8040型三重四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)器、Lab-Solution工作站(日本島津科技有限公司)；石英毛細(xì)管色譜柱：Shimadzu Rtx-5 MS(0.25 mm×30 m，0.25 μm，日本島津科技有限公司)；快速溶劑萃取儀：APLE-3000型(北京吉天科技有限公司)；電子天平：mettler XS-205DU型(萬分之一，瑞士梅特勒托利多科技有限公司)；氮?dú)獯蹈蓛x：DSY-VI型(北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司)；冷凍離心機(jī)：TGL 20M型(上海赫田科學(xué)儀器有限公司)；純化水系統(tǒng)：Milli-Q 型4(美國(guó)密理博科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

標(biāo)準(zhǔn)溶液：啶蟲脒(GBW(E)081861)、噻蟲啉(BWN5339-2016)、辛硫磷(GBW(E)081790)、毒死蜱(GBW(E)082746)、異丙威(GBW(E)082717)，濃度均為100 μg·mL-1，購(gòu)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所；丙酮、甲醇、正己烷：分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑廠；其他試劑：均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水：超純水，自制。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1色譜條件

色譜柱：Rtx-5 MS石英毛細(xì)管色譜柱；進(jìn)樣口溫度: 230℃；載氣：高純氦氣(純度≥99.9999%)；模式：恒流模式；流速：1.5 mL·min-1；進(jìn)樣方式：不分流；進(jìn)樣量：1 μL。升溫程序見表1。

表1 色譜升溫程序

1.3.2質(zhì)譜條件

離子源：EI源；接口溫度: 260℃；離子源溫度: 250℃；轟擊能量：65eV；碰撞氣：高純氬氣(純度≥99.9999%)；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；溶劑延遲時(shí)間：3.5 min。

1.4 溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備溶液：取啶蟲脒、噻蟲啉、辛硫磷、毒死蜱和異丙威標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密量取1.0 mL置同一個(gè)10.0 mL容量瓶中，加丙酮定容至刻度，搖勻，即得(啶蟲脒、噻蟲啉、辛硫磷、毒死蜱和異丙威質(zhì)量濃度均為：10.0 μg·mL-1)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：取上述標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備溶液，分別精密移取0.2 mL、0.5 mL、1 mL、5 mL，分別置100 mL容量瓶中，再分別精密移取2.0 mL、5.0 mL，分別置10 mL容量瓶中；制備含啶蟲脒、噻蟲啉、辛硫磷、毒死蜱和異丙威質(zhì)量濃度依次為0.02、0.05、0.1、0.5、2.0、5.0、10.0 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，加丙酮定容至刻度，搖勻，即得。

樣品溶液：取可食淡水螺樣品，取其可食用螺肉，置粉碎機(jī)中粉碎，準(zhǔn)確稱取粉碎后的樣品10.0 g，加無水硫酸鈉除水劑約5g，置研缽中研細(xì)；取研細(xì)后的樣品放入萃取池中，加硅藻土約12g，置快速溶劑萃取儀中，按下表設(shè)置儀器，用乙腈-甲苯溶液(3:1)進(jìn)行樣品中待測(cè)殺蟲劑的萃取，收集萃取液，萃取液置氮吹儀吹至近干(50℃水浴)，殘?jiān)?mL丙酮溶解，渦旋1min，0.45 μm濾膜過濾，即得。儀器設(shè)置見表2。

表2 快速溶劑萃取儀設(shè)置

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的比較

目前，用于殺蟲劑殘留檢測(cè)的提取方法主要有：固相萃取法、GPC加濃縮法和快速溶劑萃取法等。固相萃取法采取富集、凈化待測(cè)物中的殺蟲劑，操作步驟繁瑣，凈化過程會(huì)導(dǎo)致待測(cè)殺蟲劑的損失，檢測(cè)準(zhǔn)確度偏低；GPC加濃縮法凈化、提取效果較好，但儀器價(jià)格昂貴，方法不易推廣使用；快速溶劑萃取法是在一定的壓力和溫度下提取待測(cè)殺蟲劑，提取效率高，且操作過程簡(jiǎn)單，是近年來發(fā)展起來的新型前處理方法。實(shí)驗(yàn)比較上述固相萃取法和快速溶劑萃取法兩種方法對(duì)加標(biāo)樣品(加標(biāo)濃度：0.05 μg·mL-1)提取效果的影響，結(jié)果快速溶劑萃取法具有最佳的回收率，且基線噪音小，檢出限高。因此實(shí)驗(yàn)選擇快速溶劑萃取法作為前處理方法。比較結(jié)果見表3。

表3 前處理方法比較結(jié)果

2.2 萃取溶劑的選擇

可食淡水螺中含有大量的蛋白質(zhì)、維生素和人體所必需的氨基酸等，是典型的高蛋白、低脂肪、高鈣質(zhì)的動(dòng)物性食品，因其基質(zhì)較為復(fù)雜，因此萃取溶劑的選擇，對(duì)降低基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)準(zhǔn)確度和靈敏度有重要的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)選擇常用的幾種萃取溶劑：乙腈、丙酮、環(huán)己烷-乙酸乙酯溶液(1∶1)和乙腈-甲苯溶液(3∶1)，考察上述4種萃取溶劑對(duì)可食淡水螺肉中啶蟲脒、噻蟲啉、辛硫磷、毒死蜱和異丙威萃取效果。取粉碎后的螺肉，加入“1.4”標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備溶液適量，控制終點(diǎn)濃度為：0.05 μg·mL-1，控制其他參數(shù)不變，分別更換上述4種溶劑。結(jié)果選擇乙腈-甲苯溶液(3:1)作為萃取溶劑時(shí)，萃取效果最佳。比較結(jié)果見表4。

表4 萃取溶劑萃取結(jié)果比較

2.3 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

取100 μg·mL-1的啶蟲脒、噻蟲啉、辛硫磷、毒死蜱和異丙威標(biāo)準(zhǔn)溶液，用丙酮配制成質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。選擇氣相色譜三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀全掃描模式(Q3SCAN)對(duì)該溶液進(jìn)樣分析，得5種農(nóng)藥對(duì)應(yīng)的母離子；再采用產(chǎn)物離子掃描模式對(duì)母離子進(jìn)行二次掃描(Production SCAN)，為保證方法的靈敏度，選擇豐度值最高的離子定量，另選擇兩組離子定性。打開 “MRM Optimization”工作表，設(shè)定MRM Transition 數(shù)(MRM 定量離子和定性離子對(duì)數(shù))及產(chǎn)物離子質(zhì)量數(shù)，對(duì)碰撞電壓、碰撞時(shí)間等參數(shù)條件進(jìn)行優(yōu)化，確立最終的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描方法。5種農(nóng)藥對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)見表5，典型標(biāo)準(zhǔn)圖譜見圖1。

圖1 典型標(biāo)準(zhǔn)圖譜

表5 6種殺菌劑質(zhì)譜參數(shù)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限及范圍

取“1.4”標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備溶液，分別精密移取0.2 mL、0.5 mL、1 mL、5 mL，分別置100 mL容量瓶中，再分別精密移取2.0 mL、5.0 mL，分別置10 mL容量瓶中；制備含啶蟲脒、噻蟲啉、辛硫磷、毒死蜱和異丙威質(zhì)量濃度依次為0.02、0.05、0.1、0.5、2.0、5.0、10.0 μg·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，加丙酮定容至刻度，搖勻；按“1.3”設(shè)置色譜質(zhì)譜條件，穩(wěn)定后分別進(jìn)樣上述溶液，內(nèi)標(biāo)法校正，以響應(yīng)值為縱坐標(biāo)(Y)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸，再以3倍信號(hào)噪音比計(jì)算檢測(cè)限。結(jié)果見表6。

2.5 方法回收率實(shí)驗(yàn)

取可食淡水螺樣品，取其可食用螺肉，置粉碎機(jī)中粉碎，準(zhǔn)確稱取粉碎后的樣品10.0 g，加無水硫酸鈉除水劑約5g，置研缽中研細(xì)；取研細(xì)后的樣品放入萃取池中，加入“1.4”標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備溶液適量，后續(xù)按樣品溶液進(jìn)行前處理，制備添加3水平濃度(0.02、0.5和5.0 μg·mL-1)的加標(biāo)溶液，按“1.3”設(shè)置色譜質(zhì)譜條件，穩(wěn)定后分別進(jìn)樣上述溶液，內(nèi)標(biāo)法校正，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果和實(shí)際加入量計(jì)算啶蟲脒、噻蟲啉、辛硫磷、毒死蜱和異丙威回收率。詳細(xì)檢測(cè)結(jié)果見表7。

2.6 方法重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取可食淡水螺樣品，取其可食用螺肉，置粉碎機(jī)中粉碎，準(zhǔn)確稱取粉碎后的樣品10.0 g，加無水硫酸鈉除水劑約5g，置研缽中研細(xì)；取研細(xì)后的樣品放入萃取池中，加入“1.4”標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備溶液適量，后續(xù)按樣品溶液進(jìn)行前處理，制備添加濃度0.1 μg·mL-1的加標(biāo)溶液，同法平行制備6份；按“1.3”設(shè)置色譜質(zhì)譜條件，穩(wěn)定后分別進(jìn)樣上述溶液，內(nèi)標(biāo)法校正，計(jì)算6份平行加標(biāo)樣品檢測(cè)結(jié)果的RSD。結(jié)果啶蟲脒、噻蟲啉、辛硫磷、毒死蜱和異丙威重復(fù)性RSD分別為3.16%、2.75%、3.39%、2.72%、1.89%和2.06%，表明方法具有良好的重復(fù)性。

2.7 樣品檢測(cè)實(shí)例

隨機(jī)購(gòu)買市售可食淡水螺樣品，按“1.4”樣品溶液配制方法進(jìn)行前處理，再按“1.3”設(shè)置色譜質(zhì)譜條件，穩(wěn)定后分別進(jìn)樣上述溶液，內(nèi)標(biāo)法校正，計(jì)算樣品中啶蟲脒、噻蟲啉、辛硫磷、毒死蜱和異丙威的殘留量。結(jié)果，在所購(gòu)買的3種可食淡水螺中暫未檢出上述5種常用殺蟲劑。

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)研究建立了快速溶劑萃取-GC-MSMS法檢測(cè)可食淡水螺中5種常用殺蟲劑殘留量的分析方法，選擇了快速溶劑萃取法作為前處理方法，優(yōu)化了萃取溶劑、質(zhì)譜MRM方法，并考察了優(yōu)化后的方法重復(fù)性、線性等，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，該方法前處理速度快，檢測(cè)準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，可以用于可食淡水螺中殺蟲劑殘留的檢測(cè)，為監(jiān)測(cè)當(dāng)?shù)厮鷦?dòng)物殺蟲劑污染情況提供技術(shù)依據(jù)。