細胞膜色譜法改進及應(yīng)用進展

李亞男 王 松 叢海林,2 于 冰,2*

(1.青島大學(xué)生物醫(yī)用材料與工程研究院，青島大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，青島大學(xué)附屬醫(yī)院，青島 266071；2.生物多糖纖維成形與生態(tài)紡織國家重點實驗室，青島大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，青島 266071)

細胞膜色譜(CMC)于1996年由何教授[1]首次建立，是在生物學(xué)和色譜學(xué)的基礎(chǔ)上，研究流動相中有效成分與受體相互作用規(guī)律的方法。由于具有檢測快速，靈敏度高等特點，細胞膜色譜法已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中的活性成分篩選，以及藥物與受體之間相互作用方式。在細胞膜色譜制備過程中，通過將細胞膜以物理吸附或者化學(xué)鍵合的方式鍵合在多孔二氧化硅微球載體上，以形成細胞膜固定相(CMSP)，并結(jié)合高效液相色譜，檢測不同成分的保留時間或質(zhì)量分數(shù)，從而推斷其中的有效成分。細胞膜色譜法同時具有生物特性和色譜特性，對于研究潛在活性成分與受體之間的關(guān)系具有重要意義[2, 3]。細胞膜色譜法無需額外對材料進行提取分離，這為檢測過程提供了很多便利；但由于細胞膜色譜柱制備過程比較復(fù)雜，且細胞膜吸附不完全，因此存在細胞膜用量大、表面膜蛋白易變質(zhì)、細胞膜易脫落、柱壽命短和效率低等缺點[4-6]。盡管如此，由于細胞膜色譜具有靈敏度高的優(yōu)點，還是被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中的活性成分篩選，以及藥物與受體相互作用方式等領(lǐng)域[7]。

1 細胞膜色譜柱的改進

Ding 等[8]對細胞膜色譜柱的制備過程中的細胞用量、細胞破碎和裝柱流程等步驟進行了探究，分別以大鼠肝星形細胞HSC-T6 和人肝癌細胞SMMC-7721建立了細胞膜色譜模型。該研究對比了不同實驗條件下的保留效果，最終確定最佳細胞用量為3.5×107個，細胞破碎的最優(yōu)條件為5個循環(huán)(400 W，2 S超聲，20 S間隔)。通過流程的優(yōu)化，Ding等實現(xiàn)了更穩(wěn)定的細胞膜色譜柱壓，以及更高的柱效。

柱壓大導(dǎo)致細胞膜從微球固定相表面脫落是細胞膜色譜在使用過程中可能存在的情況[9]。因此，Ding等[8]采用多聚甲醛對細胞膜的固定相進行了處理，處理后的固定相載體可與細胞膜結(jié)合的更加牢固，系統(tǒng)穩(wěn)定性得到了明顯的提高。這是由于多聚甲醛與膜表面蛋白氨基發(fā)生交聯(lián)，結(jié)合更加牢固，同時能夠不破壞膜蛋白的空間構(gòu)型，從宏觀上穩(wěn)定了細胞膜。但該方法有可能破壞細胞膜表面受體的活性，導(dǎo)致柱效下降。因此該課題組隨后發(fā)現(xiàn)，使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-Aminopropyltriethoxysilane, APTES)對硅膠載體進行修飾[10]，如圖1所示，該方法實現(xiàn)了硅膠載體和細胞膜之間的共價鍵結(jié)合，打破了傳統(tǒng)條件下細胞膜和固定相載體之間主要靠氫鍵和范德華力的非共價結(jié)合的方式。該方法將柱壽命延長到12天，顯著提高了細胞膜色譜柱穩(wěn)定性，并避免了對細胞膜表面蛋白的破壞。

圖1 APTES修飾多孔硅球載體鍵合細胞膜過程[10]

在細胞膜色譜柱的傳統(tǒng)制備過程中，除工藝條件外，需要大量細胞膜作為固定相也為色譜柱的制備造成了極大的困難并限制了細胞膜色譜柱的應(yīng)用。因此Tang等[11]首次提出細胞膜毛細管色譜法(cMCC)解決了該問題。其將小鼠的胰島細胞膜固定在用醛基官能化的毛細管內(nèi)壁上，測試了3種降血糖藥物，均有良好的保留。該方法下，色譜保留因子和穩(wěn)定性與普通細胞膜色譜相似,但細胞膜用量比傳統(tǒng)細胞膜色譜柱低數(shù)百倍，且靈敏度較高。該方法極大地減少了色譜柱制備過程中的細胞消耗量。為了增強色譜柱的穩(wěn)定性和柱壽命，Xu等[12]使用N-羥基丁二酰亞胺(NHS)對毛細管柱上的硅基多孔層進行了修飾，如圖2所示，該方法在涂層和細胞膜之間建立了共價鍵連接，相比之前的方法增強了測定結(jié)果的穩(wěn)定性和柱壽命。該研究分別建立了SKBR3/mCMC 和 BALL1/mCMC模型，在顯著延長毛細管柱壽命的同時，觀察到了抗癌藥物曲妥珠單抗的顯著保留。其中SKBR3/mCMC模型的柱壽命延長至16天，BALL1/mCMC模型柱壽命延長至14天。

在載體選擇方面，Wang等[13]首次以聚乙烯醇(PVA)修飾的聚醚醚酮管(PEEK)作為固定相載體，建立了新型毛細管細胞膜色譜模型。聚醚醚酮管作為常用的HPLC管材料，具有良好的耐高壓性和機械強度，且相比較于硅膠材料，PEEK的pH穩(wěn)定性較高。該團隊分別建立的成骨細胞和破骨細胞的色譜模型，以降鈣素和維拉帕米為樣品，驗證了該模型的良好保留性能及重現(xiàn)性。整體柱的使用可以極大地縮短分離分析時間，為細胞膜色譜的發(fā)展提供了新的選擇和可能性。

2 細胞膜色譜法用于中藥活性成分的分離

近年來，中藥由于其良好的治療效果越來越受到全世界的認可和關(guān)注。但是中藥作為天然產(chǎn)物，其化學(xué)成分相當(dāng)復(fù)雜[14]，對中藥有效成分的研究帶來了巨大的難題。因此，提取、分離和鑒別中藥材料中活性成分是我們面臨的巨大難題。細胞膜色譜法因為在中藥活性成分篩選方面有著明顯的優(yōu)勢，因此被廣泛的應(yīng)用于該領(lǐng)域，并獲得了快速的發(fā)展[15]。中藥活性成分的藥理作用不相同，不同細胞膜表面的受體也不同，因此選用不同的細胞膜可篩選不同的藥物成分。由于中藥成分十分復(fù)雜，因此采用一維細胞膜色譜法無法精確分離各個組分，可能存在柱效低的缺點，因此與其他技術(shù)聯(lián)用是非常有必要的。

2.1 細胞膜色譜法用于中藥抗癌活性成分的分離

由于整體調(diào)理和生物多靶點的特點，中藥在癌癥治療過程中，有著非常重要的輔助作用。目前，臨床治療癌癥常將手術(shù)，放療，化學(xué)療法和中醫(yī)結(jié)合起來[16]。但是由于中藥成分復(fù)雜，有效成分不明確，在使用過程中存在許多副作用，為癌癥治療增加了潛在風(fēng)險，因此提取并純化活性成分對中藥治療的發(fā)展有著重要的意義。

肝癌因為死亡率高，引起了學(xué)者的廣泛關(guān)注。陳嘯飛等[17]建立了 HepG2/CMC-TOF/MS 全二維色譜系統(tǒng)，分別研究苦參和黃柏提取液中作用于高表達表皮生長因子受體(EGFR)的HepG2 肝癌細胞膜的有效成分，在色譜柱上均有良好的保留，如圖3所示，從苦參和黃柏中共篩選得到了4個潛在抗癌活性成分。并且在線串聯(lián)了飛行時間質(zhì)譜(TOF/MS)，在不使用對照組的條件下獲得了較為準確的鑒別結(jié)果，同時極大地縮短了分離時間，簡化了操作步驟。Jia 等[18]也通過建立全二維 HepG2/CMC-C18/TOF-MS 分析系統(tǒng),對口服黃芩提取液中的抗肝癌活性成分進行了篩選，并驗證了其活性。

圖3 苦參和黃柏中潛在抗癌活性成分的色譜及相應(yīng)TOFMS圖[17]

很多中藥中含有普適的抗腫瘤活性成分。Zhang等[19]建立了酪氨酸367半胱氨酸-HEK293/CMC-HPLC-MS色譜模型，使用1-叔丁基-3-{2-[4-(二乙氨基)丁基氨基]-6-(3,5-二甲氧基苯基)吡啶基[2,3-d]嘧啶-7-基}脲、尼莫地平和醋酸地塞米松進行了色譜柱重現(xiàn)性的評估，取得了較好的重現(xiàn)性結(jié)果。后繼續(xù)篩選得到了川穹中的細胞生長因子4受體拮抗劑，并鑒定了其抗癌活性。呂等[20]建立了高表達表皮生長因子受體細胞膜色譜CMC-HPLC二維系統(tǒng)，對中藥射干中抗腫瘤活性組分進行了提取，并對篩選得到的成分進行了MTT實驗的毒性驗證，證實了其活性成分的體外抑制作用。Sun等[21]建立了高表達的表皮生長因子受體細胞膜色譜，篩選了黃芪中的抗腫瘤成分，并發(fā)現(xiàn)其有效成分的結(jié)合位點和結(jié)合方式與吉非替尼相似，且低劑量范圍內(nèi)其抑制活性大于吉非替尼。Fu等[22]建立了表皮生長因子受體(EGFR)和成纖維細胞生長因子受體4(FGFR4)雙重混合的細胞膜色譜系統(tǒng)，其結(jié)合了HPLC-ESI-IT-TOF-MSn，分離出了苦參中的4種有效成分，并通過細胞毒性試驗的驗證了其抑制活性。

在泌尿系統(tǒng)方面，學(xué)者們也做出了很多努力。Zheng等[23]建立了DU145/CMC系統(tǒng)從大黃中篩選抗前列腺癌的成分。通過該系統(tǒng)篩選得到了13種活性組分，并通過進一步篩選發(fā)現(xiàn)大黃素具有良好的膜結(jié)合性能，通過細胞活力和細胞凋亡實驗驗證了它們對DU145細胞具有理想的抑制作用。Wang等[24]建立了前列腺癌細胞PC-3/CMC色譜系統(tǒng)，篩選了黃芪中的抗前列腺癌活性成分。選擇吉非替尼和地塞米松分別作為陽性和陰性藥物，以驗證和優(yōu)化綜合二維色譜系統(tǒng)的選擇性和適用性。研究中發(fā)現(xiàn)了5種化合物，即槐果堿，苦參堿，氧化苦參堿，氧化苦參堿和黃腐酚，這5種化合物在PC-3/CMC上具有顯著的保留行為，并且通過飛行時間質(zhì)譜法進行了明確鑒定。細胞增殖和凋亡檢測證實了這5種化合物均具有抗前列腺癌作用。其中苦參堿和黃腐酚具有良好的抑制作用，IC50分別為0.893和0.137 mg/mL。Wei等[25]建立了VEGFR/CMC系統(tǒng)，并成功地用于鑒定元胡提取物中的活性成分。并通過MTT分析證實了它們對VEGFR改造的HEK293細胞生長的抑制活性。

Yuan等[26]建立了MDA-MB-231/CMC-HPLC/MS系統(tǒng)用于快速篩選附子中的抗乳腺癌化合物。有效成分在細胞膜色譜上具有明顯的保留。后使用C18色譜柱富集保留級分，并通過二維反相色譜法進行分析。最后，通過體外實驗測試了保留級分的活性。結(jié)果得到了兩種保留組分，并通過實驗驗證了它們具有抑制乳腺癌細胞的生長的活性。

中藥中抗腫瘤的活性成分眾多，通過細胞膜色譜的篩選，可以準確得到中藥中的抗腫瘤活性成分，對于其進一步的藥理學(xué)、毒理學(xué)研究提供了極大地便利，并對中藥的發(fā)展做出了重要的貢獻。

2.2 細胞膜色譜法用于中藥抗過敏活性成分的分離

過敏反應(yīng)，醫(yī)學(xué)上稱為變態(tài)性疾病，是免疫功能失調(diào)而引起的臨床癥候群。當(dāng)外來抗原性物質(zhì)進去人體后，刺激體內(nèi)的免疫系統(tǒng)釋放特異性抗體并與抗原結(jié)合，隨后肥大細胞，嗜堿粒細胞等也因為受到刺激而釋放大量的過敏物質(zhì)，進而引起過敏[27]。因為過敏反應(yīng)中刺激物的特殊性，細胞膜色譜可以快速方便的篩選出中藥中的過敏成分，使得細胞膜色譜被許多學(xué)者用于該領(lǐng)域

Lv等[28]開發(fā)了LAD2/CMC-HPLC-IT-TOF/MS系統(tǒng)，以篩選、分析和鑒定野菊花注射液的致敏成分。餾分保留在LAD2/CMC色譜柱上，并鑒定為檸檬苦素(LN)。結(jié)果表明，野菊花注射液和LN可以通過增加組胺釋放來達到其過敏作用。研究開發(fā)的LAD2/CMC-HPLC-IT-TOF-MS系統(tǒng)可用于篩選復(fù)雜系統(tǒng)中的致敏成份。

Zhang等[29]建立了RBL-2H3/CMC-HPLC-MS模型成功地篩選并鑒定了來自木皂苷中的抗過敏成分。以這種方式將Tubeimoside A鑒定為潛在的過敏原，脫粒試驗證實Tubeimoside A以劑量依賴的方式誘導(dǎo)RBL-2H3細胞脫粒。Han等[30]也通過2H3/CMC-HPLC-MS模型成功地篩選并鑒定了來自丁香衣原體的羥基紅花黃A作為潛在的抗過敏成分。藥理分析表明，羥基紅花黃A是抑制免疫球蛋白E抗原介導(dǎo)的脫粒的有效天然成分。

Guo等[31]建立了H1受體過表達細胞/細胞膜色譜法串聯(lián)質(zhì)譜的方法，用于篩選中藥注射液中潛在的組胺激活成分。通過篩選、分離和鑒定鹽酸苯海拉明，吉非替尼，坦索羅辛和尼群地平的混合標準溶液，驗證了該方法的可行性。篩選了中藥注射劑玉金注射液，并鑒定了作用于組胺H1受體的潛在抗過敏成分。

Lin等[32]通過高表達Mas相關(guān)G蛋白偶聯(lián)受體X2細胞膜系統(tǒng)和高效液相色譜與電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜在線聯(lián)用，在丹參注射液中鑒定出丹酚酸A和一對幾何異構(gòu)體(異戊烷酸C和丹酚酸C)為假過敏成分。通過體外測定評估了它們的假過敏活性，測定結(jié)果與在細胞膜色譜柱一致。進一步研究表明，丹酚酸C是保留時間最長的化合物，它通過與Mas相關(guān)的G蛋白偶聯(lián)受體X2誘導(dǎo)假性過敏反應(yīng)。

Huang等[33]建立了RBL-2H3/CMC系統(tǒng)并在線聯(lián)用LC/MS，篩選了胡椒中的抗過敏成分。實驗結(jié)果表明，胡椒堿有顯著的抗過敏活性。

因為細胞膜色譜的特殊性，該方法可以更加精準的篩選致敏成分和抗過敏成分，并且準確得到該成分直接作用的細胞，相比于其他的方法具有更加快速便捷的優(yōu)勢。因此，細胞膜色譜在過敏成分篩選方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

2.3 細胞膜色譜法應(yīng)用于心腦血管類疾病活性成分篩選

心血管疾病是一種人類常見疾病，中藥由于其多靶向位點等特點，被廣泛用于心腦血管疾病的治療[34, 35]。但由于穩(wěn)定性、安全性和副作用機制不明確，因此對中藥中的有效成分進行進一步純化是非常有必要的。

Yang等[36]建立了心肌細胞的細胞膜色譜柱系統(tǒng)，用于篩選五味子中的抗心臟病疾病的活性成分。作者先以硝苯地平為標準樣，并與LC-MS離線聯(lián)用，驗證了色譜柱的作用。隨后通過篩選，得到了可以與心臟細胞結(jié)合的活性成分。

Han等[37]開發(fā)了HEK 293α1A/CMC-UHPLC-ESI-MS/MS色譜系統(tǒng)，并成功地用于鑒定白頭翁中的作用于血管的活性成分。藥理實驗表明，篩選出的活性成分具有α1A腎上腺素能受體活性，對于血管疾病有潛在的應(yīng)用價值。

由于阿霉素具有誘導(dǎo)心力衰竭的副作用，因此探究抗阿霉素藥物是非常有必要的。Chen等[4]分別建立了正常和病變大鼠心肌CMC分析系統(tǒng)，用于篩選烏頭堿中的抗阿霉素(DOX)活性成分。該研究從正常和病變的心肌CMC模型中總共保留了烏頭堿中具有相似結(jié)構(gòu)的16種潛在活性生物堿成分。與正常CMC模型相比，它們中的大多數(shù)對病變的心肌CMC的親和力均有明顯降低，分離出的化合物中，塔拉扎明(TALA)具有最高的親和力，隨后通過體外藥效學(xué)驗證和靶標鑒定實驗，驗證了篩選結(jié)果。最終驗證得到電壓依賴性鉀離子通道是TALA和14-乙?；?TALA的結(jié)合靶點，具有高親和力。

Yue等[38]建立了一種高表達β1AR/細胞膜色譜法(β1AR-CMC)離線聯(lián)用UPLC/MS方法，用于篩選黃連中的活性成分。在這項研究中，使用美托洛爾作為陽性對照藥物，因為來自黃連的黃連堿被認為是可以抑制β1AR的活性成分。經(jīng)過實驗驗證，黃連中篩選得到的活性成分可以減輕梗塞面積并釋放丙二醛(MDA)，具有減輕心肌損傷中的作用。在體外，黃連可以減少細胞凋亡，對心肌細胞起到了一定的保護作用。

由于細胞膜色譜柱的受體容量有限，因此高含量親和性化合物可能會導(dǎo)致色譜柱超載，從而導(dǎo)致其他陽性候選藥物的信息不了解。為了避免這種影響，Liu等[39]提出了一種基于二維CMC和成分剔除的策略。為了發(fā)現(xiàn)紅曲米中潛在的心臟保護化合物，建立了具有大鼠心臟成肌細胞H9c2/CMC的模型。通過使用二維H9c2/CMC-HPLC/QTOF MS系統(tǒng)，首先篩選出三個成分。除去高含量親和性化合物后，又發(fā)現(xiàn)了另外四種生物活性化合物。通過兩輪篩選，避免了由高濃度或無窮大化合物引起的色譜柱超載，并富集了痕量化合物。

Chen等[40]建立了血小板/CMC結(jié)合離線UPLC-QTOF-MS/MS系統(tǒng)，以從丹參水提物中篩選抗血小板活性成分，該成分在中藥中可作為抗血小板聚集劑。得到了7種活性成分，此外，迷迭香酸，紫草酸，丹酚酸B，丹酚酸C和丹參素在血小板聚集體外測定中進行了測試。結(jié)果表明它們的保留時間與抗血小板聚集活性密切相關(guān)。

多種研究表明，中藥中抗心血管疾病的活性成分并不是單一的，需要進行進一步的篩選和確認，但是相比于其他的方法，細胞膜色譜法得到的活性成分更加準確，且極大地縮小了篩選范圍，具有一定的應(yīng)用前景。

2.4 細胞膜色譜法應(yīng)用于其他疾病活性成分篩選

細胞膜色譜因為可以選取不同的細胞膜，因此在篩選抗其他多種疾病的活性成分方面也有著顯著的效果。

Liu等[41]提取了人牙周膜干細胞細胞膜，建立了hPDLC/CMC-LC-MS系統(tǒng)，從黃連中提取得到了小檗堿，并驗證了小檗堿是作用于人牙周膜干細胞細胞的有效成分。隨后，該作者又利用該模型篩選了黃芩中的抗牙周炎活性成分[42]。

朱等人[43]報道了選取腎小球膜細胞篩選治療腎病的活性成分。結(jié)果顯示篩選得到的組分具有明顯的活性。

Fan等[44]利用大鼠子宮細胞膜建立了CMC-HPLC/MS系統(tǒng)，篩選的益母草中的活性成分。通過這種方法被篩選得到了活性化合物。體外藥理實驗證明，該化合物具有促進子宮收縮的作用，并可對產(chǎn)后出血產(chǎn)生影響。

Gu等[45]建立了大鼠系膜細胞HBZY-1/CMC系統(tǒng)，篩選牡丹皮中的抗糖尿病腎病活性成分。結(jié)果得到了8種化合物，并通過生物實驗證明了其有潛在活性。

Wu等[46]建立了二維K562/CMC系統(tǒng)，并與計算機靶標識別相結(jié)合，篩選得到了中藥天然靛藍中的抗白血病活性成分。該課題成功地篩選得到了3個活性成分：靛玉紅、色胺酮和異鼠李素，并通過體外細胞活力和細胞凋亡試驗驗證了它們的抗白血病作用。

由此可見，在多種疾病方面，細胞膜色譜法可以快速準確地篩選出中藥中的活性成分，并通過后續(xù)的生物實驗驗證其生物活性。細胞膜色譜的普適性在多種疾病中得到了體現(xiàn)。

3 細胞膜色譜法用于藥物與受體的相互作用

確定藥物與受體之間相互作用的方式對于藥理學(xué)的研究有重要的意義，研究表明，因為受體蛋白的結(jié)構(gòu)和活性不會被破壞，因此細胞膜色譜法可用于研究藥物與受體之間相互作用的規(guī)律，相比于其他的方法具有高效，快速等優(yōu)點。

Ma等[47]通過大鼠腦組織細胞建立了細胞膜色譜模型，對治療精神分裂的藥物與多巴胺受體之間的相互作用進行了研究。其中多巴胺的解離平衡常數(shù)(KD)為(4.87±0.35)×10-6M，奧氮平為(5.58±0.20)×10-7M，喹硫平為(5.22±0.12)×10-7M，安非他酮(4.50±0.37)×10-7M，多潘立酮(3.41±0.28)×10-7M。競爭結(jié)合研究表明，多潘立酮，安非他酮，喹硫平和奧氮平占據(jù)了色譜柱上DAR的某些結(jié)合位點，從而阻礙了多巴胺的締合。

Zhan等[48]建立了以HEK293/EGFR細胞為固定相的細胞膜色譜模型，用以研究抗癌藥物的與表皮生長因子受體之間的相互作用。從正面分析模型中，阿法替尼的解離平衡常數(shù)(K D)為6.05×10-7M，TPD7為6.91×10-7M，而HMQ1611為9.68×10-7M。相比于HMQ1611，TPD7具有更高的抑制作用，而TPD7和HMQ1611在HEK293/EGFR細胞中作用相似，因此表明TPD7可能是高表達EGFR的新型阻斷劑。

Ma等[49]建立了用于確定藥物膜受體親和力的CMC相對標準方法的KD值，以分析與膜受體(表皮生長因子受體和血管緊張素II受體)結(jié)合的藥物的相對KD值。通過CMC相對標準方法獲得的KD值與通過正面分析方法獲得的KD值具有很強的相關(guān)性。

Wang等[50]用人肝癌細胞SMMC-7721和HepG2分別建立了細胞膜色譜方法，并聯(lián)用HPLC/MS，建立了一個綜合的篩選平臺。這些系統(tǒng)隨后經(jīng)過驗證，并用于評估喹唑啉化合物的活性，喹唑啉化合物經(jīng)設(shè)計和合成后可靶向血管內(nèi)皮生長因子受體2。還使用經(jīng)典的卡尺遷移率測定法測試了這些化合物對該受體的抑制活性。結(jié)果顯示這兩種方法之間的顯著相關(guān)性(R2 = 0.9565或0.9420)。

Yang等[51]開發(fā)了HEK293-EGFR/CMC方法，以研究表皮生長因子受體與配體吉非替尼，厄洛替尼，坎尼替尼，阿法替尼和凡德他尼的結(jié)合特征。使用吉非替尼作為標記的競爭結(jié)合分析用于研究在EGFR特定結(jié)合位點發(fā)生的相互作用。在吉非替尼占據(jù)的這些配體結(jié)合位點的HEK293-EGFR/CMC柱上測量位移能力，揭示了以下順序：吉非替尼(KD，8.49±0.11×10-7M)>厄洛替尼(KD，1.07 ±0.02×10-6M)>坎尼替尼(KD，1.41±0.07×10-6M)>阿法替尼(KD，1.80±0.12×10-6M)>凡德他尼(KD，1.99±0.03×10-6M)。此順序?qū)?yīng)于額葉位移分析估計的值和分子對接獲得的分數(shù)。此外，熱力學(xué)分析表明，在EGFR與所有以上幾種配體結(jié)合的過程中，氫鍵或范德華力是主要的相互作用力。

Du等[52]以大鼠大腦紋狀體細胞膜為固定相建立了細胞膜色譜(CMC)系統(tǒng)，研究了5-羥色胺受體5-HT1D與川穹中的主要活性成分藁本內(nèi)酯相互作用的親和作用。以舒馬普坦為對照品，采用了競爭抑制的手段，并使用額葉分析得到的舒馬曲坦和藁本內(nèi)酯的解離常數(shù)值分別為389 nmol/L和4.21 μmol/L。

4 細胞膜色譜法應(yīng)用于抗菌多肽的篩選

抗菌肽是指具有抗菌活性的多肽物質(zhì)，一般呈堿性，且具有廣譜性，能夠迅速殺死細菌，成為了細菌疾病的潛在治療藥物。因此篩選和純化抗菌肽在醫(yī)用治療上具有重要的意義。由于抗菌肽具有分子量小和廣譜性等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料等行業(yè)[53]。細胞膜色譜在抗菌肽的篩選方面也有著獨特的優(yōu)勢[54]。

Xiao等[55]提取了大腸桿菌的細胞膜，并建立了細胞膜色譜法與LC-MS離線串聯(lián)的方法，從麻風(fēng)樹籽中篩選得到了陽離子抗菌肽(KVFLGLK，JCpep7)，抗菌測定表明JCpep7對多種微生物有殺傷作用?？咕鷻C制表明，JCpep7主要通過破壞細胞壁和細胞膜，然后裂解細胞來殺死微生物。結(jié)果表明，細胞膜親和層析可能是高通量篩選麻瘋樹抗菌肽的有前途的方法。Tang等[56]同樣利用大腸桿菌細胞膜，建立了細胞膜色譜法，從煮干的鳳尾魚中篩選得到了陽離子抗菌肽(Apep10)，通過MOLDI-TOF-MS鑒定序列為GLARCLAGTL。經(jīng)抗菌檢測可得知Apep10對多種微生物有活性，且通過激光共聚焦(ZLSM)數(shù)據(jù)表明對小鼠紅細胞沒有細胞毒性。

Tang等[57]使用釀酒酵母細胞膜離線串聯(lián)HPLC/MS建立了細胞膜色譜系統(tǒng)，以從牛酪蛋白的胃蛋白酶水解物中分離靶向的抗菌肽。成功篩選了膜結(jié)合級分，并將將該肽的氨基酸序列鑒定為LRLKKYKVPQL。還確定了肽的活性是相對熱穩(wěn)定的并且是pH依賴性的。在15 %Na+，K+和胃蛋白酶的存在下，它保留了90%以上的活性。胰蛋白酶，蛋白酶K，二價陽離子Mg2 +和Ca2 +將活性降低到不同程度。

5 結(jié)論

細胞膜色譜基于直接鍵合在硅膠表面的細胞膜的特性，具有快速篩選中藥中特定活性成分的能力。相比于其他的方法，該方法具有高效、快速、靈敏及可重復(fù)性高的特點，并且通過大量的實驗確定了其可靠性。盡管如此，鍵合在硅膠表面的細胞膜并不能完全模擬活細胞的活性和特性，因此可能存在篩選不完全的缺點，使細胞膜色譜的使用存在一定的局限性；同時，細胞膜色譜對細胞膜的大量需求也使其大規(guī)模使用成為受限瓶頸。細胞膜色譜在藥物篩選方面具有廣闊的前景，但是提高細胞膜色譜的活性以完整篩選活性成分，實現(xiàn)大批量、規(guī)?；闹苽洌悄壳凹毎どV發(fā)展的主要方向。通過實現(xiàn)這些過程，細胞膜色譜將會越來越發(fā)揮重要作用，并得到越來越多的重視。