辣木葉多酚的超聲輔助雙水相提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性評(píng)價(jià)

董 樂(lè)，王 芳，李小琴，梁文文

（泉州師范學(xué)院 海洋與食品學(xué)院，福建泉州362000）

植物多酚（plant polyphenol）為廣泛存在于植物體內(nèi)的具有多元酚結(jié)構(gòu)的一類(lèi)次級(jí)代謝物［1]，具有諸如抗氧化性、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗輻射、抗骨質(zhì)疏松、抑制心血管疾病、降血脂和降血糖等多種生物活性［2-7]，因?qū)】档挠幸孀饔枚鴤涫荜P(guān)注［8].植物多酚的提取主要采用水溶液或者醇水溶液室溫冷浸等傳統(tǒng)方法，但提取率較低［9-10].雙水相萃取體系是由兩種互不相溶的水溶液組成［11]，是根據(jù)兩相間的選擇分配不同進(jìn)行提純，提取環(huán)境溫和，不會(huì)導(dǎo)致生物活性物質(zhì)的變性或是失性，傳質(zhì)速率快，能夠?qū)崿F(xiàn)快速分離［12].近年來(lái)，采用雙水相萃取技術(shù)從不同植物中提取多酚化合物研究的報(bào)道很多［13].在溶液萃取體系基礎(chǔ)上，采用超聲波、微波等輔助提取方法能夠有效提高植物多酚的提取率和純度.超聲波輔助提取技術(shù)因具有特殊的作用機(jī)制，能夠獲得理想的提取效果，故備受關(guān)注［14].植物化學(xué)成分的提取和純化工藝涉及多種影響因素.響應(yīng)面法（RSM）是利用合理的試驗(yàn)方法并通過(guò)試驗(yàn)得到一定的數(shù)據(jù)，將各因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系以多元二次回歸方程方式進(jìn)行擬合，通過(guò)對(duì)回歸方程和響應(yīng)面分析獲得最佳工藝條件［15].該方法可以快速而有效地確定多因素系統(tǒng)的最佳條件，并已應(yīng)用于多種優(yōu)化實(shí)踐中［16-18].

辣木（Moringa oleiferaLam.）又稱(chēng)鼓槌樹(shù)（Drumstick tree），為辣木科（Moringaceae）辣木屬（Moringa）的多年生熱帶落葉喬木，目前廣泛分布于印度、中國(guó)、日本等30多個(gè)熱帶及亞熱帶的國(guó)家和地區(qū)［19].辣木富含多酚類(lèi)化合物［14].對(duì)辣木籽的多酚提取工藝研究已有報(bào)道［20-23]，但均是以乙醇或正丙醇單一溶劑作為提取劑［24-26].且一般就利用度而言，辣木葉相對(duì)較高.本試驗(yàn)以多酚提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以硫酸銨用量、正丙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲時(shí)間和超聲溫度為自變量，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過(guò)與響應(yīng)面法中的Box-Behnken 設(shè)計(jì)優(yōu)化辣木葉多酚的超聲波輔助正丙醇-硫酸銨雙水相提取工藝；通過(guò)抗氧化能力指數(shù)（ORAC）和對(duì)羥基自由基（OH·）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）和2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（ABTS·+）的清除能力來(lái)評(píng)價(jià)其抗氧化活性，從而為辣木葉多酚的高效提取及辣木葉的精深加工利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 辣木由福建安溪師竹軒園藝有限公司提供.

1.2 試驗(yàn)試劑 水溶性維生素E（Trolox，生物級(jí)）：美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；偶氮二異丁脒鹽酸鹽（AAPH，生物級(jí)）、DPPH·（生物級(jí)）、ABTS·+（生物級(jí)）：aladdin 公司；熒光素鈉（FL，生物級(jí)）：上海MACKLIN 公司；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（GAD，分析純）：中國(guó)藥品生物制品鑒定所；Folin-Ciocalteu 試劑（分析純）：美國(guó)sigma公司；其余試劑（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.3 儀器設(shè)備 3635 型96 孔紫外微孔板：美國(guó)Corning 公司；酶標(biāo)儀：Infinite PROM-200 型，瑞士Tecan公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：TU-1950型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；梯度混合器：TH-1000型，上海青浦滬西儀器廠(chǎng).

1.4 方法

1.4.1 辣木葉粉末的制備 辣木葉用自來(lái)水清洗，并自然風(fēng)干.經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎，將過(guò)80目篩后的辣木葉粉末裝袋，置于干燥器中保存，備用.

1.4.2 水分含量的測(cè)定 按中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.3-2016測(cè)定［27].

1.4.3 雙水相體系的構(gòu)建 稱(chēng)取一定質(zhì)量的硫酸銨，用去離子水溶解后加入正丙醇，充分混合直至兩相形成［28].

1.4.4 多酚的提取流程 稱(chēng)取辣木葉粉末后，在不同提取條件下用超聲波輔助雙水相法充分混合靜置1 h，超聲提取，濾過(guò)，濾液置于分液漏斗中靜置分層后，取上層醇相清液，蒸干，溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，定容，即得供試溶液.

1.4.5 多酚含量測(cè)定 按參考文獻(xiàn)［29]測(cè)定.

1.4.6 提取工藝的單因素試驗(yàn) 通過(guò)預(yù)試驗(yàn)確定辣木葉多酚粗品單因素的基本條件為：硫酸銨用量為0.3 g·mL-1、正丙醇體積分?jǐn)?shù)（V·V-1）為60%、液料比為20∶1（V·m-1，mL·g-1）、超聲提取時(shí)間為50 min、超聲提取溫度為50 ℃.通過(guò)改變其中一個(gè)變量、固定其他因素不變，分析各個(gè)單因素對(duì)辣木葉多酚提取率的影響.液料比對(duì)辣木葉多酚提取率的影響：稱(chēng)取1.00 g辣木葉粉末，固定超聲時(shí)間50 min，超聲溫度60 ℃，正丙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，硫酸銨用量為0.3 g·mL-1，分別考察液料比為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1（V·m-1，mL·g-1）水平對(duì)多酚提取率的影響.硫酸銨用量對(duì)辣木葉多酚提取率的影響：分別考察硫酸銨用量為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g·mL-1水平對(duì)辣木葉多酚提取率的影響.超聲提取溫度對(duì)辣木葉多酚提取率的影響：分別考察30、40、50、60、70 ℃5個(gè)水平對(duì)辣木葉多酚提取率的影響.正丙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)辣木葉多酚提取率的影響：分別考察正丙醇體積分?jǐn)?shù)（V·V-1）為20%、40%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、100%9個(gè)水平對(duì)辣木葉多酚提取率的影響.超聲時(shí)間對(duì)辣木葉多酚提取率的影響：分別考察超聲時(shí)間為30、40、50、60、70 min 5個(gè)水平對(duì)辣木葉多酚提取率的影響.

1.4.7 提取工藝的Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)的結(jié)果，固定硫酸銨用量為0.3 g·mL-1，采用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert 8.0.6 中Box-Behnken Design 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，以超聲時(shí)間、超聲溫度、液料比和正丙醇體積分?jǐn)?shù)為自變量，以辣木葉多酚提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立4因素3水平的響應(yīng)面分析法，進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合及其優(yōu)化分析，其水平編碼表見(jiàn)表1.

表1 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Tab. 1 Experimental factors and level design

1.4.8 辣木葉多酚的抗氧化活性測(cè)定 ORAC 的測(cè)定按參考文獻(xiàn)［30]，OH·清除率的測(cè)定按參考文獻(xiàn)［31]，ABTS·+清除率的測(cè)定按參考文獻(xiàn)［32]，DPPH·清除率的測(cè)定按參考文獻(xiàn)［33].

1.4.9 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)均為3次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.抗氧化試驗(yàn)對(duì)照組以等體積維生素C（VC）代替樣品溶液其余同樣品組.采用Excel 2016和Design - Expert 8.0.6軟件進(jìn)行作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木葉粉末中水分含量 根據(jù)測(cè)定的結(jié)果，辣木葉粉末中水分含量為3.42%±0.04%.

2.2 多酚含量測(cè)定的線(xiàn)性回歸方程 根據(jù)測(cè)定的結(jié)果，吸光值A(chǔ)（y）與沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度（x，μg·mL-1）在0.00～5.83 μg·mL-1內(nèi)的線(xiàn)性回歸方程為y = 0.0846x－0.0090（R2＝0.9992），說(shuō)明線(xiàn)性關(guān)系良好.

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 液料比對(duì)辣木葉多酚提取率的影響 由圖1可知，液料比在20∶1～50∶1（V·m-1，mL·g-1）范圍內(nèi)，隨著液料比的增大，辣木葉多酚的提取率隨之增大，當(dāng)液料比提高到50∶1（V·m-1，mL·g-1）時(shí)，辣木葉多酚提取率達(dá)到最高；當(dāng)液料比繼續(xù)提高時(shí)，提取率基本保持平緩且略呈下降趨勢(shì).這是由于提取過(guò)程中隨著提取溶劑的增大，傳質(zhì)的動(dòng)力就越大，使得辣木葉中多酚物質(zhì)更容易溶出.但是，隨著液料比的增大，產(chǎn)生同樣熱量時(shí)提取溫度相應(yīng)會(huì)下降，從而使提取率下降［33].因此，辣木葉多酚提取工藝的最佳液料比選擇50∶1（V·m-1，mL·g-1）.

2.3.2 硫酸銨用量對(duì)辣木葉多酚提取率的影響 由圖2可知，硫酸銨用量在0.1～0.3 g·mL-1范圍時(shí)，辣木葉多酚提取率隨硫酸銨用量的增加而增高，當(dāng)硫酸銨用量達(dá)到0.3 g·mL-1時(shí)，辣木葉多酚的提取率達(dá)到最高.當(dāng)硫酸銨用量繼續(xù)增加時(shí)，辣木葉多酚的提取率卻隨之下降.因此，辣木葉多酚提取工藝的最佳硫酸銨用量選擇0.3 g·mL-1.

2.3.3 正丙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)辣木葉多酚提取率的影響 由圖3可知，在不同體積分?jǐn)?shù)的正丙醇與一定質(zhì)量的硫酸銨形成的雙水相體系中，當(dāng)正丙醇體積分?jǐn)?shù)增加至80%時(shí)，辣木葉多酚的提取率達(dá)到最高，當(dāng)正丙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)80%時(shí)提取率開(kāi)始下降，原因可能是因?yàn)檎俭w積分?jǐn)?shù)過(guò)大，使親脂性物質(zhì)大量溶出，從而使通透性下降，干擾因素也隨之增大［34].因此，辣木葉多酚提取工藝的最佳正丙醇體積分?jǐn)?shù)選擇80%.

2.3.4 超聲提取溫度對(duì)辣木葉多酚提取率的影響 由圖4可知，當(dāng)超聲提取溫度在30～50 ℃時(shí)，辣木葉多酚的提取率隨超聲提取溫度的升高而增加，提取率在超聲提取溫度為50 ℃時(shí)達(dá)最高值.當(dāng)超聲提取溫度進(jìn)一步增加時(shí)，辣木葉多酚的提取率卻開(kāi)始降低.其原因在于，超聲提取溫度超過(guò)該范圍，可能造成多酚類(lèi)物質(zhì)不穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生降解和（或）部分氧化.因此，辣木葉多酚提取工藝的最佳超聲提取溫度選擇50 ℃.

2.3.5 超聲提取時(shí)間對(duì)辣木葉多酚提取率的影響 由圖5可知，當(dāng)超聲提取時(shí)間分布于20～50 min時(shí)，隨著超聲提取時(shí)間的增加，辣木葉多酚的提取率增高，當(dāng)超聲提取時(shí)間為50 min 時(shí)多酚提取率達(dá)最高值，當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)增大時(shí)，辣木葉多酚的提取率隨著時(shí)間的增大反而減小.這是因?yàn)樵趧傞_(kāi)始提取時(shí)，辣木葉細(xì)胞破碎程度增大，辣木葉中的多酚物質(zhì)逐步溶出，辣木葉中的酚的量是固定的，當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后，辣木葉多酚類(lèi)物質(zhì)的溶出量接近固有值，因此，即使提取時(shí)間繼續(xù)增加，多酚類(lèi)物質(zhì)溶出微乎其微甚至不會(huì)溶出；并且隨著時(shí)間的增加，已溶出的多酚類(lèi)物質(zhì)可能會(huì)發(fā)生氧化，導(dǎo)致多酚提取率的測(cè)定值會(huì)比實(shí)際含量低［35].因此，辣木葉多酚提取工藝的最佳超聲時(shí)間選擇50 min.

2.4 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 以提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）、液料比（C）和正丙醇體積分?jǐn)?shù)（D）為自變量，以提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用響應(yīng)面分析法對(duì)辣木葉多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化.試驗(yàn)設(shè)計(jì)、試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析Tab. 2 Box-Behnken response surface test design and analysis

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果（表2），試驗(yàn)結(jié)果采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸擬合后，建立了A、B、C和D共4因子的數(shù)學(xué)回歸模型為：

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸方差分析結(jié)果見(jiàn)表3.由表3可知，該模型P（Pro＞F）為＜0.0001，表明模型極顯著，其失擬項(xiàng)P值是0.0616，表明失擬項(xiàng)不顯著，該模型是穩(wěn)定.由表3的回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，A、B、C、D 4個(gè)因素對(duì)辣木多酚提取影響極顯著（P＜0.01），BC、BD兩兩交互之間對(duì)多酚提取率的影響極顯著（P＜0.01），AC、AD兩兩交互之間對(duì)多酚提取率的影響顯著（P＜0.05），A2、B2、C2、D2對(duì)多酚提取率的影響極顯著（P＜0.01）.

表3 回歸方程顯著性檢驗(yàn)和方差分析Tab. 3 Significance test and variance analysis of regression equation

響應(yīng)面中的等高圖直觀(guān)地反映出各因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，見(jiàn)圖6～圖9.

由圖6-A 可知，當(dāng)提取溫度一定時(shí)，隨液料比的增加，辣木葉多酚提取率的變化趨勢(shì)為先增加后減小，當(dāng)液料比為52.5∶1（V·m-1，mL·g-1）時(shí)，辣木葉多酚的提取率達(dá)最高值；在液料比一定時(shí)，隨溫度的增加，辣木葉多酚提取率的變化趨勢(shì)為先增加后減小，當(dāng)提取溫度為51 ℃時(shí)，辣木葉多酚的提取率達(dá)最高值.提取溫度和液料比對(duì)辣木葉多酚的影響近似橢圓，說(shuō)明有交互作用（圖6-B）.

由圖7-A可知，當(dāng)提取溫度一定時(shí)，隨正丙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，辣木葉多酚提取率的變化趨勢(shì)為先增加后減小，當(dāng)正丙醇體積分?jǐn)?shù)為78%時(shí)，辣木葉多酚的提取率達(dá)最高值；在正丙醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨溫度的增加，辣木葉多酚提取率的變化趨勢(shì)為先增加后減小，當(dāng)提取溫度為51 ℃時(shí)，辣木葉多酚的提取率達(dá)最高值.提取溫度和正丙醇體積分?jǐn)?shù)比對(duì)辣木多酚的影響近似橢圓，說(shuō)明有交互作用（圖7-B）.

由圖8-A 可知，當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，隨液料比的增加，辣木葉多酚提取率的變化趨勢(shì)為先增加后減小，當(dāng)液料比在50∶1（V·m-1，mL·g-1）時(shí)，辣木葉多酚的提取率最高；在液料比一定時(shí)，隨提取時(shí)間的增加，辣木葉多酚提取率的變化趨勢(shì)為先增加后減小，當(dāng)提取時(shí)間為50 min時(shí)，辣木葉多酚的提取率最高.提取時(shí)間和液料比對(duì)辣木葉多酚的影響近似橢圓，說(shuō)明有交互作用（圖8-B）.

由圖9-A可知，當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，隨正丙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，辣木葉多酚提取率的變化趨勢(shì)為先增加后減小，當(dāng)正丙醇體積分?jǐn)?shù)為78%時(shí)，辣木葉多酚的提取率達(dá)最高值；在正丙醇體積分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨提取時(shí)間的增加，辣木葉多酚提取率的變化趨勢(shì)為先增加后減小，當(dāng)提取時(shí)間為50 min時(shí)，繼續(xù)增加時(shí)間辣木葉多酚提取率略有減少，在提取時(shí)間為50 min時(shí)，辣木葉多酚的提取率達(dá)最高值.提取時(shí)間和正丙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)辣木葉多酚的影響近似橢圓，說(shuō)明有交互作用（圖9-B）.

2.5 最佳工藝及其驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)上述數(shù)學(xué)回歸模型計(jì)算出最佳工藝條件：硫酸銨用量為0.3 g·mL-1，正丙醇體積分?jǐn)?shù)為78%，液料比為52.5∶1（V·m-1，mL·g-1），超聲時(shí)間為50 min，超聲溫度為51 °C，預(yù)測(cè)值為3.17%.在此條件下提取辣木葉多酚，重復(fù)進(jìn)行4 次平行試驗(yàn)，實(shí)際測(cè)得辣木多酚的提取率為3.20%±0.02%.預(yù)測(cè)值與實(shí)際理論值接近，模型預(yù)測(cè)值在實(shí)際值的誤差范圍之內(nèi).說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的辣木多酚的工藝條件參數(shù)具一定的可靠性.

2.6 體外抗氧化活性評(píng)價(jià) 由表4可知，辣木葉多酚的ORAC值高達(dá)8296±76 μmol TE·g-1，且具有清除OH·、DPPH·和ABTS·+的能力，且清除OH·的半數(shù)清除濃度（IC50）值小于維生素C（VC）的值，清除DPPH·的IC50值與VC的值無(wú)顯著性差異，即辣木葉多酚清除OH·和DPPH·的效果分別優(yōu)于或接近VC的效果.

表4 辣木葉多酚的體外抗氧化能力評(píng)價(jià)Tab. 4 Evaluation of antioxidant activity in vitro of polyphenols from leaves of M. oleifera

3 討論與結(jié)論

利用超聲波輔助正丙醇-硫酸銨雙水相法提取辣木葉多酚，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken 設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法（RSM）優(yōu)化辣木葉多酚提取的最佳工藝參數(shù)為：硫酸銨用量0.3 g·mL-1，正丙醇體積分?jǐn)?shù)78%，液料比52.5∶1（V·m-1，mL·g-1），超聲時(shí)間50 min，超聲溫度51 °C.數(shù)學(xué)回歸模型為：Y=2.840+0.062A+0.130B+0.140C-0.067D-0.045AC-0.055AD+0.180BC-0.160BD+0.047CD-0.410A2-0.390B2-0.420C2-0.760D2.在此工藝下，辣木葉多酚提取率為3.20%±0.02%.裴斐等［24]采用超聲波輔助蒸餾水法提取辣木葉多酚，而符穩(wěn)群等［25]采用超聲波輔助乙醇法提取，獲得多酚提取率分別為2.514%和2.732%.本研究中獲得的提取率比上述二種方法的提取率分別高出0.686%和0.468%，因此采用雙水相法提取辣木葉多酚會(huì)顯著提高其提取率.

抗氧化效果的體外化學(xué)評(píng)價(jià)通常采用的指標(biāo)包括ORAC法、OH·清除法、ABTS·+清除法、DPPH·清除法、超氧陰離子（O2·-）清除法和鐵離子還原能力（FRAP）法等多種方法.不同物質(zhì)的化學(xué)與生物學(xué)性質(zhì)差異很大，不同體外測(cè)定方法的原理不同，同一種物質(zhì)清除各種自由基的能力不同；即使同一種物質(zhì)采用不同的評(píng)價(jià)方法結(jié)果也不同，因此在評(píng)價(jià)一種物質(zhì)的抗氧化效果時(shí)通常采用多種方法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià).ORAC法是基于物質(zhì)供氫能力的一種測(cè)定方法，與人類(lèi)生物學(xué)相關(guān)性最大，所得到的抗氧化能力更能反映物質(zhì)在體內(nèi)的相關(guān)作用，目前普遍應(yīng)用于對(duì)各種物質(zhì)的抗氧化評(píng)價(jià)［36].本研究中不僅辣木葉多酚的ORAC 值高達(dá)8296±76 μmol TE·g-1，且其清除OH·、DPPH·的效果分別均優(yōu)于或接近VC的效果，該結(jié)果顯著高于裴斐等［24]提取的辣木葉多酚清除OH·、DPPH·的效果，這應(yīng)該與雙水相法能起到純化的作用有關(guān).

綜上所述，通過(guò)超聲波輔助雙水相法提取的辣木葉多酚已經(jīng)具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，是一種良好的天然抗氧化劑.但針對(duì)辣木葉多酚分離純化、體內(nèi)活性測(cè)定及活性機(jī)理還需進(jìn)一步研究.