雷公藤甲素普朗尼克混合載藥膠束的制備

桂榮，曹瑞珍，金玲玲，尹美珍

（內(nèi)蒙古民族大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼028000）

聚合物膠束是由兩親性嵌段共聚物分子在水溶液中自組裝成的具有親水性外殼和疏水性內(nèi)核的膠體分散系，不僅能增溶藥物，還可以延長藥物在體內(nèi)的循環(huán)時間，提高生物利用度，并且可以依賴于腫瘤組織的高通透性和滯留效應(yīng)（enhanced permeability and retention effect，EPR）［1-4]，實現(xiàn)藥物向腫瘤部位的被動靶向，從而降低藥物的全身毒性.近年來，出現(xiàn)了大量有關(guān)聚合物膠束的研究報道.普朗尼克是一種結(jié)構(gòu)簡單、來源方便、成本低的兩親性三嵌段共聚物，由聚氧乙烯（PEO）、聚氧丙烯（PPO）組成，PPO 和PEO嵌段比例不同構(gòu)成多種不同型號的普朗尼克.普朗尼克在水溶液中自組裝形成“核-殼”結(jié)構(gòu)的納米聚合物膠束.普朗尼克兩端PEO 嵌段的羥基，很容易對其進(jìn)行化學(xué)改造［5，6]，實現(xiàn)藥物向腫瘤細(xì)胞的主動靶向.此外，普朗尼克還具有多種途徑的逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性作用［6].因而，普朗尼克作為載體材料得到了廣泛關(guān)注.研究報道了多種單一普朗尼克F127、P85、P105 載藥膠束［7-9]，以及雙普朗尼克F127/P105、F127/P1123、F127/L61載藥膠束［10-12]，用于靶向遞送阿霉素、紫杉醇、甲氨蝶呤、多西他賽等多種化療藥物.研究發(fā)現(xiàn)兩種不同普朗尼克的親水和疏水嵌段之間相互作用，可增加遞藥系統(tǒng)的穩(wěn)定性，不受血液稀釋的影響［13]，可以解決單一普朗尼克膠束因在血液大量稀釋后藥物提前釋放的問題.

雷公藤甲素（Triptolide，TPL）是從傳統(tǒng)中藥雷公藤中分離的一種雙萜類化合物，具有抗風(fēng)濕、抗老年癡呆、抗炎癥、抗氧化、抗腫瘤，免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)神經(jīng)元和心血管等多種藥理作用，其抗腫瘤作用倍受人們關(guān)注.研究證明TPL的抗腫瘤活性相比傳統(tǒng)化療藥物順鉑、絲裂霉素和紫杉醇更強(qiáng)［14].但同時對消化、泌尿和血液系統(tǒng)等也表現(xiàn)出較大的毒副作用，因而限制了其在臨床上的應(yīng)用.

普朗尼克F127和F68作為多功能藥用輔料被收載于中國藥典和美國藥典中，具有良好的生物相容性和安全性.因此，本實驗選擇普朗尼克F127 和F68 作為載體材料，采用薄膜水化法制備雙普朗尼克膠束，裝載疏水性的雷公藤甲素，并研究其載藥量和包封率，為雷公藤甲素的靶向遞送提供合適的載體，并為進(jìn)一步多功能載體研究打下基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

普朗尼克F127、F68（BASF，Ludwigshsfen，Germany），雷公藤甲素（Triptolide，純度98.5%，Aladdin），雷公藤甲素對照品（中國藥品生物制品檢定所）.

1.2 F127/F68-TPL混合載藥膠束的制備

采用薄膜水化法制備聚合物載藥膠束.稱取一定量的載體材料，即普朗尼克F127和F68，以及適量的疏水性藥物雷公藤甲素（TPL），無水乙醇使其充分溶解，氮氣流蒸發(fā)將有機(jī)溶劑蒸干，真空干燥過夜，得干燥透明的一層薄膜（藥膜）；然后加一定量的去離子水，在一定的水浴溫度下，在300 rpm轉(zhuǎn)速下恒速攪拌30 min，進(jìn)行水化，冷卻至室溫，10000 rpm 離心10 min，用無菌0.22 μm 醋酸纖維素濾膜過濾，得到透明的普朗尼克-雷公藤甲素聚合物膠束溶液，冷凍干燥可得到凍干粉.

1.3 載藥量和包封率測定

采用RP-HPLC 法測定F127/F68-TPL 中TPL 的含量.（1）色譜條件：反相色譜柱（Agilent，C18，150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇：水=30∶70；流速0.8 mL/min，檢測波長213 nm；柱溫30℃，進(jìn)樣量20μl.（2）采用TPL對照品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線y=34.23 x-54.88（R2=0.9994）.TPL在0.1～50 μg/mL濃度范圍內(nèi)，色譜峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系.該方法專屬性良好，普朗尼克對TPL檢測無干擾.（3）樣品溶液的制備及測定.精密量取一定量載藥膠束溶液，加一定量甲醇稀釋，混勻，漩渦l min，10000 rpm離心10 min，取上清液，0.45 μm微孔有機(jī)濾膜過濾，取濾液20 μL注入色譜儀，測定主成分的峰面積.（4）根據(jù)如下公式計算載藥量（Drug Loading，DL）和包封率（Encapsulation rate，ER）.DL%=膠束中藥物的重量/所加聚合物和藥物的總重量×100%，ER%=膠束中藥物的重量/所加藥物的重量×100%.

1.4 單因素考察

載體材料質(zhì)量為200 mg，以ER%及DL%為指標(biāo)，對薄膜水化法中的可變因素進(jìn)行考察.

1.4.1 混合載體F127和F68的質(zhì)量比考察將TPL投藥量固定為5 mg，水化溫度50 ℃，加水量分別為5 mL，10 mL和20 mL，考察F127的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.3%、50%、66.7%和100%時，對DL%和ER%的影響.

1.4.2 投藥量考察

F127和F68各為100 mg，水化溫度50 ℃，加水量10 mL，考察TPL投藥量為3 mg、5 mg、7 mg、8 mg和9 mg時，對DL%和ER%的的影響.

1.4.3 加水量考察

F127和F68各為100 mg，TPL投藥量為5 mg，水化溫度50℃，考察水化時用水量分別為5、10、15、20、25 mL時DL%和ER%的變化.

1.4.4 水化溫度考察

F127 和F68 各為100 mg，TPL 投藥量為5 mg，用水量為10 mL，考察水化溫度分別是30℃、50℃、70℃、80℃和90℃時，對DL%和ER%的影響.

1.5 水化溫度對膠束泄漏藥物的影響

將1.4.4制備好的載藥膠束溶液恒溫水浴振蕩（37℃，100 rpm）48 h后，再取樣RP-HPLC法測定載藥膠束中TPL的含量，計算TPL的泄漏量即TPL的沉淀百分?jǐn)?shù).根據(jù)公式計算TPL的泄漏量.

泄漏量（%）=（原膠束中藥物的含量-震蕩放置后膠束中藥物的含量）/原膠束中藥物的含量×100%

1.6 優(yōu)化工藝驗證

通過單因素考察，以及水化溫度對泄漏量影響的考察，綜合考慮ER%值和DL%值，優(yōu)化薄膜水化法的制備工藝，當(dāng)載體量200 mg，F(xiàn)127與F68的質(zhì)量比為1，TPL投藥量8 mg，加水量20 mL，水化溫度50℃時，DL%和ER%的值均較高.

2 結(jié)果

2.1 載藥量和包封率的影響因素

2.1.1 載體質(zhì)量分?jǐn)?shù)對包封率和載藥量的影響

見圖1a，圖1b.當(dāng)TPL 的投藥量為5 mg，水化溫度50℃，加水量分別為5 mL 時，隨F127 質(zhì)量比的增大，DL%和ER%的值均逐漸增大；而當(dāng)水量分別為10 mL 和20 mL 時，隨F127 質(zhì)量比增大，DL%和ER%的值均沒有明顯變化.但是，隨水量增多，相應(yīng)的DL%和ER%值均增大.此結(jié)果說明加水量不足時，混合載體中F127的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不同對膠束的載藥量和藥物的包封率有影響，而當(dāng)水量達(dá)到一定程度時，則沒有明顯的影響.

2.1.2 投藥量對包封率和載藥量的影響

見圖2.當(dāng)水量為10 mL時，隨投藥量的增加，載藥量呈現(xiàn)明顯先上升趨勢，而包封率則呈現(xiàn)明顯下降趨勢.結(jié)果表明投藥量對膠束的載藥量以及藥物的包封率影響較大，增加投藥量可提高載藥量，但可能會降低包封率.

2.1.3 加水量對包封率和載藥量的影響

見圖3.當(dāng)加水量為20 mL 以下時，隨加水量的增加，載藥量和包封率均逐漸升高，當(dāng)加水量達(dá)到20 mL以上時，水量增加，載藥量和包封率均逐漸降低.表明加水量對載藥量和包封率有較大的影響，提高加水量可提高膠束的載藥量以及藥物的包封率，最佳水量為20 mL.

2.1.4 水化溫度對包封率和載藥量的影響

見圖4.水化溫度在30～80℃的溫度范圍內(nèi)，隨溫度升高載藥量和包封均增大，而溫度達(dá)到80℃～90℃時，ER%值和DL%值又均降低.因此，水化溫度對ER%值和DL%值又較大影響，提高水化溫度可提高膠束的載藥量以及藥物的包封率，但水化溫度越高，靜置于室溫后，吸附于疏水內(nèi)核的藥物分子可能越易泄漏.

2.2 水化溫度對泄漏量的影響

見圖5.水化溫度越高，藥物在膠束上48h內(nèi)的泄漏量越高，尤其是水化溫度達(dá)80℃以上，藥物泄漏的百分比更大.

2.3 優(yōu)化制備工藝

F127 與F68 各100 mg 時，采用薄膜水化法的優(yōu)化工藝，TPL 投藥量8 mg，加水量20 mL，水化溫度50℃，制備得載藥膠束F127/F68-TPL，其載藥量為3.47%，TPL 的包封率為90.09%.此優(yōu)化的制備工藝獲得較高的膠束載藥量和藥物包封率.

3 討論

膠束的制備方法主要有透析法、薄膜水化法和乳化溶劑蒸發(fā)法［7].薄膜水化法是比較簡單而方便的制備方法，且該方法的應(yīng)用最為廣泛.本實驗采用薄膜水化法制備了F127/F68-TPL 混合載藥膠束，通過單因素考察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加水適量時，F(xiàn)68和F127的質(zhì)量比對膠束的載藥量和藥物的包封率沒有顯著影響.由于混合普朗尼克可以避免大量血液稀釋導(dǎo)致藥物早泄［13]，因而本實驗選擇F68和F127的質(zhì)量比為1：1制備載藥膠束.單因素考察結(jié)果還表明投藥量、加水量以及水化溫度對膠束的載藥量和藥物的包封率均有較大的影響，不同的制備工藝條件得到不同的載藥量和包封率，尤其水化溫度的提高對載藥量和包封率的提高更為明顯.本實驗中水化溫度對泄漏量影響的實驗結(jié)果表明：在50～90℃的水化溫度中以50℃可以得到最穩(wěn)定的載藥膠束.因此，通過單因素分析，綜合考慮載藥量、包封率以及泄漏量，進(jìn)行制備工藝的優(yōu)化，提高載藥膠束的載藥量.在此基礎(chǔ)上可以采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法最優(yōu)化載藥膠束的制備工藝，并通過驗證進(jìn)行確定.

TPL的抗腫瘤活性較強(qiáng)，有研究證實其對多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用，平均使用濃度為12 nM［15].由于TPL的使用濃度極低，即使F127/F68-TPL的載藥量最低為1%，也能遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足制劑的使用要求.

總之，本實驗制備的F127/F68-TPL混合載藥膠束，載藥量雖低，在1.3%～3.5%之間，但對于使用劑量較低的藥物，需要較低含量的制劑.此外，薄膜水化法制備方法簡單易行，載體材料經(jīng)濟(jì)可得，制備的雙普朗尼克載藥膠束穩(wěn)定.因此，普朗尼克F127/F68為載體材料的混合膠束可以作為TPL的靶向遞送載體.