植物組織培養(yǎng)過程中存在的問題及預(yù)防措施

鄒 悅 劉文鈺

（沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院，遼寧 撫順113122）

植物組織培養(yǎng)又叫離體培養(yǎng)，指從植物體分離出符合需要的組織、器官或細(xì)胞、原生質(zhì)體等，在無菌條件下將其接種在含有各種營養(yǎng)物質(zhì)及植物激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。組織培養(yǎng)過程中常會發(fā)生一些問題，如材料污染、褐變和玻璃化等，嚴(yán)重影響組培效果，甚至導(dǎo)致組培失敗?，F(xiàn)將植物組培過程中發(fā)生問題的原因及預(yù)防措施介紹如下。

1 材料污染

材料污染指組培過程中，培養(yǎng)基或培養(yǎng)材料滋生真菌、細(xì)菌等微生物，使培養(yǎng)材料不能正常生長和發(fā)育的現(xiàn)象。

1.1 污染的來源

植物組培過程中，所用工具、器械和接種室消毒不嚴(yán)密或技術(shù)操作不標(biāo)準(zhǔn)等均會導(dǎo)致操作環(huán)境受污染。污染原因按病原菌種類可分為細(xì)菌類污染和真菌類污染。細(xì)菌污染主要由介質(zhì)的外植體消毒不徹底且操作不當(dāng)引起的，真菌污染是由超凈工作臺衛(wèi)生不合格、無菌室空氣不干凈、實驗人員操作不妥等引起的[1]。

1.2 污染的預(yù)防

1.2.1 環(huán)境、人員、用品的衛(wèi)生要求

植物組培要求接種環(huán)境干凈衛(wèi)生，操作人員接種前需進(jìn)行嚴(yán)格的衛(wèi)生處理，組培過程中使用的一次性用品必須保證一用一換。

1.2.2 外植體材料要求

生長在土壤中的塊根、塊莖和鱗莖帶菌量較多，表面積越大的外植體材料帶菌量相對越多，因此應(yīng)盡量選擇幼嫩的莖尖、胚進(jìn)行組織培養(yǎng)。王吉鳳等[2]在芍藥組織培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，高溫多雨的環(huán)境有利于污染的發(fā)生，最佳的取材時間為3～5月份連續(xù)晴朗的下午。

1.2.3 培養(yǎng)基滅菌

目前組培容器的消毒主要采用高壓蒸汽滅菌法。滅菌操作時要嚴(yán)格遵守高壓蒸汽滅菌鍋的使用要求及注意事項。滅菌后需進(jìn)行抽樣試驗培養(yǎng)，確保同批次滅菌培養(yǎng)基表面無細(xì)菌或真菌污染，以防后期發(fā)生污染造成更大損失。

2 材料褐變

培育的外植體褐變會嚴(yán)重影響外植體的生長與分化，甚至造成組培苗死亡，是目前植物組織培養(yǎng)中十分棘手的問題。

2.1 褐變產(chǎn)生的原因

材料褐變的原因和影響因素較為復(fù)雜，涉及外植體的選擇、培養(yǎng)條件以及培養(yǎng)方式等。

2.1.1 外植體的選擇

外植體的種類、取材部位、取材季節(jié)等是材料發(fā)生褐變的主要影響因素。研究表明，同一種植物，幼齡比成齡產(chǎn)生褐變的可能性小，取材小的外植體發(fā)生褐變可能性較大，取材季節(jié)以春秋兩季較適宜[3]。

2.1.2 外植體的培養(yǎng)條件

消毒時間越長外植體褐變越嚴(yán)重，光照和高溫都會加劇外植體褐變；培養(yǎng)基瓊脂的用量越少、無機(jī)鹽濃度越高，外植體發(fā)生褐變的幾率越大。

2.1.3 外植體的培養(yǎng)方式

一般情況下，莖段正向插入培養(yǎng)基比反向插入培養(yǎng)基，外植體發(fā)生褐變的幾率大；接種后放置時間越長外植體越易產(chǎn)生褐變。

2.2 材料褐變的預(yù)防

2.2.1 外植體材料的選用

由褐變的產(chǎn)生原因可知，應(yīng)避免在夏季或冬季取材，宜選用大一些的幼齡外植體。若取材需求允許，盡量采集草本植物作外植體材料。

2.2.2 外植體的培養(yǎng)條件

外植體材料的消毒處理必須符合要求；組織培養(yǎng)的環(huán)境要求低溫避光，以降低植物細(xì)胞中酶的活性，從而避免褐變的產(chǎn)生；培養(yǎng)基配制時適當(dāng)增加瓊脂用量，以降低無機(jī)鹽濃度，創(chuàng)造酸性的培養(yǎng)環(huán)境。

2.2.3 外植體的培養(yǎng)方式

若在科學(xué)選用外植體材料、滿足外植體培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，外植體褐變防控效果仍不理想，可在培養(yǎng)基中適當(dāng)添加抗褐變助劑，如有吸附作用的助劑活性炭和抗氧化劑硝酸銀等[4]。

3 材料玻璃化

玻璃化指在植物組織培養(yǎng)過程中，各種不適因素導(dǎo)致組培苗葉片卷曲畸形并出現(xiàn)嫩綠透明的現(xiàn)象。玻璃化普遍發(fā)生于自然界的多種植物中，會降低材料的存活能力，使其無法繼續(xù)展開后續(xù)的繼代、馴化、移栽及培養(yǎng)工作[5]。

3.1 玻璃化的成因

3.1.1 外植體材料

外植體材料的類別、取材部位以及材料的大小都能導(dǎo)致玻璃化發(fā)生，且顯著影響玻璃化程度。一般外植體新分化、分化程度較低的組織更易發(fā)生玻璃化。

3.1.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)環(huán)境溫度過高、培養(yǎng)瓶的照光時間過長，培養(yǎng)材料易發(fā)生玻璃化；繼代培養(yǎng)代數(shù)越多，玻璃化發(fā)生的幾率越高、發(fā)生越嚴(yán)重。

3.1.3 培養(yǎng)基類型

提高基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的NH4+濃度，會增加組培苗玻璃化發(fā)生的可能性；植物組織培養(yǎng)過程中，蔗糖不僅具有維持相對穩(wěn)定滲透壓的能力，還有克服并減少材料玻璃化發(fā)生的作用。

3.2 材料玻璃化的預(yù)防措施

3.2.1 外植體的選用

選用植物中木質(zhì)化、分化程度較高、個頭較大的組織進(jìn)行植物組織培養(yǎng)。

3.2.2 培養(yǎng)環(huán)境

適宜的低溫環(huán)境可預(yù)防培養(yǎng)材料發(fā)生玻璃化；透氣性好的封口材料能提高培養(yǎng)瓶內(nèi)的通氣度、降低培養(yǎng)瓶小環(huán)境濕度，可減少玻璃苗的發(fā)生。

3.2.3 培養(yǎng)基成分

減少培養(yǎng)基中NH4+的添加量，增加Ca2+的添加量，適當(dāng)提高蔗糖濃度，適當(dāng)減少細(xì)胞分裂素，可減輕玻璃化發(fā)生的程度；培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，不僅可降低培養(yǎng)材料玻璃化的發(fā)生率[6]，還能預(yù)防材料褐變。