3種方法檢測梅毒螺旋體抗體不確定標本的性能評價*

劉 蓉，滕文友，何章勇，代國知，郭旺源

(湖南省郴州市第一人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心，湖南郴州 423001)

梅毒是梅毒螺旋體感染人體所引起的一種慢性、系統(tǒng)性、長期發(fā)展的性傳播疾病，具有較強傳染性[1]。梅毒主要傳播途徑為性接觸傳播、母嬰垂直傳播和血液傳播。孕婦一旦感染，可導致胎兒早產、死產或娩出先天梅毒患兒[2]。由于梅毒螺旋體培養(yǎng)困難，實驗室常用血清學檢查進行梅毒血清學篩查和診斷，包括梅毒螺旋體試驗和非梅毒螺旋體試驗[3]。梅毒螺旋體試驗包括化學發(fā)光免疫試驗(CLIA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、梅毒螺旋體顆粒凝集試驗(TPPA)、時間分辨熒光免疫試驗(TRFIA)和膠體金法等。本研究擬以TPPA為確認試驗，比較TRFIA、ELISA和膠體金法檢測梅毒抗體不確定標本的能力，為實驗室選擇合適的梅毒檢測方法和策略提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料來源 收集2019年10月15日至2020年1月17日于本院進行梅毒特異性抗體檢測結果為不確定的血清標本共142份，男54例，女88例，平均年齡(50±14)歲。

1.2標本納入標準 用TRFIA檢測梅毒血清抗體，1.0≤S/CO≤9.9為梅毒抗體不確定標本，作為研究對象，納入研究。

1.3儀器與試劑 TPPA梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒(TPPA試劑)由日本富士瑞必歐株式會社生產，ELISA梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒(ELISA試劑)由北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司生產，TRFIA梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒(TRFIA試劑)和EasyCuta MiNi全自動時間分辨熒光免疫分析檢測儀由江蘇蘇州新波生物技術有限公司生產，膠體金法梅毒螺旋體抗體檢測試劑盒由廈門英科新創(chuàng)科技有限公司生產，洗板機ELX-50和酶標儀ELX-800由美國寶特公司生產。

1.4方法 將實驗前收集并保存于-20 ℃的血清標本取出并解凍，同時用TPPA、ELISA、TRFIA和膠體金法檢測。TPPA：加標本稀釋液至U型反應板，第1孔100 μL，第2～4孔各25 μL，用移液器取血清25 μL至第1孔，反復混勻后取25 μL至第2孔，連續(xù)倍比稀釋至第4孔，最后1孔混勻后棄去25 μL，第3孔加未致敏粒子25 μL，第4孔加致敏粒子25 μL，將微量反應板置振蕩器振蕩30 s；置微量反應板于有蓋濕盒內，室溫靜置2 h后，觀察結果，第4孔凝集成實心圓為陰性，散在分布或者成環(huán)狀為陽性。ELISA：分別在預包被板條孔中加入待測標本100 μL，同時設空白對照1孔、陰性對照各3孔和陽性對照2孔；37 ℃溫育60 min；洗板5次；除空白對照孔外，分別加入酶標記物100 μL，輕輕振蕩混勻；37 ℃溫育30 min；洗板5次；每孔加入顯色劑A、B各50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃顯色30 min；每孔加入終止液50 μL，輕輕振蕩混勻；終止后10 min內測試并輸出結果，結果判讀S/CO<1.0為陰性，S/CO≥1.0為陽性。TRFIA：分別在相應板條孔中加入待測標本50 μL，同時設陰性和陽性對照各2孔；各孔中加相應銪標抗原100 μL；室溫，振蕩45 min；洗板5次；各孔加入相應銪標生物素100 μL；室溫，振蕩15 min；洗板5次；每孔加入增強液各100 μL，室溫，振蕩15 min；加增強液后30 min內自動檢測并輸出結果，以S/CO<1.0為陰性，S/CO≥1.0為陽性。膠體金法：從包裝袋內取出試劑條，置于干凈平臺上，于加樣區(qū)加100 μL標本，20 min內讀取并記錄結果，僅出現(xiàn)質控線為陰性，質控線和檢測線同時出現(xiàn)為陽性。以上操作和結果判定均嚴格按照作業(yè)指導書進行。

1.5統(tǒng)計學處理 將實驗數(shù)據(jù)錄入EXCEL表格，用SPSS19.0進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。本研究數(shù)據(jù)為配對計數(shù)資料，以頻數(shù)或率表示。以TPPA為標準，采用受試者工作特征(ROC)曲線分析TRFIA、ELISA和膠體金法的檢測能力。

2 結 果

2.1TPPA、TRFIA、ELISA和膠體金法檢測結果分析 以TPPA結果為標準，檢出梅毒抗體陽性35例，陰性107例；TRFIA與TPPA不一致107例，均為假陽性；ELISA與TPPA不一致8例，假陽性和假陰性均為4例；膠體金法與TPPA不一致33例，假陽性和假陰性分別為16例和17例。見表1。

表1 TRFIA、ELISA、膠體金法與TPPA檢測結果(n)

2.2TRFIA、ELISA和膠體金法檢測能力比較 以TPPA為標準，TRFIA的靈敏度為100.00%，而特異度為0.00%，假陽性率高；ELISA靈敏度為88.57%，特異度為96.26%，符合率為94.37%；膠體金法靈敏度僅為51.43%，特異度和符合率分別為85.05%和76.76%，假陰性率高；ELISA陽性似然比為23.68，TRFIA陰性似然比為0.00。見表2。

表2 TRFIA、ELISA和膠體金法檢測能力比較

2.3TRFIA、ELISA和膠體金法ROC曲線 TRFIA、ELISA和膠體金法ROC曲線下面積分別為0.50、0.92和0.68，其中ELISA檢測梅毒抗體不確定標本準確率最高，膠體金法次之，TRFIA最低。見圖1。

圖1 TRFIA、ELISA和膠體金法ROC曲線

3 討 論

目前，梅毒是一個嚴重威脅人類健康的公共性問題。近年來，我國梅毒發(fā)病率呈明顯上升趨勢，已成為嚴重的社會和醫(yī)學問題[4]。在美國，梅毒流行率不斷上升，其中男性同性戀、育齡婦女和新生兒的梅毒發(fā)病率增幅最大[5]。

梅毒螺旋體篩查作為孕前優(yōu)生基本項目之一，其準確的檢驗結果是正確評價計劃懷孕夫婦患梅毒風險的重要依據(jù)[6]。我國基層實驗室在進行梅毒血清學篩查時，使用的方法種類很多，在日常工作中使用不同檢測方法時，需充分了解其特點，報告檢驗結果時應綜合分析，必要時可選擇多種方法進行檢測和驗證，以提高檢測結果的準確性[7]。

TPPA使用梅毒螺旋體毒株(Nichols株)制成抗原，與待測血清中的梅毒螺旋體抗體產生凝集反應，其優(yōu)點是試劑穩(wěn)定、結果明了、靈敏度高和特異度高，缺點是手工操作繁瑣，結果需主觀判斷，對操作人員能力要求較高，試劑成本較高[1,8]，不易進行大批量標本檢測。美國疾病預防控制中心推薦使用TPPA來判定梅毒螺旋體試驗和非梅毒螺旋體試驗不一致的結果[9]，并將TPPA定為確診方法。因此，本研究將TPPA作為確認試驗，來評價其他3種方法對臨床常見梅毒抗體不確定標本的檢測能力。

TRFIA是以鑭系元素(本研究試劑盒以銪元素為標記)標記抗原或抗體，與時間分辨測定技術結合而建立起來的一種新型非放射性微量分析方法，經增強液放大，可以將檢測下限提高百萬倍，具有靈敏度高、發(fā)光穩(wěn)定和熒光壽命長等優(yōu)點，已被廣泛用于臨床檢測[10]。但在梅毒患病率較低的人群中，單獨使用靈敏度高、特異度較低的方法檢測，易導致誤診，會給患者造成不必要的傷害和情緒困擾[11-12]。由于TRFIA靈敏度高和特異度低，用于梅毒血清學篩查時，其檢測的低熒光強度的標本需用TPPA進一步確認，以減少假陽性。

ELISA因具有靈敏度高、特異度高和操作簡單等優(yōu)點，被廣泛應用于臨床檢測。本研究結果顯示，ELISA靈敏度、特異度和符合率均較高。膠體金法是常用的即時檢測方法，快速、簡便，但由于靈敏度低，使其應用受到限制。有學者認為單獨采用ELISA檢測出的假陽性結果，在沒有“金標準”做補充的情況下，很難作出明確的判斷。血清學結果不一致的患者[如EIA-反應性、快速血漿反應素環(huán)狀卡片試驗(RPR)-無反應性]對臨床醫(yī)生來說是診斷和治療的挑戰(zhàn)，因為這些結果可能是假陽性、梅毒前期或在反應性RPR發(fā)生前的早期梅毒[13-14]。因此，血清學結果不一致時需用TPPA確認。但這樣可能會帶來一些不必要且重復的工作，增加實驗室的試劑和人力成本，這就需要實驗室制訂科學合理的梅毒檢測策略和復檢規(guī)則，以便精簡工作流程，提高工作效率和結果準確性。

既往有關于CLIA與ELISA和膠體金法等梅毒血清學檢測方法比較和評價的研究[15]，而對于梅毒螺旋體抗體不確定標本的檢測歷來備受關注但研究不多。本研究創(chuàng)新地比較了TRFIA、ELISA和膠體金法在梅毒螺旋體抗體不確定標本的檢測能力。首先，隨著TRFIA技術的成熟，其被廣泛應用，需要更多的實驗數(shù)據(jù)和結果供參考和選擇。其次，筆者在前期實驗發(fā)現(xiàn)，當TRFIA的S/CO>9.3時，TRFIA與TPPA結果一致，因此，本研究選擇1.0≤S/CO≤9.9的標本作為梅毒抗體不確定標本進行研究。此外，不論是梅毒血清學篩查，還是確認試驗，梅毒抗體不確定標本才是實驗室檢測的難點和重點，只有此類標本結果的準確性才能真實和客觀地評價某種檢測方法和診斷試劑。

本研究的不足之處在于，僅選擇了1.0≤S/CO≤9.9的梅毒抗體不確定標本進行研究，若能同時選擇S/CO>9.9和S/CO<1.0的標本，將能更加全面地比較和評價3種方法的檢測能力，計劃下一步開展此研究。

本研究結果顯示，TRFIA雖靈敏度高，但特異度低，若用于梅毒血清學篩查，低熒光強度的標本需加做TPPA，以減少誤診；ELISA的靈敏度、特異度和符合率均高，可用于實驗室梅毒血清學篩查和診斷，但灰區(qū)標本仍需TPPA確認；膠體金法靈敏度低，易漏診，不宜用于梅毒血清學篩查，但在無條件開展其他梅毒血清學檢測的基層或者社區(qū)實驗室和僻遠地區(qū)及術前急查時也是可以選擇的。因此，建議實驗室應全面了解各種梅毒檢測方法的優(yōu)缺點和性能，并結合自身條件和被檢測人群的梅毒流行病學特征，選擇適當?shù)臋z測方法和策略，以減少誤診和漏診，提高梅毒檢測結果的準確性，以便更好地服務臨床和患者。

綜上所述，TRFIA靈敏度高，可用于梅毒血清學篩查；ELISA的靈敏度、特異度和符合率均高，可用于梅毒血清學篩查和診斷；膠體金法的靈敏度低，不宜用于梅毒血清學篩查。檢測灰區(qū)的梅毒抗體不確定標本需用TPPA復查，以減少誤診。