微重力對MC3T3-E1前成骨細胞增殖、分化影響的研究進展

胡逍然，尹文哲，孫奇峰，李陽杰，吳桐，代顯葵

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150081)

宇航員在太空飛行中經(jīng)歷的微重力導致人體發(fā)生嚴重生理變化，其中包括頭部液體移位、液體和電解質流失、肌肉質量減少、空間暈動病、貧血、免疫反應降低以及骨質流失等，骨質流失是這些問題中最重要的問題之一，其嚴重程度似乎與飛行持續(xù)時間有關。航天飛行期間宇航員每月?lián)p失1%～2%的骨量，這種損失很大程度上是由于促進骨形成的成骨細胞標志物的減少引起，導致骨形成明顯減少和骨吸收增加的潛在分子機制尚不清楚。研究證明微重力條件下骨形成減少與骨成熟標志物的減少，細胞骨架的改變，凋亡和自噬的增加以及其他相關蛋白及基因的變化有關，這也間接表明了微重力下骨質流失是一個復雜的生理過程。本文對近年來模擬微重力條件下MC3T3-E1前成骨細胞增殖和分化影響的研究進展作一綜述，以期為航空航天條件下骨丟失的預防和治療提供一定的理論基礎。

1 微重力對MC3T3-E1前成骨細胞增殖的影響

在微重力誘導的骨丟失過程中，成骨細胞增殖的減少起著重要作用。研究表明，暴露于失重或微重力導致的機械負荷減少使負重骨骼骨質流失明顯，而機械負荷的增加促進了造型骨骼中的骨形成[1]。Bucaro等[2]在模擬微重力條件下培養(yǎng)MC3T3-E1前成骨細胞，發(fā)現(xiàn)其堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、重組Runt相關轉錄因子2(recombinant runt related transcription factor 2，Runx-2)、骨鈣素(osteocalcin，OC)和Ⅰ型膠原的表達降低，細胞凋亡增加。維持在微重力用致凋亡因子十字孢堿處理3 h后發(fā)現(xiàn)線粒體處理硫醇氧化還原能力下降，對致凋亡因子較正常重力下更加敏感，其相應生物學改變可能是引起細胞凋亡的原因?？沟蛲龅鞍譈cl-2和線粒體功能調節(jié)蛋白AKT表達的下降，表明細胞在微重力環(huán)境中誘導細胞凋亡。隨后的實驗將MC3T3-E1細胞移入兩種藻酸鹽載體膠囊中，培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)對致凋亡因子十字孢堿和硝普鈉的敏感性無明顯變化，提示微重力不會直接導致MC3T3-E1前成骨細胞的凋亡[3]。成骨生長肽(osteogenic growth peptide，OGP)是一種具有成骨作用的多肽類生長因子，該生長因子在加快骨折愈合、預防和治療骨質疏松癥等方面具有良好的效果。劉俊麗等[4-5]的研究顯示微重力下MC3T3-E1細胞增殖受到抑制，ALP活性及骨橋蛋白(osteopontin，OPN)含量降低，加入10-8mol/L OGP處理后，細胞增殖活性顯著提高，ALP活性及OPN含量均得到恢復。在進一步的研究中，將OGP改構物奧金肽(osgentide，OST)作用于MC3T3-E1細胞，研究發(fā)現(xiàn)1 nmol/L OST5能顯著提高微重力下細胞的增殖活性并且促進DNA合成從而使細胞增殖。周驊等[6]發(fā)現(xiàn)微重力下MC3T3-E1細胞AKT(絲/蘇氨酸蛋白激酶)磷酸化水平降低，加入SC79(p-AKT激活劑)后能促進細胞增殖，初步證明微重力環(huán)境可通過影響AKT蛋白的磷酸化水平從而抑制成骨細胞的增殖。

已經(jīng)證明有幾種miRNA可以調節(jié)成骨細胞的增殖，但miRNA是否可以在微重力下調節(jié)成骨細胞的凋亡以及大多數(shù)miRNA與微重力引起的骨丟失之間的關系仍有待探索[7-8]。Sun等[9]研究發(fā)現(xiàn)，微重力使MC3T3-E1前成骨細胞數(shù)量明顯減少，時間依賴性生長曲線下移，死亡細胞百分比增加，而miR-103表達增加。miR-103過表達促進上述情況，miR-103低表達結果則相反。miR-103類似物或抑制劑與Cav1.2 siRNA共轉染，顯示miR-103過表達降低了Cav1.2蛋白水平，相反則增加了Cav1.2蛋白水平，Cav1.2 siRNA共轉染miR-103模擬物和抑制劑時，miR-103寡核苷酸的功能被完全阻斷，結果表明miR-103在微重力條件下主要通過抑制Cav1.2的表達來抑制成骨細胞增殖。Wang等發(fā)現(xiàn)微重力下的MC3T3-E1前成骨細胞中miR-139-3p表達明顯增加，將miR-139-3p類似物和抑制物共轉染，發(fā)現(xiàn)類似物組凋亡相關蛋白Bax和裂解半胱氨酸蛋白酶-3顯著增高，而Bcl-2蛋白水平顯著降低。ELK1是ETS家族的轉錄因子，并且是促進絲裂原活化蛋白激酶級聯(lián)反應的絲裂原調節(jié)途徑的重要組成部分，ELK1調節(jié)各種細胞過程，包括細胞增殖和凋亡，并且可以通過miRNA調節(jié)[10]。實驗結果表明，微重力導致ELK1的基因和蛋白表達水平顯著降低，miR-139-3p減弱ELK1蛋白水平而不減弱mRNA表達。通過過表達載體(pEX-ELK1)過表達ELK1和RNA干擾以敲低MC3T3-E1細胞中的ELK1基因，在siRNA-ELK1組中，凋亡的成骨細胞比例顯著增加，凋亡相關蛋白Bax和裂解半胱氨酸蛋白酶-3表達水平增加，而Bcl-2在siRNA-ELK1組中下調。首次證明miR-139-3p直接靶向調節(jié)ELK1蛋白水平以促進成骨細胞凋亡[11]。

2 微重力對MC3T3-E1前成骨細胞分化的影響

2.1 微重力對MC3T3-E1前成骨細胞細胞骨架的影響 細胞骨架是維持細胞形態(tài)和感知重力的關鍵結構。Hughes等[12]發(fā)現(xiàn)失重下可引起MC3T3-E1細胞肌動蛋白細胞骨架的改變，反應-擴散可能影響細胞骨架的聚合，進而影響Gl條件下F-肌動蛋白的組裝和G2/M條件下微管的聚合，導致細胞周期停滯。目前，關于微重力環(huán)境中細胞骨架的研究，大多數(shù)都難以比較不同研究之間的變化。Qian等[13]研究并通過應用分形維數(shù)分析結合其他方法，描述和量化了MC3T3-E1前成骨細胞對微重力反應的肌動蛋白細胞骨架變化。微重力環(huán)境下MC3T3-E1細胞肌動蛋白束減弱或缺失，F(xiàn)-肌動蛋白的平均熒光強度降低。同時，β-肌動蛋白mRNA表達在培養(yǎng)48 h后明顯降低。結果表明肌動蛋白細胞骨架復雜性或隨機性隨著在微重力條件下MC3T3-E1細胞中應力纖維的顯著減少，F(xiàn)-肌動蛋白的平均熒光強度降低和β-肌動蛋白mRNA表達水平的降低而顯著降低。Xu等研究表明微重力下微絲的破壞抑制了p-Smad1/5/8的核轉位及其轉錄活性；而Runx2表達及其與p-Smad1/5/8的相互作用在MC3T3-E1細胞中通過BMP2刺激促進，細胞松弛素(cytochalasin B，CB)處理后上述誘導完全減弱。結果表明微絲解聚消除了BMP2誘導的Runx2的表達。證實微重力抑制了R-Smad磷酸化和核轉位，肌動蛋白微絲可能參與這種抑制過程。Calponin是一種鈣調蛋白和肌動蛋白結合蛋白，也在非肌肉細胞中表達，并已被證明有助于骨骼穩(wěn)態(tài)[14]。實驗結果顯示模擬微重力不影響總CNN1蛋白水平，但顯著降低p-CNN1水平，微絲解聚降低了p-CNN1并增加了CNN1和Smads之間的相互作用。CNN1敲低促進了BMP2誘導的Smad1/5/8的磷酸化及其在細胞核中的積累。CNN1的過表達具有相反作用。CB解聚肌動蛋白微絲至少部分地通過CNN1抑制Smad1/5/8誘導的BMP2的磷酸化和核穿梭。結果表明，肌動蛋白細胞骨架解聚通過阻斷CNN1的Smad易位來抑制BMP2-Smad信號傳導，這可能有助于微重力誘導的骨形成減少[15]。

2.2 微重力對MC3T3-E1前成骨細胞自噬與礦化的影響 在模擬微重力條件下，MC3T3-E1前成骨細胞自噬體或自噬標記蛋白微管相關蛋白輕鏈(microtubule-associated protein light chain3，LC3)Ⅱ的表達以時間依賴性方式顯著增加，細胞存活率沒有出現(xiàn)差異，表明MC3T3-E1細胞中的自噬是通過失重誘導而細胞活力沒有任何降低。Bcl-2家族蛋白作為細胞凋亡和自噬的雙重調節(jié)劑起作用，因此參與抑制和誘導自噬。微重力降低了p-mTOR、p-ERK、p-Akt、Bcl-2、SOD蛋白的水平，升高Bax、tBid、Cat、GRP78/BiP，IRE1α，p-PERK的蛋白水平，細胞自噬增加。褪黑激素是一種從大腦松果體分泌的一種激素，具有抗凋亡作用，可作為抗氧化劑分子，對自噬具有抑制作用[16-18]。褪黑素治療減少了微重力下MC3T3-E1細胞自噬體或自噬。隨后的實驗顯示，褪黑素治療后恢復了蛋白激酶(p-mTOR、p-ERK、p-Akt)表達，提高抗自噬蛋白Bcl-2及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)水平；降低了自噬激活因子(GRP78/BiP，IRE1α，p-PERK)、過氧化氫酶Cat、促凋亡蛋白Bax及凋亡關鍵通路蛋白tBid。結果表明用褪黑激素治療通過直接干涉受體介導增加ERK/Akt/mTOR的磷酸化來抑制微重力誘導的自噬[19]。Hu等[20]通過模擬微重力處理前成骨細胞MC3T3-E1細胞，實驗結果表明，ALP活性下降，茜素紅S染色顯示礦化面積顯著減少，OC、Col Ⅰa1、DMP1表達明顯下調，Runx-2以及p-ERK水平降低。研究結果表明模擬微重力條件下ERK活性和成骨相關基因表達的下調有助于抑制成骨細胞礦化的起始階段，對礦化起始的抑制為微重力誘導的骨丟失提供了新的見解。

2.3 微重力對MC3T3-E1前成骨細胞基因表達及相關蛋白的影響 近年來關于微重力下骨丟失的研究發(fā)現(xiàn)多個基因與蛋白之間相互作用共同改變了成骨細胞的分化。Ontiberos等[21]模擬微重力培養(yǎng)MC3T3-E1細胞24 h后發(fā)現(xiàn)，細胞成熟標志物ALP和OC表達顯著降低，TATA結合蛋白(TATA-binding protein，TBP)mRNA水平?jīng)]有變化，而Runx2表達抑制超過50%，AP-1依賴性啟動子報告基因的活性被抑制超過50%，結果證明微重力抑制成骨細胞分化可能通過降低Runx2和AP-1活性實現(xiàn)。Satio等[22]研究表明微重力可能影響膠原蛋白的翻譯后修飾，特別是通過改變交聯(lián)形成中涉及的酶活性的膠原蛋白成熟途徑從而導致成骨功能的下降。模擬微重力抑制MC3T3-E1細胞中的Cav1.2表達和L-型電壓敏感性鈣通道(L-type voltage-sensitive calcium channel，LTCC)電流。此外，Cav1.2表達的下調和LTCC的抑制與模擬微重力誘導的miR-103的上調部分相關。在微重力條件下LTCC抑制和MC3T3-E1細胞中miR-103上調的關系首次得到證實[23]。韓標等[24]研究發(fā)現(xiàn)，微重力暴露下細胞成骨主要標志基因表達降低，IL-6分泌增多，IkB-α磷酸化水平升高，p65蛋白表達及磷酸化水平升高，導致NF-kB通路異常活化，進而抑制成骨細胞的分化。

Makihira等[25]研究結果顯示MC3T3-E1細胞長期暴露(7 d)于微重力條件，抑制Runx2，Osterix，Col-IaI，RANKL和OPG基因的表達。微重力可能通過抑制RANKL依賴性信號通路和降低成骨細胞中RANKL的表達從而導致成骨細胞分化減少。之后Sun的研究發(fā)現(xiàn)微重力環(huán)境下活性氧(reactive oxygen species，ROS)形成增加，成骨細胞分化減少。ALP、Runx2、OPG、RANKL減少，NO、iNOS、RANKL/OPG比率及p-ERK1/2的增加，但是在富氫培養(yǎng)基(hydrogen rich medium，HRM)孵育之后上述情況逆轉。結果表明模擬微重力能夠誘導骨組織中的氧化應激并抑制成骨分化，與HRM孵育有效地消除了暴露于微重力引起的過量ROS[26]。姜黃素是從姜黃的根莖中分離的天然酚類產(chǎn)物。它已被廣泛用于東方人群，用于治療許多疾病。在模擬微重力下孵育姜黃素與MC3T3-E1細胞可抑制ROS形成，降低RANKL/OPG比率，提高ALP活性，增強VDRmRNA水平和上調VDR蛋白表達。用姜黃素治療可減輕微重力引起的骨質流失，可能通過減輕氧化應激和激活維生素D受體促進成骨分化[27]。抑瘤素M(oncostatin M，OSM)作為gp130細胞因子家族中的一員，研究表明OSM可促進成骨細胞的分化和活化，形成礦物質，抑制硬化蛋白的表達。Goyden等[28]通過旋轉細胞培養(yǎng)系統(tǒng)(rotary cell culture system，RCCS)模擬微重力，培養(yǎng)的MC3T3-E1前成骨細胞中IL-6的分泌增加，RANKL水平升高且OPG的表達降低，RANKL/OPG比率增加。經(jīng)OSM處理后IL-6的分泌增加并抵消了微重力對RANKL/OPG比率的影響。結果表明，OSM的作用可能有助于空間飛行期間骨形成和骨吸收的解偶聯(lián)。Yang等[29]研究表明微重力暴露增強了MC3T3-E1細胞中IL-6 mRNA的表達和NF-B配體受體激活劑的蛋白質水平，降低了ALP、OPG、OPN mRNA及Runx2 mRNA表達，顯著抑制細胞內(nèi)源性H2S的形成并下調CSE(胱硫醚裂解酶)mRNA表達，但對胱硫醚合成酶(cystatohininesynthetase，CBS)mRNA表達沒有顯著影響。經(jīng)過GYY4137(硫化氫水溶性供體)處理后上述情況得到逆轉。結果證實在模擬微重力下H2S供體促進成骨細胞分化。

長鏈非編碼RNAODSM是一種成骨細胞分化相關的lncRNA。Wang等的實驗證明LncRNA ODSM和miR-139-3p相互作用并相互抑制，過表達LncRNA ODSM顯著地增加了成骨基因Runx2、BGLAP、COL1A1、ALP的mRNA及ELK1蛋白水平，而敲低lncRNA ODSM顯著地降低這些基因及蛋白的表達。另外，用pEX-ODSM和miR-139-3p類似物或其陰性對照轉染MC3T3-E1細胞12 h，然后在模擬微重力環(huán)境中培養(yǎng)48 h，蛋白質印跡分析顯示，miR-139-3p的過表達部分逆轉了lncRNA ODSM誘導的ELK1水平。研究結果表明lncRNA ODSM抑制miR-139-3p表達并增強成骨細胞分化[11]。Hammer等[30]應用磁懸浮模擬微重力環(huán)境培養(yǎng)MC3T3-E1細胞1周，通過微陣列方法檢測基因在0 g和1 g下的表達，發(fā)現(xiàn)許多基因的調節(jié)同樣受到0 g和1 g的影響，包括1 425個上調基因和101個下調基因；而在0 g下生長的細胞表現(xiàn)出相對于1 g條件上調的2 270個基因及135個下調的基因。然而，該信息并未定義受重力應激源影響的基因的功能。Di等[31]應用超導磁體模擬微重力，選取10種常用的管家基因，設計引物并分離出RNA，進行逆轉錄和RT-PCR后統(tǒng)計分析，在對照組與微重力組對比下，MC3T3-E1細胞中三個最穩(wěn)定的基因是18S rRNA、TUB和RPL13A。實驗結果表明，許多管家基因并不總是在各種實驗條件下表達恒定，確定了在強磁場或微重力環(huán)境下穩(wěn)定表達的適當參考基因，它可以作為迄今為止用于重力生物學和磁性生物學研究常用的管家基因的替代選擇。Hu等[32]將MC3T3-E1前成骨細胞在模擬微重力下培養(yǎng)，細胞中Runx2、Osx的基因表達和ALP的蛋白活性顯著降低。結果表明，微重力可以抑制MC3T3-E1細胞的成骨分化過程。使用高通量微陣列分析篩選MC3T3-E1細胞中差異表達的lncRNA和mRNA，觀察到1 481個ncRNA的表達水平顯著改變，篩選出長度超過200個核苷酸的857個lncRNA，包括168個上調lncRNA和689個下調lncRNA。2 264個mRNA被證明是差異表達的，包括459個上調的mRNA和1 805個下調的mRNA。研究結果表明lncRNAs是研究微重力在成骨細胞功能中的作用和機制的新型而有效的候選者。

3 展 望

作為空間飛行環(huán)境中航天員嚴重的生理變化之一，骨質流失引起越來越多的關注。太空飛行的成本過高，通過地面模擬微重力來研究微重力對骨丟失的影響，這也使得實驗結果與現(xiàn)實結果存在一定的偏差。實驗證明MC3T3-E1前成骨細胞在模擬微重力下增殖與分化受到了抑制，并且多個因素影響了這一復雜的過程。近年來地面模擬研究取得了一定的進展，但是其具體的機制尚不統(tǒng)一。因此，進一步的實驗和對微重力下骨形成影響機制的明確研究可為航空航天條件下骨丟失的預防和治療提供理論依據(jù)。