蒲公英甾醇對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡及TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響

萬(wàn)海山 代偉宏 黃澤曉 吳開(kāi)弟 曹?chē)?guó)良 何和與

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)以滑膜增生、炎性關(guān)節(jié)、軟骨和骨骼破壞為特征，是一種慢性炎性、全身性自身免疫疾病[1,2]。RA的病理機(jī)制是多方面的，涉及T細(xì)胞、B細(xì)胞、成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLS)以及許多促炎性細(xì)胞因子的復(fù)雜相互作用。因此，揭示影響免疫調(diào)節(jié)和炎癥消退的途徑是更好地了解RA的病理生理學(xué)和設(shè)計(jì)治療這種嚴(yán)重關(guān)節(jié)疾病的新方法的主要關(guān)注點(diǎn)[3]。RA會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和破壞,導(dǎo)致人們失去工作能力，甚至導(dǎo)致死亡[4]。盡管現(xiàn)有療法有一定效果，但部分RA患者對(duì)當(dāng)前療法仍無(wú)有效反應(yīng)，而且治療可能會(huì)引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)[5]。因此，有必要尋找治療RA的新策略。

蒲公英是多年生草本植物，用于治療急性結(jié)膜炎、皮膚潰瘍和其他炎性疾病[6]。蒲公英甾醇是一種從蒲公英中提取的活性化合物，其分子結(jié)構(gòu)類似于類固醇激素，并且已被證明在體內(nèi)和體外均具有抗炎作用[7]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英甾醇在乳腺炎、胃炎等疾病中已有研究[8，9]。但是，目前關(guān)于蒲公英甾醇在RA中的研究報(bào)道很少。眾所周知，TLR4/NF-κB通路在炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)中起著重要作用[6]。此外，TLR4可以激活關(guān)鍵的炎性介質(zhì)NF-κB來(lái)調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)[7]。TLR4/NF-κB在RA中已有研究，但是蒲公英甾醇對(duì)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的研究甚少。

本實(shí)驗(yàn)研究蒲公英甾醇對(duì)體外培養(yǎng)的人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維滑膜細(xì)胞(MH7A細(xì)胞)增殖、遷移和凋亡及TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，為未來(lái)蒲公英甾醇在臨床上治療RA提供新的理論依據(jù)。

材料與方法

1.細(xì)胞：人RA成纖維滑膜細(xì)胞系MH7A購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

2.試劑：RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司。蒲公英甾醇(HPLC≥98%)購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司。LPS購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(5-Ethynyl-2′-deoxyuridine, EDU)試劑盒和Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自瑞士Roche公司。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Promega公司。RIPA裂解液和BCA試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。兔抗p-TLR4抗體、兔抗TLR4抗體、兔抗p-NF-κB p65抗體、兔抗NF-κB p65抗體、兔抗β-actin抗體和山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

3.細(xì)胞培養(yǎng)：MH7A細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，2天更換1次培養(yǎng)基，以保證細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)成分。傳代3次后可以進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

4.CCK-8法檢測(cè)蒲公英甾醇毒性：MH7A細(xì)胞以3×103個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，每孔100μl。根據(jù)蒲公英甾醇不同濃度將實(shí)驗(yàn)分為0μg/ml蒲公英甾醇組[Tar(0)組]、5μg/ml蒲公英甾醇組[Tar(5)組]、10μg/ml蒲公英甾醇組[Tar(10)組]、15μg/ml蒲公英甾醇組[Tar(15)組]、20μg/ml蒲公英甾醇組[Tar(20)組]和25μg/ml蒲公英甾醇組[Tar(25)組]，每組3個(gè)復(fù)孔，置于37℃、5% CO2條件下孵育24h。將10μl CCK-8試劑加到每個(gè)孔中。2h后使用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)量每孔細(xì)胞的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞活力。

5.細(xì)胞分組及培養(yǎng)：MH7A細(xì)胞以3×103個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，每孔100μl。細(xì)胞分為對(duì)照組(control組)、LPS組(1mg/ml)、LPS+蒲公英甾醇處理組(蒲公英甾醇質(zhì)量濃度為5、10和15μg/ml)，每組3個(gè)復(fù)孔。用藥組相應(yīng)劑量的蒲公英甾醇預(yù)處理24h后，再加入LPS，置于37℃、5% CO2條件下孵育24h。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

6.ELISA法檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集各組細(xì)胞上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)定各孔的吸光度(A)值，根據(jù)A值所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線查出上清液中TNF-α和IL-6的表達(dá)水平。

7.EDU檢測(cè)：MH7A按照1×105個(gè)/孔接種在6孔板中，按材料與方法3進(jìn)行處理并置于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每孔加入100μl含50μmol/L EDU溶液的RPMI1640完全培養(yǎng)基孵育2h。之后各組細(xì)胞在4%多聚甲醛中固定30min，將各組細(xì)胞與2mg/ml甘氨酸孵育10min。接下來(lái)，將細(xì)胞用PBS沖洗，然后使用500μl 0.5% Triton-X透化10min，然后在黑暗中與Apollo染色液孵育30min。最后，將細(xì)胞與Hoechst 33342孵育30min，并用0.5% Triton-X沖洗兩次。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照。

8.Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：收集各組處理48h細(xì)胞，胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為1×106個(gè)/毫升。將Transwell小室加入細(xì)胞懸液100μl，下室加入含10% FBS的完全培養(yǎng)基500μl。然后將Transwell小室置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育8h。取出聚碳酸酯微孔膜, 用棉簽輕輕擦去基底膠和上表面的細(xì)胞，然后中性甲醛固定，蘇木精染色。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)錄穿膜細(xì)胞數(shù)。以穿膜細(xì)胞數(shù)代表細(xì)胞遷移能力。

9.細(xì)胞流式術(shù)：在各組細(xì)胞處理48h后，將細(xì)胞用冰PBS沖洗1次，并在加入5μl Annexin Ⅴ-FITC和10μl PI之后再用300μl結(jié)合緩沖液重懸將細(xì)胞在在避光的室溫下孵育10min。進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)以檢測(cè)細(xì)胞凋亡，并使用CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。

10.Western blot法：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，棄去細(xì)胞上清液，PBS沖洗2次。加入1ml制備好的RIPA裂解液提取蛋白，用BCA法測(cè)定總蛋白含量。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶封閉1h后，將PVDF膜與以下抗體在4℃孵育過(guò)夜：兔抗p-TLR4抗體(1∶1000)、兔抗TLR4抗體(1∶1000)，兔抗p-NF-κB p65抗體(1∶1000)、兔抗NF-κB p65抗體(1∶1000)、兔抗β-actin抗體(1∶2000)。隨后，將PVDF膜用TBST洗滌3次，持續(xù)5min，并與山羊抗兔IgG-HRP(1∶5000)孵育1h，用TBST洗滌3次，持續(xù)5min。最后顯影曝光，用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

結(jié) 果

1.蒲公英甾醇濃度的篩選：CCK-8結(jié)果表明，用不同濃度的蒲公英甾醇(0、5、10、15、20和25μg/ml)培養(yǎng)MH7A細(xì)胞24h時(shí)，0～15μg/ml時(shí)，MH7A細(xì)胞的細(xì)胞活力不受蒲公英甾醇處理的影響，但當(dāng)蒲公英甾醇濃度在20和25μg/ml時(shí)，MH7A細(xì)胞的細(xì)胞活力受到影響(P=0.000)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇蒲公英甾醇的濃度為5、10和15μg/ml(圖1)。

圖1 不同濃度蒲公英甾醇對(duì)MH7A細(xì)胞活力的影響與Tar(0)組比較，*P=0.000

2.蒲公英甾醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞形態(tài)的影響：MH7A細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，細(xì)胞增殖率增加，細(xì)胞密度增加，細(xì)胞排列緊密；與LPS組比較，不同濃度的蒲公英甾醇使MH7A細(xì)胞的增殖率降低，細(xì)胞密度減小(圖2)。

圖2 不同濃度蒲公英甾醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞形態(tài)的影響(EDU,×100)

3.蒲公英甾醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞炎性介質(zhì)分泌的影響：ELISA法檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，LPS組MH7A細(xì)胞上清中TNF-α和IL-6的含量顯著增加(P均=0.000)，造模成功；與LPS組比較，不同濃度的蒲公英甾醇均能使MH7A細(xì)胞上清中TNF-α和IL-6的含量降低(P<0.05，圖3)。

圖3 蒲公英甾醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞中TNF-α、IL-6分泌的影響與對(duì)照組比較，*P=0.000；與LPS組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P=0.000

4.蒲公英甾醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞增殖能力的影響：EDU結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，LPS組MH7A細(xì)胞中EDU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比例顯著增加(P=0.000)；與LPS組比較，不同濃度的蒲公英甾醇使MH7A細(xì)胞中EDU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比例減少(P均<0.05，圖4)。

圖4 蒲公英甾醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞增殖能力的影響(EDU,×200)與對(duì)照組比較，*P=0.000；與LPS組比較，#P<0.05，##P<0.01

5.蒲公英甾醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞遷移能力的影響：Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，LPS組MH7A細(xì)胞的遷移數(shù)目顯著增加(P=0.000)；與LPS組比較，不同濃度的蒲公英甾醇使MH7A細(xì)胞的遷移數(shù)目減少(P均<0.05，圖5)。

圖5 蒲公英甾醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞遷移數(shù)目的影響(蘇木精染色，×200)與對(duì)照組比較，*P=0.000；與LPS組比較，#P<0.01，##P=0.000

6.蒲公英甾醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞凋亡的影響：流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，LPS組MH7A細(xì)胞的凋亡率顯著減少(P=0.000)；與LPS組比較，不同濃度的蒲公英甾醇使MH7A細(xì)胞的凋亡率增加(P均<0.05，圖6)。

圖6 蒲公英甾醇對(duì)LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組比較，*P=0.000；與LPS組比較，#P<0.01，##P=0.000

7.蒲公英甾醇抑制TLR4/NF-κB通路：Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，LPS組MH7A細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)顯著增加(P=0.000)，NF-κB p65的磷酸化程度也顯著增加(P=0.000)；與LPS組比較，不同濃度的蒲公英甾醇使MH7A細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)下降(P均<0.05)，NF-κB p65的磷酸化程度也降低(P均<0.05，圖7)。

圖7 蒲公英甾醇抑制TLR4/NF-κB通路與對(duì)照組比較，*P=0.000；與LPS組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P=0.000

討 論

RA是最常見(jiàn)的慢性炎性關(guān)節(jié)疾病，全世界的發(fā)生率是0.5%～1.0%，其特征主要是關(guān)節(jié)滑膜炎癥。反復(fù)滑膜炎可引起關(guān)節(jié)疼痛，關(guān)節(jié)強(qiáng)迫、僵硬和腫脹，疾病進(jìn)展可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨和骨骼的破壞，此外，它可能會(huì)逐漸引起關(guān)節(jié)畸形和功能障礙[12]。FLS是滑膜的重要組成部分，在RA的病理過(guò)程中起主要作用。RA的主要病理特征之一是FLS異常增生，表現(xiàn)為滑膜組織增生[13]。在RA中觀察到FLS的凋亡不足和異常增殖，并且FLS的過(guò)量促進(jìn)RA的各種病理過(guò)程[14]。因此，促進(jìn)FLS的凋亡和抑制增殖是圍繞RA治療的當(dāng)前研究的主要焦點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維滑膜細(xì)胞MH7A細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，細(xì)胞上清液中的炎性因子(TNF-α和IL-6)分泌增加，細(xì)胞異常增生，其增殖能力、遷移能力顯著增強(qiáng)，凋亡率顯著下降，與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致[15]。

Toll樣受體是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分[15]。TLR4能夠通過(guò)MyD88依賴性途徑促進(jìn)干擾素-β的表達(dá)并激活NF-κB。在缺血和缺氧等條件下，TLR4被激活，進(jìn)一步提高了NF-κB的磷酸化程度并激活了TLR4/NF-κB途徑，從而增加了炎性因子的含量[16]。NF-κB是炎性反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其可以在應(yīng)激環(huán)境中被激活[17]。NF-κB主要通過(guò)動(dòng)態(tài)核DNA /蛋白質(zhì)結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能。各種炎性因子，例如TNF家族成員都是NF-κB依賴性基因。因此，抑制NF-κB可以有效地阻斷炎癥途徑。研究發(fā)現(xiàn)，羥氯喹通過(guò)NF-κB信號(hào)通路抑制TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞IL-6分泌和mRNA表達(dá)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，MH7A細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，TLR4蛋白表達(dá)顯著增加，NF-κB p65的磷酸化程度也顯著增加，與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致[19]。

蒲公英甾醇為蒲公英的主要有效成分，具有清除自由基、消炎、防腐、抗氧化、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化和保肝作用。蒲公英甾醇對(duì)乳腺炎具有發(fā)揮抗炎的作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，蒲公英甾醇使LPS誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞上清中分泌的炎性因子表達(dá)量減少，細(xì)胞的增殖能力、遷移能力降低，凋亡率提高，TLR4蛋白表達(dá)下降，NF-κB p65的磷酸化程度也下降。

綜上所述，蒲公英甾醇通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制了RA的發(fā)生、發(fā)展，從而抑制了MH7A細(xì)胞的增殖、遷移，促進(jìn)其凋亡。因此，蒲公英甾醇可能對(duì)RA的發(fā)生、發(fā)展有抑制作用，尚需開(kāi)展進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和臨床研究予以證實(shí)。